國(guó)內(nèi)豬源卡他莫拉菌的首次分離與鑒定

余桃櫻，石於友，李國(guó)華，沙麗東，劉 寧，李美荃，宋 聰，楊榮麗，李華春，姚 俊

（1. 云南省貢山縣農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，貢山 673500；2. 云南省巍山縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，巍山672400；3.云南省墨江縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，墨江654800；4. 云南省富民縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，富民650400；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；6.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

·研究論文·

國(guó)內(nèi)豬源卡他莫拉菌的首次分離與鑒定

余桃櫻1，石於友2，李國(guó)華3，沙麗東4，劉 寧5，李美荃5，宋 聰5，楊榮麗6，李華春6，姚 俊6

（1. 云南省貢山縣農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，貢山 673500；2. 云南省巍山縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，巍山672400；3.云南省墨江縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，墨江654800；4. 云南省富民縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，富民650400；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；6.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

2015年1月昆明市郊區(qū)某規(guī)?；N豬場(chǎng)飼養(yǎng)的后備種豬發(fā)生一種以高熱，呼吸急促、窘迫，皮膚發(fā)紺及猝死為特征的疫情。分離細(xì)菌培養(yǎng)后獲得1株形態(tài)呈雙腎形的革蘭氏陰性雙球菌。經(jīng)昆明小白鼠致病性實(shí)驗(yàn)、本動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌生化鑒定及16S rRNA和UspA1基因序列分析顯示，該分離菌株為毒力極強(qiáng)的卡他莫拉菌。與卡他莫拉菌參考菌株BBH18株（GenBank登錄號(hào)：NC_014147.1）的16S rRNA和UspA1基因序列同源性達(dá)100%。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)頭孢噻肟高度敏感，對(duì)妥布霉素、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢他啶、呋喃妥因及四環(huán)素中度敏感。豬場(chǎng)選用敏感藥物進(jìn)行緊急預(yù)防和治療，及時(shí)有效地控制了本病的擴(kuò)散及蔓延。

卡他莫拉菌；分離；鑒定；豬

卡他莫拉菌最初被命名為卡他微球菌（Micrococcus catarrhalis），20世紀(jì)60年代被命名為卡他奈瑟菌（Neisseria catarrhalis），70年代根據(jù)DNA同源性被分為獨(dú)立的一屬，即布蘭漢菌屬（Branhamella）。1979年后國(guó)際微生物學(xué)屆部分學(xué)者建議將本菌劃歸于莫拉菌屬，稱為卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis，MC）。目前莫拉菌屬包含22個(gè)種。卡他莫拉菌為革蘭氏陰性雙球菌，多呈雙腎形，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢，屬專性需氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂上即可生長(zhǎng)。菌落不透明、凸起、光滑或呈亞光，顏色乳白、粉紅或褐色，有些菌株的菌落較堅(jiān)硬，但易碎?？ㄋ侨祟惿虾粑赖某＞泳N，為條件致病菌[1]，可引起人類的多種感染，甚至?xí)奂叭恚缂毙灾卸?、上頜竇炎和下呼吸道感染，也可引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、尿道炎，嬰兒和兒童眼結(jié)膜炎、角膜炎和敗血癥等。國(guó)外資料顯示，卡他莫拉菌在成人下呼吸道感染及兒童肺炎、中耳炎等標(biāo)本中的分離率，僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌，列第3位?？ㄋa(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的菌株漸多，為臨床治療帶來(lái)一定困難?？ㄋ谌酸t(yī)學(xué)上的感染報(bào)道較多，但截至目前該菌在動(dòng)物上引起感染發(fā)病死亡的病例暫未見到相關(guān)報(bào)道[2-14]。

2015年1月，昆明市郊區(qū)某規(guī)?；N豬場(chǎng)飼養(yǎng)的后備種豬突然發(fā)病，精神沉郁，躺睡不愿站立，強(qiáng)迫驅(qū)使行走時(shí)可見后驅(qū)搖擺，站立不穩(wěn)，體溫升高至41℃～41.5℃，食欲下降并伴隨嘔吐，發(fā)病后1～2 d內(nèi)死亡，瀕死前全身顫抖，口鼻有泡沫流出，死亡后肢體末梢及腹部皮膚發(fā)紺。對(duì)病死豬尸體進(jìn)行解剖可見肺臟腫大、出血，膀胱粘膜面彌漫性出血，腎臟腫大，布滿彌漫性出血點(diǎn)，胃腸道漿膜面可見充血，粘膜面彌漫性出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血（圖1）。無(wú)菌采集腹股溝淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、肝臟組織，劃線于血瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、巧克力瓊脂及麥康凱瓊脂平板后，置于37℃普通培養(yǎng)箱及厭氧罐培養(yǎng)24～48 h。在厭氧環(huán)境培養(yǎng)的平板無(wú)任何菌落生長(zhǎng)，而在普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)的血瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、巧克力瓊脂上均生長(zhǎng)出圓形、光滑、邊緣整齊、濕潤(rùn)、透明或乳白色菌落。經(jīng)染色鏡檢、生化鑒定、動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)、本動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)以細(xì)菌16S rRNA基因序列分析，確診該分離菌株為卡他莫拉菌，是引起本次豬群發(fā)病急性死亡的病原。選用敏感藥物對(duì)豬群進(jìn)行預(yù)防及治療，效果顯著，及時(shí)有效地控制了本病的擴(kuò)散及蔓延。

圖1 病死豬內(nèi)臟器官病理變化Fig. 1 Pathological changes of visceral organs of dead pigsA∶ 膀胱粘膜彌漫性出血; B∶ 肺臟腫大、出血; C∶ 腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血; D∶ 腎臟腫大、布滿彌漫性出血點(diǎn)A∶ Diffuse hemorrhage of the bladder mucosa; B∶ The lung was swelling and bleeding; C∶ The mesenteric lymph node were swelling and bleeding; D∶ The kidney was swelling and full of diffuse point

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 昆明市郊區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)送檢的流產(chǎn)胎兒大腦。

1.1.2 主要試劑、菌種、培養(yǎng)基及儀器 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、顯色指示劑、DNA瓊脂、四甲基對(duì)苯二胺（Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochlo-ride）、吲哚乙酰酯購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；Gibic新生犢牛血清購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)有限公司（Life Technologies）；革蘭氏染液、非發(fā)酵細(xì)菌生化編碼鑒定管、常用新藥敏紙片及細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；卡他莫拉菌ATCC 25238標(biāo)準(zhǔn)菌株由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；病毒DNA提取試劑盒（Viral DNA Kit）、病毒RNA提取試劑盒（Viral RNA Kit）購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、熒光定量qPCR及qRTPCR試劑盒、2×PlusTaq酶、DNA Marker2000購(gòu)自天根生物技術(shù)（北京）有限公司；AgPath-IDTMonestep RT-PCR Kit(AM1005)購(gòu)自美國(guó) ABI（Applied Biosystems Inc.）公司；一步法RT-PCR試劑盒（One Step RT-PCR Kit）購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）生物技術(shù)有限公司；普通光學(xué)顯微鏡為OLYMPUS CX31顯微鏡；CO2培養(yǎng)箱為THERMO SCIENTIFIC；生物安全柜為ESCO CLASS II TYPE A2；PCR 儀Gene Amp PCR System 9700、實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀7500 Fast Real-time PCR System 、梯度PCR儀購(gòu)自 ABI（Applied Biosystems Inc.）公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明成年小白鼠25只，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。70日齡DLY三元雜仔豬5頭，購(gòu)自云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)卡他莫拉菌美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25238參考菌株（GenBank登錄號(hào):U10876.1）的16S rRNA及UspA1基因的保守序列設(shè)計(jì)、卡塔莫拉菌分離株引物?？ㄋ?、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II型、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒及豬細(xì)小病毒檢測(cè)引物及探針，由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型毒株及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株及通用型引物和探針，以及布氏桿菌、剛地弓形蟲、巴氏桿菌種特異的檢測(cè)引物及探針參考文獻(xiàn)[15-20]。以上引物及探針均分別由上海Invitrogen生物科技有限公司、上海GENEray生物科技有限公司及昆明碩擎生物科技有限公司合成。引物、探針見表1。

1.2.2 病毒核酸的抽提 取流產(chǎn)胎兒大腦勻漿，反復(fù)凍融3次后，4500×g離心10 min，取上清液按美國(guó)OMEGA生化試劑公司的病毒基因組DNA、RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取的病毒核酸放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)菌基因組DNA的抽提 刮取分離培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，抽提出的細(xì)菌基因組DNA放置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性及經(jīng)典毒株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II型、豬細(xì)小病毒、弓形蟲、巴氏桿菌PCR及real-time PCR檢測(cè) 運(yùn)用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II型real-time PCR和豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒PCR檢測(cè)方法，以及參考相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株，剛地弓形蟲、巴氏桿菌PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)[15-20]。豬瘟病毒real-time PCR反應(yīng)體系（25μL）:2×AgPath-ID one-step RT-PCR buffer 12.5μL、CSFV-F（10μmol/mL） 1μL、CSFV-R（10μmol/L） 1μL、CSFV-P（10μmol/mL）1μL、50× Detection Enhancer 0.5μL、25× Enzyme Mix 1μL、模板DNA 4μL、補(bǔ)足滅菌ddH2O 4μL。反應(yīng)條件:45℃溫育10 min；95℃預(yù)變性10 min，95℃變性3 s、60℃退火30 s，運(yùn)行45個(gè)循環(huán)。豬細(xì)小病毒PCR反應(yīng)體系（25μL）:2×Taq Plus PCR Master mix 12.5μL、PPV-VP2-F（10μmol/mL）1μL、PPV-VP2-R（10μmol/mL） 1μL、模板DNA 4μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O 6.5μL；反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。偽狂犬病毒 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）:2×Taq Plus PCR Master mix 12.5μL、PRV-gE-F（10μmol/ mL） 1μL、PRV-gE-R（10μmol/mL） 1μL、模板DNA 3μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O 7.5μL；反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性40 s、58℃退火40 s、72℃延伸90 s運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。豬圓環(huán)病毒II型real-time PCR（25μL）:2×qPCR MasterMix 12.5μL、PCV-2-F（10μmol/mL）1μL、PCV-2-R（10μmol/mL） 1μL、PCV-2-P（10μmol/mL） 1μL、模板DNA 4μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O 5.5μL；反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性5 s、55℃退火10 s、72℃延伸30 s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。

表1 引物、探針信息表Table 1 Primers and probes in this study

1.2.5 細(xì)菌分離鑒定 將樣品劃線接種于血清瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂平板后，置于37℃溫箱培養(yǎng)24～48 h，取少許菌落染色鏡檢觀察形態(tài)。將細(xì)菌純化后穿刺接種于TSI試管斜面及精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、氨基酸對(duì)照、枸櫞酸鹽、硝酸鹽、尿素、七葉苷、靛基質(zhì)、ONPG、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、硫化氫微量鑒定管后（其中氨基酸及氨基酸對(duì)照管接種后滴加液體石蠟覆蓋），置于37℃培養(yǎng)24～48 h后加顯色劑判讀結(jié)果；DNA酶試驗(yàn):將被檢細(xì)菌點(diǎn)種于0.2%DNA瓊脂平板上，同時(shí)點(diǎn)種金黃色葡萄球菌及埃希氏大腸桿菌作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照，置于37℃溫箱培養(yǎng)24 h，然后加入1 mol/L的鹽酸覆蓋平板，作用10 min后觀察結(jié)果，在菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)的細(xì)菌為陽(yáng)性，無(wú)透明環(huán)為陰性；氧化酶試驗(yàn):試驗(yàn)方法加2～3滴1%四甲基對(duì)苯二胺（Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochlo-ride）于濾紙上，用牙簽挑取1個(gè)菌落到紙上涂布，觀察菌落的反應(yīng)，陽(yáng)性反應(yīng)在5～10 s內(nèi)由粉紅到黑色，15 min后可出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。吲哚乙酰酯水解試驗(yàn):稱取60 mg吲哚乙酸酯溶解于2 mL分析純丙酮中備用，制備厚度為1 mm、長(zhǎng)5 cm和寬1 cm的新華濾紙片高壓滅菌干燥后備用，將紙片浸入吲哚乙酸酯溶液后取出晾干，固定于一平皿中，滴加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取培養(yǎng)板上待鑒定的菌落涂抹于滅菌干燥的新華濾紙片上，記錄時(shí)間，同時(shí)觀察菌落顏色變化，如在室溫下3min內(nèi)變?yōu)樗{(lán)綠色為陽(yáng)性，不變色為陰性；

β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)（紙片酸度定量法）:將一小片滅菌干燥的新華濾紙片放置于平皿中，讓濾紙吸足青霉素溶液（0.005 mol/L磷酸緩沖液，pH 8.0的0.2%溴甲酚紫+5%無(wú)緩沖劑的結(jié)晶青霉素），用接種環(huán)把10～20個(gè)菌落涂抹到濾紙上，蓋好平皿后，將濾紙片置于37℃溫箱孵育30 min，觀察結(jié)果，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株使濾紙顏色由紫色變黃色，一般在10 min內(nèi)即能看到。

1.2.6 卡他莫拉菌16S rRNA和VspA1基因的分子鑒定應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒抽提分離菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并切膠回收測(cè)序及序列分析?？ㄋ?6S rRNA基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）:2×Taq Plus PCR Master mix 12.5μL、M.catarr-ATCC-868-F（10μmol/mL） 1μL、M.catarr-ATCC-868-R（10μmol/mL） 1μL、模板DNA 3μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O 7.5μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性10 min，95℃變性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸60 s運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。卡他莫拉菌UspA1基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25μL）: 2×Taq Plus PCR Master mix 12.5μL、M.catarr-UspA1-F（10μmol/mL） 1μL、M.catarr-UspA1-R（10μmol/mL） 1μL、模板DNA 3μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O 7.5μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 5 min。

1.2.7 小白鼠致病性實(shí)驗(yàn) 將純化后的細(xì)菌混懸于無(wú)菌生理鹽水中，經(jīng)菌數(shù)測(cè)定后稀釋為1.5×108個(gè)細(xì)菌/mL，每只小白鼠腹腔接種0.1 mL，共接種20只作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)立5只陰性對(duì)照，腹腔接種同等劑量無(wú)菌生理鹽水。接種后觀察、記錄發(fā)病及死亡情況，解剖死亡小白鼠觀察病理變化，無(wú)菌采集及回收分離病原菌。

1.2.8 本動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn) 將純化后的細(xì)菌混懸于無(wú)菌生理鹽水中，經(jīng)菌數(shù)測(cè)定后稀釋為1.5×108個(gè)細(xì)菌/ mL，每只仔豬頸部肌肉接種1 mL，共接種4只作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)立1只陰性對(duì)照，頸部肌肉接種同等劑量無(wú)菌生理鹽水。接種后觀察、記錄發(fā)病及死亡情況，解剖病死仔豬觀察病理變化并無(wú)菌采集心血及肝臟回收分離病原菌。

1.2.9 藥敏實(shí)驗(yàn) 將純化后的細(xì)菌均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，貼上藥敏試紙于37℃培養(yǎng)24 h后取出觀察結(jié)果并測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 病原體檢測(cè)結(jié)果 送檢樣品中沒有豬繁殖呼吸綜合征病毒歐洲株及美洲株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II型、偽狂犬野毒株、豬細(xì)小病毒和剛地弓形蟲感染。

2.2 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 送檢組織樣品經(jīng)接種環(huán)無(wú)菌采集樣品后，劃線接種于血清瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成圓形、凸起、光滑、邊緣整齊、無(wú)色透明、無(wú)特殊氣味的菌落，在巧克力瓊脂平板上形成圓形、凸起、光滑、邊緣整齊的乳白色菌落，在麥康凱瓊脂平板不生長(zhǎng)（圖2）。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢呈革蘭氏陰性雙球菌（圖3），多呈腎形，成對(duì)排列（短軸相對(duì)），無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為氧化酶和觸酶陽(yáng)性（圖4），不能利用糖類產(chǎn)酸，DNA水解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性（菌斑周圍及菌斑下出現(xiàn)無(wú)色透明區(qū)），乙酰酯酶試驗(yàn)陽(yáng)性（呈藍(lán)綠色），β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽(yáng)性（呈現(xiàn)黃色）。TSI穿刺接種不產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)H2S，不分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖產(chǎn)酸，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，利用蔗糖合成多糖陰性（圖5）。根據(jù)細(xì)菌革蘭氏染色鏡檢及生化鑒定結(jié)果，初步判定分離菌株為卡他莫拉菌。

2.3 小白鼠致病性實(shí)驗(yàn) 接種細(xì)菌的20只昆明小白鼠精神萎頓，飲食欲廢絕，打堆，接種后24～53 h內(nèi)全部死亡。解剖可見肺臟、肝臟、脾臟、腎臟腫大、淤血或出血。從死亡小白鼠肝臟里分離到卡他莫拉菌。5只陰性對(duì)照昆明小白鼠無(wú)任何臨床癥狀。

圖2 不同培養(yǎng)基上細(xì)菌的生長(zhǎng)情況Fig.2 The growth of bacteria on diffenrent culture mediaA∶ 細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成菌落; B∶ 在麥康凱平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)A∶ Bacterial colonies on the surface of general nutrition agar; B∶No bacterial colonies in Maconkey agar plate

圖3 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.3 The results of Gram staining

圖4 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The results of biochemical testsA∶ DNA酶水解試驗(yàn); B∶ β內(nèi)酰胺酶試驗(yàn); C∶ 氧化酶試驗(yàn); D∶乙酰酯酶試驗(yàn)（呈藍(lán)綠色）A∶ DNA enzyme hydrolysis test; B∶ Beta-lactamases test; C∶ Oxidase test; D∶ Acetyl esterase test

圖5 微量細(xì)菌生化鑒定結(jié)果Fig.5 The micro biochemical vesults of the isolate

2.4 本動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)豬接種分離菌株后，3～5 d內(nèi)全部死亡。接種后豬精神萎頓，打堆，發(fā)熱，體溫最高達(dá)42.5℃，呼吸困難、窘迫，少量采食，并伴隨嘔吐，豬死亡前一晚體溫降至39.5℃以下（圖6）。病理解剖檢查發(fā)現(xiàn)豬全身皮膚出血（發(fā)紺），皮下脂肪及肌肉出血；下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肺門及中隔淋巴結(jié)腫大出血；肺臟局部出血；腎臟質(zhì)脆淤血有極細(xì)點(diǎn)狀出血點(diǎn)；小腸鼓氣并充血、出血，小腸粘膜面出血；胃粘膜廣泛性彌漫性脫落且局部出血；腎上腺腫大出血；肝臟局部呈現(xiàn)暗黑色；脾臟呈現(xiàn)暗黑色；膀胱粘膜出血，大腦未見明顯異常（圖7）。結(jié)果表明，接種豬與發(fā)病豬的臨床癥狀及病理變化完全一致。

圖6 接種病死豬臀部、下腹部及耳朵皮膚可見明顯的發(fā)紺Fig.6 Skin cyanosis observed in skin of the piglets for animal regression experiment

2.5 分子鑒定結(jié)果 PCR擴(kuò)增出16S rRNA基因大約868 bp大小的目的片段以及UspA1基因大約406 bp大小的目的片段（見圖8），所得序列經(jīng)過(guò)校正、拼接后在NCBI GenBank中進(jìn)行Blast，測(cè)定序列與中卡他莫拉菌參考菌株BBH18株（GenBank登錄號(hào):NC_014147.1）的16S rRNA和UspA1基因序列同源性達(dá)100%。

2.6 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖9），分離細(xì)菌對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢噻肟高度敏感，對(duì)呋喃唑酮、頭孢曲松鈉、四環(huán)素中度敏感，對(duì)氨芐青霉素低度敏感，對(duì)青霉素耐藥。

圖7 接種分離菌株后病死豬內(nèi)臟器官病理變化Fig.7 Pathological changes of internal organs of the piglets for animal regression experimentA∶ 頜下淋巴結(jié)腫大、出血; B∶ 腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血; C∶ 腸道及胃鼓氣, 漿膜面可見充血、出血; D∶ 胃粘膜糜爛、潰瘍及出血; E∶ 腸粘膜糜爛、潰瘍及出血; F∶ 肺臟腫大、出血; G∶ 腎上腺腫大、出血; H∶ 腎臟腫大, 表面布滿針尖大小出血點(diǎn); I∶ 膀胱粘膜可見有出血點(diǎn)A∶ Mandibular lymph node was swelling and bleeding; B∶ Mesenteric lymph nodes were swelling and bleeding; C∶ Gastrointestinal tract was full of gas and its serosal surface showed congestion and hemorrhage; D∶ Gastric mucosa was anabrotic, ulcerous and bleeding; E∶Intestinal mucosa was anabrotic, ulcerous and bleeding; F∶ The lung was swelling and bleeding; G∶ Adrenal glands were swelling and bleeding; H∶ Kidneys were swelling and bleeding; I∶ Mucous membrane of bladder was bleeding

3 討論

隨著我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、集約化快速發(fā)展，養(yǎng)殖水平不斷提高，豬的重大疫病科學(xué)、規(guī)范化免疫預(yù)防成效顯著，在臨床上引起暴發(fā)、流行及批量死亡的趨勢(shì)有所下降。但是由于飼料中長(zhǎng)期添加各類型抗菌藥物，以及保健過(guò)程中的過(guò)度用藥、過(guò)度治療、違法違規(guī)用藥等抗菌藥物的濫用形勢(shì)日趨嚴(yán)峻，導(dǎo)致了養(yǎng)殖環(huán)境中的病原菌耐藥性及致病力越來(lái)越強(qiáng)，飼養(yǎng)豬頻發(fā)細(xì)菌感染從而導(dǎo)致急性發(fā)病死亡的案例越來(lái)越多。本文從送檢的急性發(fā)病死亡豬的組織病料中分離獲得1株致病力極強(qiáng)的革蘭氏陰性雙球菌，經(jīng)細(xì)菌生化鑒定及16S rRNA和UspA1基因序列分析，鑒定為卡他莫拉菌。動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)也成功復(fù)制出了與發(fā)病死亡豬完全相同的臨床癥狀及病理變化的病例，并且成功分離到了攻毒菌株。為了證實(shí)該分離菌株是否是引起此次疫情的主要病原體，還對(duì)送檢樣品進(jìn)行了豬繁殖與呼吸道綜合征病毒歐洲株及美洲株、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒II型、偽狂犬野毒、豬細(xì)小病毒、剛地弓形蟲及巴氏桿菌感染等可能的病原檢測(cè)，結(jié)果顯示上述病原均被排除。選用藥敏實(shí)驗(yàn)敏感藥物對(duì)發(fā)病豬的治療效果也很顯著，從而最終確診了卡他莫拉菌是引起此次豬發(fā)病、死亡的主要病原體。卡他莫拉菌引起人類感染發(fā)病的報(bào)道很多，但在動(dòng)物上的相關(guān)研究報(bào)道并不多見，本次豬源卡他莫拉菌的成功分離、鑒定在國(guó)內(nèi)尚屬首次報(bào)道。

圖8 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 The results of PCR of 16S rRNA geneA∶ 16S rRNA基因; B∶ UspA1基因. M∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); S∶ 樣品; P∶陽(yáng)性對(duì)照; N∶陰性對(duì)照A∶ 16S rRNA gene; B∶ UspA1 gene. M∶ DNA Marker(DL2000); S∶The isolated bacteria; P∶ Positive control; N∶ Negative control

圖9 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 The results of drug sensitive test

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FIRST REPORT OF MORAXELLA CATARRHALIS CASES IN SWINE IN CHINA

YU Tao-ying1, SHI Yu-you2, LI Guo-hua3, SHA Li-dong4, LIU Ning5, LI Mei-quan5, SONG Cong5, YANG Rong-li6, LI Hua-chun6, YAO Jun6

(1. Gongshan Bureau of Agriculture and Science and Technology, Gongshan 673500, China; 2. Weishan Center for Prevention and Control of Animal Disease, Weishan 672400, China; 3. Mojiang Center for Prevention and Control of Animal Disease, Mojiang 654800, China; 4. Fuming Center for Prevention and Control of Animal Disease, Fuming 650400, China; 5. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 6. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China )

A disease characterized by high fever, shortness of breath, distress, skin cyanosis and sudden death occurred in January 2015 in reserve pigs of a large scale farm, which located in Kunming suburb. As a result, one strain of gram-negative bacteria with double kidney shape was isolated from lymph nodes and internal organs of a dead pig. The results of pathogenicity, animal regression experiment, bacterial biochemical identification and 16S rRNA gene sequence analysis showed that the isolate was highly pathogenic Moraxellacatarrhailis. The identity of the 16S rRNA and UspA1 gene sequences of the isolate was 100% with the reference strain Moraxella catarrhalis BBH18（GenBank Reference Sequence∶ NC_014147.1）. The isolate was highly susceptible to cefotaxime sodium and medium susceptible to tobramycin, gentamicin, ceftriaxone sodium, cefuroxime, ceftazidime, furadantin and tetracycline. Emergency prevention and treatment of the disease was carried out for other pigs using susceptible drugs.

Moraxella catarrhalis; isolation; identifi cation; swine

S852.611

A

1674-6422（2017）01-0036-09

2016-05-26

云南省科技廳重大科技專項(xiàng)（2012ZA017）

余桃櫻，女，獸醫(yī)師，主要從事實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)技術(shù)工作；石於友，男，獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷檢測(cè)技術(shù)工作

姚俊，E-mail:810535839@qq.com