華南虎疑似感染貓細(xì)小病毒的PCR鑒定與病理組織學(xué)檢查

黃翠琴，范克偉，余 佳，傅文源，林開雄，楊守深，林青青，楊小燕

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，龍巖 364012；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州 350001；4.福建梅花山華南虎繁育研究所，龍巖 364201）

華南虎疑似感染貓細(xì)小病毒的PCR鑒定與病理組織學(xué)檢查

黃翠琴1,2，范克偉1,2，余 佳1,3，傅文源3，林開雄3，楊守深1,2，林青青1，楊小燕1,2

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012；2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心，龍巖 364012；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福州 350001；4.福建梅花山華南虎繁育研究所，龍巖 364201）

對1例疑似感染貓細(xì)小病毒的死亡華南虎幼虎進行病理剖檢、病原PCR檢測和病理組織切片觀察。結(jié)果表明，死亡幼虎的腸道組織中能檢測出貓細(xì)小病毒核酸；病理組織切片鏡檢結(jié)果顯示，死亡幼虎胃、腸粘膜出血，大量粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，嚴(yán)重部位粘膜層基本消失，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織也均有較為嚴(yán)重的病理損傷。以上結(jié)果提示，該死亡幼虎感染了貓細(xì)小病毒，且該病毒對幼虎多種主要器官造成了嚴(yán)重的損傷。

華南虎；貓細(xì)小病毒；PCR；病理組織學(xué)

隨著我國瀕危虎群繁殖保護工作的開展，虎只數(shù)量明顯增加，但疫源疫病對野生動物的危害也在不斷增大。近年來國內(nèi)先后出現(xiàn)了禽流感和犬瘟熱病毒對虎的跨種致死性感染，以及虎貓溫?zé)?、貓鼻氣管炎、貓鼻結(jié)膜炎、巴氏桿菌病、弓形蟲病和錐蟲病等疫病的發(fā)生，嚴(yán)重威脅到了虎的健康甚至種群保護[1-9]。華南虎亦稱“中國虎”，國家一級保護珍稀瀕危動物，是中國特有和歷史最悠久的虎種。近年來我國不斷有圈養(yǎng)華南虎感染疫病的報道[1,7,10]，表明疫病已成為我國瀕危華南虎群繁殖保護工作的重要制約因素之一。

貓細(xì)小病毒（Feline parvovirus virus，F(xiàn)PV）又稱為貓泛白細(xì)胞減少癥病毒、貓瘟病毒和貓傳染性腸炎病毒。在自然條件下除可感染貓科動物外，還可感染浣熊、水貂和狐貍等多種動物，其中以幼齡動物最為易感，感染動物在臨床上主要呈現(xiàn)以高熱、嘔吐、腸炎和白細(xì)胞嚴(yán)重減少為特征的臨床癥狀[4,8]。

福建梅花山華南虎繁育研究所發(fā)生1例疑似華南虎幼虎感染貓細(xì)小病毒急性死亡的病例，為進一步調(diào)查造成該幼虎急性死亡的原因，本文針對該病例進行了病理剖檢、病原PCR檢測和病理組織切片觀察，并對其死亡原因進行了分析討論，以期為我國圈養(yǎng)華南虎疫病防控與診療提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例來源及背景

送檢的1例75日齡急性死亡的華南虎幼虎，該小虎死亡前1 d，表現(xiàn)精神沉郁、不愛走動、嗜睡、拉黑色軟便。

1.2 病理剖檢

剖檢前觀察被毛光澤度、精眼瞼、鼻孔等有無分泌物及其他異常情況。然后進行剖檢，依次觀察心、肝、脾、肺、腎及淋巴結(jié)等組織器官的病變情況，打開顱腔觀察腦組織病變情況，拍照保存并做好相關(guān)記錄。病料采集時注意無菌操作，全部組織樣品均分為2份，1份置于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟切片，用于HE染色光鏡觀察組織病理學(xué)變化；1份置于-20℃冰箱保存。

1.3 病原檢測

福建梅花山華南虎繁育研究所

1.3.1 主要試劑 DL500 DNA Marker、LATaqDNA聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、Universal Genomic DNA Extraction Kit、pMD18-T克隆載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)病理剖檢觀察，對疑似病例進行貓細(xì)小病毒（F P V）、犬瘟熱（CDV）、貓皰疹病毒I型(FHV-1)以及貓杯狀病毒（FCV）等病原PCR檢測，根據(jù)GenBank中登錄的FPV全基因組序列（KX685354.1），CDV全基因組序列（MF041963.1），F(xiàn)HV-1全基因組序列（KR381803.1）和FCV全基因組序列（KJ495730.1）分別設(shè)計合成鑒定引物，F(xiàn)PV-JD-F：5'-GGTGGAAATCACAG CAAACTCA-3'，F(xiàn)PV-JD-R：5'-TTAAACCAAAC T C C C C A A G C A-3'； C D V-J D 2 4 0-F：5'-GAAATCAACGGACCTAAAT-3'，CDVJD240-R：5'-TCCTTGAGCTTTCGACCCTT-3'；FHV-JD288-F：GACGTGGTGAATTATCAG，F(xiàn)HV-JD288-R：CAACTAGATTTCCACCAGG；FCV-JD926-F：AACCTGCGCTAACGTGCTT，F(xiàn)CV-JD926-R：CAGTGACAATACACCCAGAA，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.3 PCR擴增與測序 根據(jù)TaKaRa公司Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒和Trizol說明書提取組織DNA和RNA，利用上述鑒定引物擴增FPV VP2基因片段。PCR體系（25 μL）：DNA模板1 μL、2×GC Buffer I 12.5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物各1 μL、LATaq酶0.25 μL，用ddH2O補至 25 μL。 PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。RNA模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后按上述步驟進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將陽性PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測序，序列與GenBank中FPV序列進行比對分析。

1.4 病理組織學(xué)檢查

集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織，用10%中性福爾馬林固定，按常規(guī)方法，依次進行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和烤片，經(jīng)

對死亡幼虎進行病理解剖，采H.E染色和加拿大樹膠封片，在顯微鏡下觀察病理組織變化。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢結(jié)果

死亡幼虎表現(xiàn)極度消瘦，被毛粗亂、眼瞼、鼻孔處未見明顯分泌物，后肢及肛門周圍被黑色排泄物污染（圖1A）。死亡幼虎的病理剖檢結(jié)果：幼虎血液較為稀?。徊∽冎饕性谙?，從胃開始整個消化道內(nèi)有大量的焦油樣的黑色內(nèi)容物，進一步觀察發(fā)現(xiàn)胃粘膜表面有許多大小不一的潰瘍灶，小腸各段腸粘膜脫落，并伴有嚴(yán)重的充血及出血現(xiàn)象（圖1I～M）；大腸至肛門各段腸粘膜也呈現(xiàn)出明顯的充血、出血及脫落現(xiàn)象（圖1N）；腦膜充血（圖1F）；胰臟出血（圖1H）；心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及氣管均未見明顯的病理變化（圖1B～E, G）。

圖1 死亡幼虎病理剖檢結(jié)果Fig.1 The autopsy lesions of the dead tiger cub

2.2 病原檢測

FPV引物在200 bp左右擴增出1條特異條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖2），其他引物未擴增出特異條帶，表明死亡幼虎的腸道組織中FPV核酸，初步確定此虎感染FPV。將該PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司測

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，序，結(jié)果顯示該序列與GenBank中登錄的FPV HNZZ1株（GenBank登錄號：KX685354.1）全基因組2801～2992位堿基序列相似度為100%（圖3）。由此表明，F(xiàn)PV感染有可能是導(dǎo)致該幼虎發(fā)病死亡的主要因素。

圖2 感染幼虎的FPV 基因片段PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR Amplification of FPV gene fragment from intestinal tissue of the dead tiger cub

圖3 感染幼虎FPV部分基因（FDV-Tiger）與參考基因序列（FPV HN-221株）比較Fig.3 Comparison of nucleotide sequences between FPV gene fragment from the dead tiger cub and reference strains

2.3 病理組織學(xué)檢查

病理切片鏡檢結(jié)果顯示，死亡幼虎心臟組織中部分的心肌纖維發(fā)生斷裂，心肌毛細(xì)血管擴張、充血（圖4A）；肝臟組織中肝竇內(nèi)有大量紅細(xì)胞，有部分肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性，部分細(xì)胞呈淡染、胞核溶解，成局部壞死灶（圖4B）；脾臟組織疏松，并伴有淤血現(xiàn)象，脾竇內(nèi)有大量紅細(xì)胞，脾小體內(nèi)淋巴細(xì)胞發(fā)生溶解，呈空泡化（圖4C）；肺臟組織以出血為主要的病理變化，表現(xiàn)為肺泡壁增厚，肺泡內(nèi)部充滿了大量的紅細(xì)胞；部分的間質(zhì)增寬，有炎性細(xì)胞浸潤，從而使肺泡發(fā)生不規(guī)則變形（圖4D）；腎臟組織中可見大量腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死脫落，使部分腎小管僅剩下基底膜。在腎小管間有大量胞核深染為藍(lán)色的炎性細(xì)胞，部分腎小管官腔內(nèi)及小管間有大量紅細(xì)胞浸潤。大量腎小球分裂并伴有出血現(xiàn)象，部分腎小球萎縮甚至消失（圖4E、F）；腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管充血，部分神經(jīng)元發(fā)生了核溶解現(xiàn)象，形成鏡下可見的空泡化。同時可見個別神經(jīng)元因小膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)繞而形成衛(wèi)星現(xiàn)象即小膠質(zhì)細(xì)胞噬神經(jīng)元現(xiàn)象（圖4G）；胰臟組織中以出血為主要的病理變化，在胰臟毛細(xì)血管內(nèi)及腺泡間充滿大量的紅細(xì)胞（圖4H）；食管各部分組織結(jié)構(gòu)完整，未觀察到明顯的病理變化（圖4I）；胃病理切片在鏡下可見胃粘膜出血，大量胃粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，嚴(yán)重部位粘膜層基本消失。粘膜固有層及粘膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤（圖4J）；腸道病理切片觀察可見小腸及大腸各段均以出血、腸絨毛大量壞死、脫落，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤為主的病理變化，其中，以十二指腸段及直腸段病變較為嚴(yán)重，十二指腸絨毛間可見大量的紅細(xì)胞；直腸粘膜嚴(yán)重變性，粘膜上皮細(xì)胞大量壞死脫落，并伴有出血現(xiàn)象（圖4K、L）。病理切片鏡檢結(jié)果進一步說明，該幼虎可能因感染FPV而導(dǎo)致各種主要器官嚴(yán)重的病料損傷。

3 討論

華南虎亦稱“中國虎”，國家一級保護珍稀瀕危動物，是中國特有的虎亞種。目前華南虎種群的近交系數(shù)高、群體小，而且對華南虎現(xiàn)在流行的病毒性傳染病沒有流行病學(xué)的系統(tǒng)調(diào)查[11]。近年來我國不斷有圈養(yǎng)華南虎感染疫病的報道，表明疫病已威脅到我國華南虎群的繁殖保護工作[1,7,11]。

本研究通過對死亡華南虎幼虎的病史調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病例病程較急，幼虎死亡前精神沉郁、拉黑色稀糞；病理剖檢發(fā)現(xiàn)死亡幼虎極度消瘦、被毛粗亂、有脫水現(xiàn)象，從胃開始整個消化道內(nèi)有大量的焦油樣的黑色內(nèi)容物，進一步觀察發(fā)現(xiàn)胃粘膜表面有許多大小不一的潰瘍灶，小腸各段腸粘膜脫落，并伴有嚴(yán)重的充血及出血現(xiàn)象。綜上初步判斷，消化道出血及腹瀉造成機體嚴(yán)重脫水，并懷疑造成消化道嚴(yán)重?fù)p傷的原因可能是消化道病原感染。

圖4 死亡幼虎不同器官組織的病理切片結(jié)果Fig.4 The pathological section results of different organs in the dead tiger

貓細(xì)小病毒（Feline parvovirus virus，F(xiàn)PV）是典型的肉食獸細(xì)小病毒[12]。在自然條件下，該病毒能夠感染多種野生貓科動物，如獅子、老虎、豹以及水貂等[13]。感染FPV的標(biāo)志就是患病動物會發(fā)生腹瀉，這是因為小腸絨毛的減少導(dǎo)致了上皮細(xì)胞的丟失或完全喪失[14]。PCR方法是近年來檢測貓細(xì)小病毒常用的方法之一，與HA/HI、ELISA、病毒分離等方法比較，PCR技術(shù)更簡便、快速、敏感[15]。喬軍等[16]曾應(yīng)用PCR方法檢測了東北虎感染FPV，其敏感性遠(yuǎn)高于血凝試驗的敏感性。因此，本研究采用FPV特異性鑒定引物對死亡幼虎的腸道組織中的病原體進行了PCR檢測，結(jié)果在200 bp左右擴增出一條特異性條帶，與預(yù)期片段大小相符，對目的片段的測序結(jié)果證實死亡幼虎感染了FPV，這可能是導(dǎo)致其發(fā)病死亡的主要原因。同時，病理組織切片鏡檢結(jié)果顯示，死亡幼虎胃、腸粘膜出血，大量粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，嚴(yán)重部位粘膜層基本消失，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織也均有較為嚴(yán)重的病理損傷，說明FPV感染對幼虎多種主要器官造成了嚴(yán)重的損傷。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PV感染幼虎能引起嚴(yán)重的消化道癥狀，并造成消化道在內(nèi)的多個器官的嚴(yán)重病理損傷。今后，針對該病的防控過程中應(yīng)注意加強飼養(yǎng)管理，做好生物安全工作，定期進行環(huán)境清洗消毒；對于發(fā)病動物應(yīng)當(dāng)及時發(fā)現(xiàn)、及時治療，對癥治療的同時給予輔助藥物來改善患虎的食欲、增強抵抗力。

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A CASE OF FELINE PARVOVIRUS VIRUS INFECTION OF A SOUTH CHINA TIGER

HUANG Cui-qin1,2, FAN Ke-wei1,2, YU Jia1,3, FU Wen-yuan3, LIN Kai-xiong3, YANG Shou-shen1,2, LIN Qing-qing1, YANG Xiao-yan1,2
(1. College of Life Sciences, Longyan University, Longyan 364000, China; 2. Fujian Engineering Research Center for Swine Disease
Control and Prevention, Longyan 364012, China; 3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350001,China; 4. Fujian Meihuashan Institute of South China Tiger Breeding, Longyan 364201, China)

In order to diagnose an acute death of a cub suspected of Feline parvovirus virus (FPV) infection in Fujian Meihuashan Institute of South China Tiger Breeding, clinical samples were examined using necropsy, PCR and histopathology. The FPV VP2 gene was positive in intestinal tissues, and serious damages were observed in histopathologic slides of multiple organs. These results indicated that the tiger cub was infected with FPV.

South China tiger; Feline parvovirus virus; PCR; histopathology

2017-08-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31602048）；福建省科技廳自然科學(xué)基金面上項目（2016J01712）；龍巖學(xué)院產(chǎn)學(xué)研合作項目（LC2015010）；龍巖學(xué)院校級協(xié)同創(chuàng)新中心項目；國家林業(yè)局野生動物疫源疫病監(jiān)測和預(yù)警系統(tǒng)維護項目

黃翠琴，女，副教授，主要從事動物疫病的診斷研究

范克偉，E-mail：fankewei8399@163.com

S852.659.2

A

1674-6422（2017）06-0043-05