隱孢子蟲(chóng)三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的比較

宋 悅 ，趙 權(quán) ，黃 燕 ，米榮升 ，游艷敏 ，賈海燕 ，程 龍 ，張燁華 ，張曉麗，韓先干，陳兆國(guó)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

隱孢子蟲(chóng)三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的比較

宋 悅1,2，趙 權(quán)1，黃 燕2，米榮升2，游艷敏2，賈海燕2，程 龍2，張燁華2，張曉麗2，韓先干2，陳兆國(guó)2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

為篩選一種檢測(cè)譜廣、敏感性好、特異性高的隱孢子蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，對(duì)JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法三種隱孢子蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了檢測(cè)，并與基于18S rDNA序列的套式PCR方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，以10倍倍比稀釋的含有微小隱孢子蟲(chóng)18S rDNA基因片段的重組質(zhì)粒為模板，成功地建立了三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法；敏感性試驗(yàn)顯示，JVAP18S法和Csp18S法最低可檢測(cè)0.1個(gè)卵囊，而CRU18S法最低只能檢測(cè)到1個(gè)卵囊，但他們均比套式PCR方法敏感；特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR法均可檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium parvum）、泰澤隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium tyzzeri）和貝氏隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium baileyi），而其他屬寄生蟲(chóng)和細(xì)菌DNA的檢測(cè)結(jié)果均為陰性；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.69%～2.68%、0.11%～4.93%、0.04%～2.89%，批間變異系數(shù)分別為0.52%～5.75%、2.09%～5.13%、1.15%～3.71%；對(duì)50份小鼠田間糞便樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，JVAP18S法檢測(cè)的陽(yáng)性率為84.00%，顯著高于套式PCR法檢測(cè)的64.00%的陽(yáng)性率。上述結(jié)果表明，三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR法均能有效檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)，比較而言，JVAP18S法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，尤其適合于隱孢子蟲(chóng)含量較少的樣品檢測(cè)。

隱孢子蟲(chóng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；檢測(cè)；敏感性；特異性；重復(fù)性

隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidiumspp.）是引起人和畜禽腹瀉、胃腸炎的重要病原之一[1-4]，目前認(rèn)為有效的隱孢子蟲(chóng)有31種[5]。隱孢子蟲(chóng)極易通過(guò)水源性和食源性等途徑感染，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物健康。免疫功能正常的宿主，其引起的腹瀉多為自限性；而免疫功能受損的宿主，腹瀉多表現(xiàn)為嚴(yán)重的慢性感染，常常危及生命[6]。

隨著對(duì)人類和動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)病危害認(rèn)識(shí)的深入，對(duì)隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)也提出了新的要求[7]。傳統(tǒng)的隱孢子蟲(chóng)卵囊檢測(cè)方法，包括濃集法、改良抗酸染色法、金胺-酚染色法、免疫熒光染色法、PCR法、套式PCR法等，不僅敏感性低、特異性差，而且檢測(cè)步驟繁瑣，干擾因素多。酵母、飼料顆粒，甚至腸道內(nèi)容物等均能影響檢測(cè)效果[8-10]。尤為重要的是，上述方法很難進(jìn)行準(zhǔn)確定量。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）法，不僅操作簡(jiǎn)便、快速，特異性強(qiáng)而且敏感性極高[11]，適合進(jìn)行樣品中隱孢子蟲(chóng)的定量，尤其適用于低劑量感染的樣品檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外相繼報(bào)道了多種隱孢子蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[1,4,12-14]，但其實(shí)際檢測(cè)效果差異很大，多數(shù)方法僅能檢測(cè)一種或少數(shù)幾種人獸共患隱孢子蟲(chóng)種[12]。本研究旨在通過(guò)對(duì)近年來(lái)相對(duì)應(yīng)用較多，能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種檢測(cè)的三種實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法敏感性、特異性、重復(fù)性的比較，篩選一種敏感性高、特異性強(qiáng)、廣譜、適合實(shí)驗(yàn)室定量檢測(cè)的隱孢子蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，為開(kāi)展隱孢子蟲(chóng)定量檢測(cè)研究提供手段。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)株、菌株和DNA

微小隱孢子蟲(chóng)（Crypto-sporidium parvum）卵囊、泰澤隱孢子蟲(chóng)（C.tyzzeri）卵囊、貝氏隱孢子蟲(chóng)（C. baileyi）卵囊、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）卵囊、剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）速殖子、日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum）成蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)（Spirometra mansoni）成蟲(chóng)、禽致病大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi murium）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物源性病原生物學(xué)及食品安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存、提供。

1.2 主要試劑

Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒購(gòu)自MP公司；TaKaRa LATaqDNA 聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體、Premix ExTaq（Probe qPCR）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自Bay Gene Inc公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 微小隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA的提取

在2.5%重鉻酸鉀溶液中的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊進(jìn)行Sheather’s蔗糖密度梯度離心純化[15]，純化后的卵囊加少量雙蒸水混勻，再用飽和蔗糖溶液混勻，鏡檢計(jì)數(shù)。取109個(gè)卵囊/mL，按Fast DNA SPIN Kit for

將實(shí)驗(yàn)室保存Soil試劑盒說(shuō)明書(shū)提取卵囊基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微小隱孢子蟲(chóng)18S rDNA重組質(zhì)粒的制備

參照Xiao等[16]報(bào)道的序列合成引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。上游引物：5'-AACCTGGT TGATCCTGCCAGTAGTC-3'；下游引物：5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG-3'，以微小隱孢子蟲(chóng)DNA為模板。PCR擴(kuò)增18S rDNA基因全長(zhǎng)序列【又稱核糖體小亞基rDNA（small subunit rDNA, SSU rDNA）】，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入Trans1 T1感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落于LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜后，用第二輪引物進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。提取經(jīng)鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒，命名為pMDCpSSUrDNA，用NanoDrop（Thermo Scientific）測(cè)其濃度，按以下公式計(jì)算 1 μL質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=［重組質(zhì)粒濃度（g/μL）/重組質(zhì)粒摩爾質(zhì)量（4430 bp×660）］×6.023×1023；1 μL溶液中所含的卵囊數(shù)=1 μL質(zhì)粒中的拷貝數(shù)/4。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.5.1 JVAP18S法 取濃度為106copy/μL的重組質(zhì)粒pMD-CpSSUrDNA，依次進(jìn)行10倍倍比稀釋至100copy/μL。按文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，所用引物和探針序列見(jiàn)表1，由賽默飛世爾科技（上海）有限公司合成。每個(gè)稀釋度模板均重復(fù)3 次，根據(jù)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)到的臨界循環(huán)數(shù)（Ct 值）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 Csp18S法 與1.5.1類似，按文獻(xiàn)[12]方法對(duì)10倍倍比稀釋的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所用引物和探針序列見(jiàn)表1，由賽默飛世爾科技（上海）有限公司合成。

1.5.3 CRU18S法 與1.5.1類似，按文獻(xiàn)[14]對(duì)10倍倍比稀釋的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所用引物和探針序列見(jiàn)表1，由賽默飛世爾科技（上海）有限公司合成。

1.6 敏感性試驗(yàn)

取106個(gè)卵囊溶液，提取基因組DNA，然后進(jìn)行梯度10倍倍比稀釋至10-2，分別作為模板，進(jìn)行三種real-time PCR檢測(cè)。同時(shí)，采用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法[16,17]，進(jìn)行套式PCR檢測(cè)，觀察其敏感性。

1.7 特異性試驗(yàn)

取微小隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA、泰澤隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA、貝氏隱孢子蟲(chóng)卵囊DNA、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊DNA、剛地弓形蟲(chóng)速殖子DNA、日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)DNA、曼氏迭宮絳蟲(chóng)DNA、禽致病大腸桿菌DNA、鼠傷寒沙門氏菌DNA和金黃色葡萄球菌DNA，PCR擴(kuò)增方法同1.6，觀察其特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取濃度為107個(gè)/μL的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊溶液1 μL，以10倍倍比稀釋至101個(gè)/μL，每種濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，分別提取基因組DNA，進(jìn)行三種real-time PCR檢測(cè)，觀察批內(nèi)的重復(fù)性。在不同時(shí)間重復(fù)上述試驗(yàn)一次，觀察不同批次間的重復(fù)性。

1.9 JVAP18S法的田間初步應(yīng)用

從田間收集小鼠糞便樣品，利用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取DNA，進(jìn)行JVAP18S法real-time PCR和套式PCR檢測(cè)[16,17]，每個(gè)樣品檢測(cè)3次，并按祖立闖等[18]報(bào)道的方法計(jì)算其陰陽(yáng)性符合率。

2 結(jié)果

2.1 微小隱孢子蟲(chóng)18S rDNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用兩對(duì)引物對(duì)微小隱孢子蟲(chóng)卵囊基因組DNA進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，結(jié)果成功地?cái)U(kuò)增出了大小約為1740 bp的基因片段（圖1）。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-CpSSUrDNA，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，插入序列與GenBank登錄的C. parvumAUCP-1分離株18S rRNA基因（GenBank登錄號(hào)：L16996.1）序列同源性為100%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以濃度10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒pMD-CpSSUrDNA DNA為模板，用三種real-time PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，均成功獲得了擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），其R2值分別為0.997、0.994和0.999，ct值分別為36、36和34。

圖1 微小隱孢子蟲(chóng)18S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of C. parvum 18S rDNA sequence M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1: 陰性對(duì)照; 2: 18S rDNAM: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2: 18S rDNA

圖2 三種real-time PCR法對(duì)重組質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Amplification curves and standard curves of three real-time PCR methodsA: JVAP18S法; B: Csp18S法; C: CRU18S法A: JVAP18S method; B: Csp18S method; C: CRU18S method

2.3 敏感性試驗(yàn)

以106個(gè)卵囊10倍梯度稀釋溶液提取的DNA為模板，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，JVAP18S和Csp18S法最低均可檢測(cè)到0.1個(gè)卵囊，CRU18S法最低能檢測(cè)到1個(gè)卵囊，而套式PCR法最低只能檢測(cè)到100個(gè)卵囊（表2）。

表2 三種real-time PCR方法的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Sensibility test results

2.4 特異性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，三種real-time PCR法和套式PCR法均只能檢出三種隱孢子蟲(chóng)，不能檢出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌DNA（表3）。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果顯示，JVAP18S、Csp18S和CRU18S三種real-time PCR方法的批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.69%～2.68%、0.11%～4.93%、0.04%～2.89%，均不超過(guò)5.00%；批間變異系數(shù)分別為0.52%～5.75%、2.09%～5.13%、1.15%～3.71%，均不超過(guò)10.00%（表4）。

2.6 田間樣品初步應(yīng)用

對(duì)收集的50份田間小鼠糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，套式PCR檢測(cè)的陽(yáng)性樣品32份，陽(yáng)性率64.00%；而JVAP18S法檢測(cè)的陽(yáng)性樣品為42份，陽(yáng)性率84.00%，經(jīng)Pearson卡方（χ2）檢驗(yàn)，兩者差異具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.20，P＜0.05）。兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率100%，陰性符合率44.44%，陰陽(yáng)性符合率為80.00%（表5）。

表3 特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 specific test results

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability test results

表5 田間樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Field samples test result

3 討論

Real-time PCR檢測(cè)方法以其高敏感性、高特異性、可定量，以及高效、便捷的特點(diǎn)，在病原定性和定量檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[12]。然而，具體到特定一種方法，其特異性、適用范圍等，受設(shè)計(jì)的引物、探針的影響非常大，尤其當(dāng)選擇相對(duì)保守的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，其結(jié)果差異甚大。例如，不同生物體間，核糖體小亞基的功能基本一致，主要負(fù)責(zé)與mRNA和大亞基的結(jié)合，其編碼基因rDNA序列相對(duì)保守，尤其在一些近緣生物間，同源性較高，因此，選用該序列設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)，尤其需要注意。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的隱孢子蟲(chóng)定量PCR方法較多，但其檢測(cè)效果差異較大[1,4,12-14]，在具體工作中，選擇何種方法進(jìn)行檢測(cè)，常給研究者帶來(lái)困惑，尤其是剛剛從事相關(guān)領(lǐng)域研究的科技工作者和生產(chǎn)一線的工作人員。本文選擇了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相對(duì)應(yīng)用較多、檢測(cè)譜廣的三種real-time PCR檢測(cè)方法，對(duì)其敏感性、特異性、重復(fù)性、廣譜性進(jìn)行比較，觀察其檢測(cè)效果，為現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室定量研究提供基礎(chǔ)。

從敏感性來(lái)看，JVAP18S法和Csp18S法均能有效檢出0.1個(gè)隱孢子蟲(chóng)卵囊，與Jothikumar等[13]、Burnet等[12]研究結(jié)果相似。他們的研究顯示，JVAP18S法最低能檢出0.5個(gè)卵囊[13]；Csp18S法可有效檢出103～10-1個(gè)卵囊，對(duì)0.1個(gè)卵囊有33%的比例檢出[12]；CRU18S法最低只能檢出1個(gè)卵囊，與Hadfield等[14]研究結(jié)果相似。作者當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)反應(yīng)可以檢出2個(gè)卵囊，盡管其敏感性低于前2種方法，但它們都高于套式PCR法，說(shuō)明三種real-time PCR的敏感性均較高，尤其是JVAP18S法和Csp18S法。而套式PCR方法雖然應(yīng)用非常廣泛，但很容易受糞便樣品中PCR抑制物的影響，其敏感性相對(duì)較低。田間樣品的檢測(cè)結(jié)果也表明，JVAP18S法檢出了更多的陽(yáng)性樣品，50份樣品的陽(yáng)性率達(dá)84.00%，顯著高于套式PCR法的64.00%，提示前者的敏感性顯著高于后者。

從特異性和廣譜性來(lái)看，三種real-time PCR方法均能檢出泰澤隱孢子蟲(chóng)、微小隱孢子蟲(chóng)和貝氏隱孢子蟲(chóng)，說(shuō)明其廣譜性較好。

這個(gè)結(jié)果與Jothikumar等[13]、Burnet等[12]研究結(jié)果相似，他們分別發(fā)現(xiàn)JVAP18S法能檢出10種、Csp18S法能檢出11種隱孢子蟲(chóng)，但Burnet等[12]當(dāng)時(shí)未檢測(cè)貝氏隱孢子蟲(chóng)和泰澤隱孢子蟲(chóng)，Jothikumar等[13]、Hadfield等[14]未檢測(cè)泰澤隱孢子蟲(chóng)，本研究也證明這些方法可以有效檢測(cè)。同時(shí)，這三種方法均不能檢出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、剛地弓形蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌DNA，此結(jié)果與Jothikumar等[13]、Hadfield等[14]、Burnet等[12]研究結(jié)果一致，說(shuō)明其均有較好的特異性。由于隱孢子蟲(chóng)病的最常用的檢測(cè)樣品是糞便，其中不可避免的會(huì)含有一些病原微生物，如大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。此外，也常常包含一些腸道寄生蟲(chóng)，或在腸道含有特定階段蟲(chóng)體的寄生蟲(chóng)，如球蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)。所以在特異性檢測(cè)中，本試驗(yàn)對(duì)這些寄生蟲(chóng)樣品DNA也進(jìn)行了檢測(cè)。

從重復(fù)性來(lái)看，三種real-time PCR方法的批內(nèi)變異系數(shù)均不超過(guò)5.00%，批間變異系數(shù)均不超過(guò)10.00%，提示它們的重復(fù)性良好，尤其是JVAP18S和CRU18S 這兩種方法其批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.69%～2.68%和0.04%～2.89%，批間變異系數(shù)為0.52%～5.75%和1.15%～3.71%，比Csp18S法更加優(yōu)秀。

此外，三種real-time PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（Slope）和方差相關(guān)系數(shù)（Square correlation coefficients）分別為-3.10～-3.24和0.994～0.999，此結(jié)果與Jothikumar等[12]、Burnet等[13]研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)JVAP18S、Csp18S法的斜率和相關(guān)系數(shù)分別為-3.493與0.9992、-3.33與0.999，提示該三種方法對(duì)不同濃度樣品檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)強(qiáng)度均很強(qiáng)，屬較好的real-time PCR方法。

對(duì)田間小鼠糞便樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，JVAP18S法檢測(cè)獲得的陽(yáng)性率顯著高于套式PCR法法，提示前者檢測(cè)出了更多的陽(yáng)性樣品，其敏感性顯著高于后者，一部分含量較少的樣品，套式PCR無(wú)法檢出，而JVAP18S法能夠檢出，這也進(jìn)一步印證了敏感性試驗(yàn)的結(jié)果。

綜上所述，本研究對(duì)JVAP18S、Csp18S、CRU18S三種隱孢子蟲(chóng)real-time PCR方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其敏感性、特異性和重復(fù)性良好，均可用于田間或?qū)嶒?yàn)室糞便樣品中隱孢子蟲(chóng)卵囊的定量研究。比較而言，JVAP18S法和Csp18S法敏感性更高，JVAP18S法和CRU18S法的重復(fù)性更優(yōu)。田間樣品檢測(cè)結(jié)果也表明，與套式PCR方法相比，JVAP18S法敏感性更高，檢測(cè)出了更多的陽(yáng)性樣品，更適用于現(xiàn)場(chǎng)樣品中所含少量隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，為今后開(kāi)展隱孢子蟲(chóng)病的調(diào)查和防控研究提供了手段。

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COMPARISON OF THREE REAL-TIME PCR ASSAYS FOR CRYPTOSPORIDIUM

SONG Yue1,2, ZHAO Quan1, HUANG Yan2, MI Rong-sheng2, YOU Yan-min2, JIA Hai-yan2, CHENG Long2, ZHANG Ye-hua2, ZHANG Xiao-li2, HAN Xian-gan2, CHEN Zhao-guo2
(1.Animal Science and Technology College, Jilin Agricultural University, Changchun 130000, China; 2. Key Laboratory of Animal
Parasitology of Ministry of Agriculture, Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Animal Products on Biohazards (Shanghai) of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

In order to select a PCR assay for detection ofCryptosporidium, three real-time PCR assays (JVAP18S, Csp18S and CRU18S)were tested for their sensitivity, specificity and repeatability and also compared with nested PCR based onCryptosporidium18S rDNA.The results showed that the 3 real-time PCR assays were developed successfully with serial 10 fold diluted recombinant vector constructed withCryptosporidium parvum18S rDNA sequence. The sensitivity testing showed that JVAP18S and Csp18S methods detected as low as 0.1 oocysts while CRU18S method detected 1 oocyst. The specificity testing showed that the 3 real-time PCR assays recognizedC.parvum,C. tyzzeriandC. baileyibut did not detect DNAs ofEimeria tenella,Toxoplasma gondii,Schistosoma japonicum,Spirometra mansoni,Escherichia coli,Salmonella typhiandStaphylococcus aureus. The repeatability testing showed that the CV of intro-batch of JVAP18S, Csp18S and CRU18S methods were between 0.69%～2.68%, 0.11%～4.93% and 0.04%～2.89%, respectively, and the CV of inter-batch were between 0.52%～5.75%, 2.09%～5.13% and 1.15%～3.71%, respectively. The positive rate of 50 field mouse samples tested using JVAP18S method was 84.00%, which was higher (p＜0.05) than 64.00% with nested PCR assay. These results indicated that these 3 real-time PCR assays could be used for detection ofCryptosporidium. Compared with the other two methods, the JVAP18S method was more sensitive, specific, repeatable and suitable for detection of field samples especially when few parasites were present.

Cryptosporidium; real-time PCR; detection; sensibility; specificity; respeatability

S852.723

A

1674-6422（2017）06-0048-08

2017-04-06

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字（2015）第1-10號(hào)，（2005）第3-4號(hào)]；國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP201700703）；寧夏回族自治區(qū)科技支撐計(jì)劃[寧農(nóng)科（2016）1號(hào)]；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2016JB13）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助

宋悅，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

趙權(quán)，E-mail: zhaoquan0825@163.com；陳兆國(guó)，E-mail：zhaoguochen@shvri.ac.cn