國內(nèi)新型基因2型牛病毒性腹瀉病毒研究進展

張 倩，陶 潔,3，張 東，區(qū)炳明，林 航，楊 穎，張信軍，朱禮倩，王建業(yè)，賀生中，孟 婷，謝 靜，朱國強

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009；3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；4.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300）

·綜述·

國內(nèi)新型基因2型牛病毒性腹瀉病毒研究進展

張 倩1,2，陶 潔1,2,3，張 東1,2，區(qū)炳明1,2，林 航1,2，楊 穎1,2，張信軍1,2，朱禮倩1,2，王建業(yè)1,2，賀生中4，孟 婷4，謝 靜4，朱國強1,2

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009；3.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；4.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）有兩種基因型：基因1型（BVDV-1）和基因2型（BVDV-2）。以往的流行病學(xué)調(diào)查顯示BVDV-1的分布和流行區(qū)域更加廣泛，但近年來國內(nèi)BVDV-2的發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢。BVDV-2通常會引起嚴重的急性感染和出血綜合征，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大損失。本文就BVDV-2特異性檢測方法和基因分型的建立，型特異性BVDV-2毒株的分離與鑒定，BVDV-2優(yōu)勢分離株的全基因組測定與遺傳特性分析及BVDV-1和BVDV-2抗原和抗體檢測平臺的建立等方面展開簡要綜述。

牛病毒性腹瀉病毒；分離株；檢測；鑒定；全基因組

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）是牛的主要病毒性傳染病，呈世界性流行，其病原為黃病毒科瘟病毒屬成員——牛病毒性腹瀉病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV），屬正股RNA病毒[1]。根據(jù)基因組的遺傳特性，BVDV分為基因1型(BVDV-1)和基因2型（BVDV-2）兩種基因型，Giangaspero等[2]根據(jù)5'-UTR序列二級結(jié)構(gòu)的差異將BVDV-2分為BVDV-2 a、2 b、2 c及2 d 4個亞型，但2010年Ridpath等[3]建議將BVDV-2分為2個亞型（2a和2b）[3]。BVDV-1目前已可分為16個亞型，即1a～1p[4]。此外，根據(jù)BVDV能否誘導(dǎo)細胞病變，又可分為致細胞病變（cytopathogenic，CP）與非致細胞病變（noncytopathogenci，NCP）兩種生物型[5]。由于不同基因型、生物型間呈現(xiàn)較大異質(zhì)性[6]，所以國際病毒分類委員會已在第9次報告中將兩者分為2個種[7,8]。

自1989年在美國首次報道BVDV-2感染以來，在北美大陸[9]、日本[10]、比利時[11,12]、法國[13]、波蘭[14]、巴西南部[15]、德國[16]等地相繼報道分離到BVDV-2野毒株。與經(jīng)典型BVDV-1感染癥狀相同，大多數(shù)牛感染BVDV-2后表現(xiàn)溫和的亞臨床癥狀，主要為腹瀉、呼吸道癥候群，但BVDV-2可呈持續(xù)感染狀態(tài)[5,6]。自20世紀90年代來，從上述流行地區(qū)牛急性爆發(fā)病例中分離和鑒定的病原幾乎都是BVDV-2，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此世界各國將BVDV-2的防疫與監(jiān)控作為BVDV流行病學(xué)調(diào)查的重點[9,10,16-20]。自1983年以來，我國吉林省、天津市、內(nèi)蒙古自治區(qū)、青海省、陜西省、江蘇省、河南省、河北省、重慶市、新疆維吾爾自治區(qū)、廣西壯族自治區(qū)、黑龍江省等地牛群中相繼被檢測出BVDV抗原和抗體[21-33]。近年來，多個地區(qū)也報道豬、羊、鹿和野生動物感染BVDV[34-38]，但我國仍未從分子水平上對BVDV 分離株的基因型進行明確定義，并且國內(nèi)BVDV-2流行現(xiàn)狀以及其分離株特性不明確，進而難以為我國BVDV-2的預(yù)報、預(yù)警和有效防控提供資料。本文將從以下4個方面:BVDV-2特異性檢測方法和基因分型的建立，型特異性BVDV-2毒株分離與鑒定，BVDV-2 優(yōu)勢分離株的全基因組測定與遺傳特性分析以及BVDV-1和BVDV-2 抗原和抗體檢測平臺的建立開展了系統(tǒng)研究，并結(jié)合本實驗室的成果對國內(nèi)BVDV-2研究現(xiàn)狀進行分析。

1 BVDV-2 RT-PCR 檢測和分型方法的建立[39]

RT-PCR是目前應(yīng)用較廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)，理論上可以檢測出幾個病毒粒子的存在，并在24 h內(nèi)得出結(jié)果，具有耗時短、敏感性高、特異性好等優(yōu)點。在大多數(shù)情況下，RT-PCR 的檢測病毒敏感性比病毒分離培養(yǎng)檢測水平的敏感性高10～1000倍[40]，為病毒檢測提供了一條簡單有效的途徑。

通常在病原的保守區(qū)域設(shè)計RT-PCR 檢測引物，而5'非編碼區(qū)（5'-untranslated region，5'-UTR）序列是在瘟病毒屬中保守程度最高的區(qū)域，因此根據(jù)這一區(qū)域設(shè)計RT-PCR 的檢測引物或分型引物為最佳[41]。我們通過分析比較已發(fā)表的BVDV-1、BVDV-2 的5'-UTR 序列，分別設(shè)計出僅針對BVDV-1型或BVDV-2型的特異性引物和同時針對BVDV-1和BVDV-2兩型的通用引物，以實驗室標準參考株BVDV-1 NADL株和BVDV-2890株為模板，建立了RT-PCR檢測方法。在此基礎(chǔ)上，進一步對疑似牛BVDV-2 感染的臨床病料組織（脾臟、淋巴結(jié)、心肌、血液等）進行檢測。結(jié)果表明，在所檢測的98 份樣品中，BVDV-2 陽性20 份（陽性率約20%）。將上述20 份經(jīng)RT-PCR 鑒定為陽性的組織病料感染MDBK 細胞，進行病毒分離和傳代，結(jié)合感染細胞病變觀察和RT-PCR 驗證組織病料感染的細胞，陽性組織病料病毒分離率為100%。熊浩等[42]根據(jù)GenBank 已發(fā)表的BVDV-1和BVDV-2型 5'-UTR保守序列，設(shè)計2對針對基因1 型和2 型的特異性引物，經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了在同一反應(yīng)體系中同時檢測BVDV-1和BVDV-2的RT-PCR方法。結(jié)果顯示該方法對2個基因型的病毒檢測靈敏度均為2TCID50，只比單重PCR 的靈敏度低了10倍，且具有較好的特異性和可重復(fù)性。經(jīng)臨床應(yīng)用驗證，建立的RT-PCR可用來對2個基因型的BVDV 進行同步分型檢測。張劍云等[43]利用已建立的BVDV-2 RT- PCR檢測方法對新疆某地鹿場的疑似病例進行檢測，檢出陽性結(jié)果7例，證明該鹿場存在BVDV-2感染。

2 BVDV-2分離株的分離與鑒定[44-46]

在已建立的RT-PCR 檢測方法的基礎(chǔ)上，本實驗室將來自江蘇省、山東省、河南省、新疆維吾爾自治區(qū)、青海省、陜西省6省市疑似為BVDV-2感染的200份臨床病料樣品，進行BVDV-2型特異性RTPCR檢測，40 份結(jié)果為陽性（陽性率20%）。

將上述40份陽性樣品接種MDBK 或BT 單層細胞，進行病毒分離培養(yǎng)和傳代。間接免疫熒光試驗（indirect immunofluorescence assay，IFA）亦表明，分離的40 株細胞源BVDV-2 病毒能被鼠源BVDV-2重組E2蛋白抗血清或鼠源BVDV-2單克隆抗體特異性識別?；诒緦嶒炇医⒌碾p抗夾心ELISA檢測上述40株細胞源BVDV-2病毒，結(jié)果同樣均為陽性。進一步觀察分離株的致細胞病變情況，發(fā)現(xiàn)其中NCP 型有38 株，經(jīng)MDBK 細胞盲傳10代以上，在顯微鏡下仍不產(chǎn)生任何細胞病變；CP 型有2 株，命名為XJ-04和SD-06 分離株，并分別盲傳至13 代和8 代，光學(xué)顯微鏡下觀察到病毒感染的MDBK 細胞內(nèi)空泡化、細胞脫落、呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀的典型細胞病變。將上述代表性細胞源BVDV-2 病毒感染的MDBK細胞制備超薄切片，在透射電鏡下觀察，從形態(tài)發(fā)生學(xué)上予以鑒定，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有約60 nm 大小的病毒粒子，從而證實了病毒在感染細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)成熟的說法[47]。此外，經(jīng)差速離心、20%蔗糖墊底超速離心提純的病毒粒子，經(jīng)磷鎢酸染色，在負染電鏡下觀察到有囊膜、粒子大小約60 nm 的病毒顆粒。鑒定結(jié)果與BVDV 的形態(tài)發(fā)生學(xué)上的前期研究報道相符[48-50]。

朱梅勝等[51]對山東省某肉牛養(yǎng)殖場犢牛糞便進行細菌、病毒的分離和鑒定，初步判定該場犢牛出血性腹瀉病例是由O8型大腸埃希菌和BVDV-2混合感染造成的。王國超等[52]為了了解新疆奶牛中是否存在BVDV-2 的感染，從新疆沙灣縣周邊牛場采集臨床癥狀疑似BVDV 感染牛的病料，經(jīng)RT-PCR 檢測，并將陽性病料處理后接種MDBK 單層細胞，同時設(shè)立正常細胞和接種NADL 毒102 株細胞作對照，進行病毒分離鑒定。結(jié)果從陽性血液樣品中分離出1 株CPE 型的BVDV 毒株（命名為BVDVSW）。電鏡觀察到球形、有囊膜、直徑約為50～60 nm、囊膜表面有突起的病毒粒子。對該分離株5'UTR 和E2 基因的序列分析比較，證實所分離的毒株為BVDV-2。遺傳進化分析表明，該分離株與17237 毒株（BVDV-2型，分離于歐洲）具有較近的親緣關(guān)系，證實新疆奶牛中存在BVDV-2 的感染，并且具有較強的致病力。聶兆晶等[53]為了解BVDV在豬用活疫苗生產(chǎn)過程中的污染情況，將檢測結(jié)果為陽性的1 份犢牛血清，接種于MDBK 細胞上，盲傳3 代后出現(xiàn)明顯細胞病變，經(jīng)RT-PCR 檢測，結(jié)果為BVDV-2。

3 BVDV-2分離株的全基因組測定與遺傳特性分析[45, 46, 54, 55]

病原分離株全基因組的測定是重要的分子流行病學(xué)資料，而遺傳特性的分析又是是追溯病毒的傳播來源和預(yù)測病毒病流行趨勢的重要基礎(chǔ)。本實驗室利用RT- PCR 方法分別擴增來自國內(nèi)6 省市16 株BVDV-2 分離株的5'-UTR、Npro、糖蛋白E2 編碼基因和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-3 基因，擴增出的序列片段與預(yù)期值大小相一致，并進一步將目的基因片段克隆、序列測定。序列測定結(jié)果和核苷酸、氨基酸序列同源性比較分析表明，上述國內(nèi)16株BVDV-2分離株同源性高達99%以上，很有可能是由同一毒株進化而來。

為進一步了解BVDV-2 的遺傳特性，我們采用RT-PCR 方法分段擴增XJ-04 代表株全基因組序列，并克隆、測序，將各序列進行拼接后成功獲得了XJ-04 株全基因組序列，全長為12 284 bp（GenBank 登錄號:FJ527854）。通過5'-UTR、全基因組序列進化樹的構(gòu)建及分析，并結(jié)合自我裂解酶（Npro）和結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1、E2）與標準株BVDV-1 NADL和BVDV-2 890 進行核苷酸、氨基酸序列同源性比較分析，我們發(fā)現(xiàn)XJ-04 與BVDV-2 中890、NewYork93 株親緣關(guān)系最近，歸入BVDV-2a 亞型。有研究表明，NS2/3 基因中堿基的插入、缺失、重排、替換等可導(dǎo)致NCP 型BVDV 向CP 型BVDV 的轉(zhuǎn)變[56-58]，但PCR 檢測發(fā)現(xiàn)在致細胞病變型的XJ-04株NS2/3 基因上沒有任何外源基因的插入。這為我們今后探索BVDV-2 的生物型轉(zhuǎn)化機制等提供了科學(xué)依據(jù)。此外，陶潔等[59]對實驗室分離保存的1 株豬源BVDV（SH-28）進行了全基因組測序，全基因組進化樹結(jié)果表明，雖然SH-28 與HLJ-10同處于一個分支上，但其與XJ-04 的全基因組核苷酸同源性最高（92.3%），而與另外2 株豬源BVDV-1(ZM-95、SD0806)的親緣性較遠（70.0%、70.1%）。5'-UTR進化樹結(jié)果顯示SH-28分離株屬于BVDV-2a2基因亞型，而HLJ-10 和XJ-04 株屬于BVDV-2a1。李慶超等[60]利用MDBK 增殖1株分離于我國吉林省的牛源牛病毒性腹瀉病毒JZ05-1 毒株，然后使用RT-PCR 方法分別擴增覆蓋基因組全長的8個片段并測序，拼接獲得該病毒的全基因組序列長12285核苷酸（GenBank登錄號:GQ888686）。分析BVDVJZ05-1 的5'-UTR序列和全基因組序列，發(fā)現(xiàn)該病毒屬于BVDV-2a亞型[60]。

BVDV-2 國內(nèi)分離株全基因組序列的測定和遺傳特性的分析，不僅豐富了我國BVDV的分子流行病學(xué)資料，而且為BVDV-2 遺傳演化規(guī)律的探究提供了線索，有助于后續(xù)BVDV-2 的防控。

4 BVDV-1和BVDV-2抗原抗體檢測平臺的建立[61,62]

為解決臨床上出現(xiàn)的檢測樣本難、檢測靈敏度低、耗時等難題，本實驗室一直致力于優(yōu)化BVDV檢測方法的研究。我們已構(gòu)建出高效誘導(dǎo)表達1型和2型BVDV糖蛋白E2的PET原核表達系統(tǒng)，制備出的E2 重組蛋白作為抗原，建立間接ELISA 方法。用建立的ELISA對江蘇省部分地區(qū)牛群抗體進行監(jiān)測，結(jié)果表明，該地區(qū)BVDV 陽性感染率普遍較高。

我們進一步研制出抗1型和2型BVDV糖蛋白E2的單克隆抗體（McAb）雜交瘤細胞株2株（3F9 和3D8），腹水ELISA 滴度分別達到216和10×27。利用單克隆抗體的高度特異性并結(jié)合BAS（biotinavidin system，生物素-親合素系統(tǒng)）的靈敏性，設(shè)計了一種靈敏度高、特異性強的檢測BVDV 的雙抗體夾心ELISA 方法，基于3D8（IgM 類）為捕獲抗體，biotin 標記的3F9（IgG 類）作為第二抗體。運用方陣滴定實驗確定捕獲抗體最佳工作濃度為2 μg/mL，Biotin-3F9 工作效價為60 ng/mL， E2 蛋白最低檢出量為84 ng/mL。利用建立的雙抗體夾心ELISA 方法檢測35 份病牛血清樣本，13份為陽性與RT-PCR 的符合率達到94.29%。結(jié)果表明我們所建立的BAS-ELISA 方法可用于BVDV 感染的臨床特異性診斷，為建立單抗介導(dǎo)的檢測BVDV-1 和BVDV-2 抗原、抗體的血清學(xué)方法和實現(xiàn)實驗室診斷的標準化奠定了良好的基礎(chǔ)。

范晴等[63]用兔抗BVDV多抗作為包被抗體，BVDV NS3 單克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測BVDV 抗原的捕獲ELISA 方法，對各項反應(yīng)條件進行優(yōu)化，獲得的最佳工作條件為:兔多抗1∶1 600稀釋包被，NS3 單抗1∶2000稀釋，酶標抗體工作濃度1∶4000稀釋。特異性和敏感性檢測結(jié)果表明，該方法對牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛分支桿菌無交叉反應(yīng)，最低可檢測7.9×103個TCID50的病毒量，與RT-PCR 方法的符合率為100%。建立的BVDV 抗原捕獲ELISA 方法快速、特異、敏感，可用于BVDV 抗原的檢測。李文文等[64]使用BVDV全病毒蛋白作為包被原，建立了檢測BVDV 的間接ELISA 檢測方法，并且探討了CP 型BVDV 與NCP型BVDV 抗原免疫原性差異。結(jié)果顯示，CP 型BVDV 的高免血清效價均比NCP 型BVDV 高免血清的效價平均高35%，且差異明顯。

國內(nèi)針對這些BVDV-1 和BVDV-2 抗原、抗體建立的檢測平臺，有助于我國BVDV-2的預(yù)報、預(yù)警，而且為BVDV 的診斷和疫苗研發(fā)提供了理論指導(dǎo)。

5 總結(jié)

隨著中國加入WTO，畜產(chǎn)品走向國際市場，首先要解決的就是動物疫病的有效控制。在加入WTO 后的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整，對全國養(yǎng)牛業(yè)和乳牛業(yè)高效、優(yōu)質(zhì)、可持續(xù)性發(fā)展起到重要的保障作用和積極的推動作用。目前我國處于加大動物保護的免疫密度，抵御外界動物疫情入侵的關(guān)鍵時期。因此，政府主管部門按照國家防治牛群重要疫病的規(guī)劃，要求迅速提高免疫密度，這就對（奶）牛重要疫病防制的疫苗的質(zhì)量和數(shù)量提出了更高的要求。所以我們需要從基礎(chǔ)做起，首先著手于病原的流行病學(xué)，積累大量數(shù)據(jù)，進而深入探究流行毒株的特性、感染機制及疫苗研制方法，并不斷完善試驗成果，為動物疫病的防制貢獻力量。

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RESEARCH PROGRESS OF GENOTYPE 2 BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUSIN CHINA

ZHANG Qian1,2, TAO Jie1,2,3, ZHANG Dong1,2, OU Bing-ming1,2, LIN Hang1,2, YANG Ying1,2, ZHANG Xinjun1,2, ZHU Li-qian1,2, WANG Jian-ye1,2, HE Sheng-zhong4, MENG Ting4, XIE Jing4, ZHU Guo-qiang1,2

(1.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2.Prevention and Control of Collaborative Innovation Center of the Important Animal Disease and Zoonosis in Jiangsu Province, Yangzhou 225009, China; 3.Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 4 Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China)

Bovine viral diarrhea virus is divided into two genotypes∶ genotype 1 (BVDV-1) and genotype 2 (BVDV-2). Previous epidemiological survey showed BVDV-1 isolates distributed more widely. However, the mobidity rate of BVDV-2 is increasing in recent years. In general, BVDV-2 infection can cause more severe disease characterized by acute infection and haemorrhagic syndrome, causing enormous losses to the cattle industry. In this review, we dilate on the following aspects∶ the establishment of the specifi c detection and genotyping methods of BVDV-2, the isolation and identifi cation of BVDV-2, complete genomic sequencing and phylogenetic analyzation of BVDV-2 isolates, and the establishment of detection platform to virus and antibody of BVDV-1 and BVDV-2.

Bovine viral diarrhea virus; isolates; detection; identifi cation; complete genome

S852.659.6

A

1674-6422（2017）01-0080-07

2016-02-04

科技部畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)重點專項（2016YFD0500900）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目；重大動物疫病防控技術(shù)引進（國家農(nóng)業(yè)部948計劃，2011-G24）；江蘇省屬高校自然科學(xué)重大基礎(chǔ)研究項目（14KJA230001）；江蘇省農(nóng)業(yè)支撐項目（BE2014358）；泰州市農(nóng)業(yè)科技計劃項目（TZ201421）

張倩，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)；陶潔，女，助理研究員，主要從事動物病毒學(xué)研究

朱國強，E-mail∶ yzgqzhu@yzu.edu.cn