抗菌肽在甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用

李法君，付春鵬，李群峰

（濰坊科技學(xué)院，山東壽光 262700）

動(dòng)添物加營劑養(yǎng)

抗菌肽在甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用

李法君*，付春鵬，李群峰

（濰坊科技學(xué)院，山東壽光 262700）

甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制不同于脊椎動(dòng)物，僅具有先天性免疫系統(tǒng)。抗菌肽是一類具有天然抗菌活性的生物多肽，在甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本文綜述了抗菌肽在甲殼動(dòng)物中的研究進(jìn)展，并對其在甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

抗菌肽；免疫；生長；甲殼動(dòng)物

甲殼綱隸屬節(jié)肢動(dòng)物門，種類主要包括蝦類、蟹類等。甲殼動(dòng)物營養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已成為我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象。近年來高密度、集約化的養(yǎng)殖方式產(chǎn)生的投餌過剩、糞便分解不及時(shí)、蝦蟹死亡污染池水，導(dǎo)致水質(zhì)急劇惡化、疾病頻發(fā)等，已經(jīng)成為制約我國蝦蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。在實(shí)際生產(chǎn)中，多是通過使用抗生素和化學(xué)藥品來治療。而這些藥品的過量使用會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，造成惡性循環(huán)。因此，闡明甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制，提高甲殼動(dòng)物自身的免疫能力是解決上述問題的根本措施。

免疫系統(tǒng)包括物理防御、體液免疫和細(xì)胞免疫，是后生動(dòng)物抵抗外來病原入侵的防御體系，分為先天性免疫和獲得性免疫。甲殼動(dòng)物體內(nèi)不能產(chǎn)生免疫球蛋白，缺乏獲得性免疫，僅具有先天性免疫（He等，2015；Wang等，2015a）?？咕模ˋMPs）作為一類在生物體中廣泛存在的具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，是甲殼動(dòng)物體液免疫的重要組成部分 （Rajanbabu等，2015；Tassanakajon等2015）。

1 甲殼動(dòng)物抗菌肽的發(fā)現(xiàn)及分類

20世紀(jì)80年代，科學(xué)家在用蠟狀芽孢桿菌誘導(dǎo)的惜古比天蠶蛹淋巴液中分離到第一種抗菌肽，并命名為天蠶素（Stciner等，1981）。1996年，科研人員在濱蟹的血細(xì)胞中分離到甲殼動(dòng)物抗菌肽，此抗菌肽富含脯氨酸，分子質(zhì)量約為6.5 kDa，并具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌活性（Schnapp等，1996），從此拉開了研究甲殼動(dòng)物抗菌肽的序幕。甲殼動(dòng)物抗菌肽通常可分為：對蝦Penaeidins家族抗菌肽（Destoumieux等，1997；Du 和 Jin，2015）、Crustins家族抗菌肽 （Jiang等2015a；Smith等，2008）和抗脂多糖因子（Hoffmann等，2014；Va扎que扎等，2009）等。上述抗菌肽具有相對分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定、殺菌范圍廣、作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn) （Zhu等，2014；Imjongjirak等2011；Rosa和Barracco，2010）。

2 抗菌肽在甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用

2.1 提高免疫能力 當(dāng)甲殼動(dòng)物受到細(xì)菌和病毒等入侵時(shí)，抗菌肽作為先天性的免疫因子，啟動(dòng)機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)，保護(hù)宿主免受侵害。研究表明，Crustins I型基因在紅螯螯蝦的多個(gè)組織中均有表達(dá)，尤以血淋巴中的表達(dá)量最高。進(jìn)一步的分析表明，重組Crustins I蛋白具有強(qiáng)烈的金黃色葡萄球菌抗性 （Yu等，2016）。而在日本囊對蝦中，Crustins I蛋白則表現(xiàn)為明顯的鰻弧菌抗性和金黃色葡萄球菌抗性（Liu等，2015）。在凡納濱對蝦中，研究人員克隆了兩個(gè)Penaeidins基因-Lvapen 2和Lva-pen 3，在細(xì)菌攻毒48 h后，兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，表現(xiàn)為明顯的抗菌特性。深入分析表明，Lva-pen 2和Lva-pen 3分別具有巨大芽胞桿菌抗性和抗蘇云金桿菌抗性 （Du和Jin，2015）。在日本沼蝦中存在5個(gè)Penaeidins基因MnALF1-5，其中MnALF2蛋白具有巨大芽胞桿菌抗性和蠟狀芽孢桿菌抗性（Wang等，2015b）。在日本囊對蝦中，沉默MjALF-E2基因后注射鰻弧菌，日本囊對蝦的死亡率明顯提高，表明MjALF-E2具鰻弧菌抗性（Jiang等，2015b）。而在凡納濱對蝦中的研究表明，ALF基因組中的SNP位點(diǎn)與對蝦白斑綜合癥病毒抗性密切相關(guān)（Liu等，2014a、b）。

有關(guān)抗菌肽的作用機(jī)制還不甚清楚，現(xiàn)在公認(rèn)的是抗菌肽一般通過兩種途徑發(fā)揮作用：一種是抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，形成跨膜通道，改變細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，使細(xì)胞的內(nèi)容物外流，從而使細(xì)胞死亡 （Lohner和Hilpert，2016；Zhang和Gallo，2016）；另一種是抗菌肽能夠直接穿過細(xì)胞膜，并在胞內(nèi)積累。進(jìn)而與胞內(nèi)特異性的靶點(diǎn)相結(jié)合，抑制DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等生物學(xué)過程，從而達(dá)到殺菌的目的 （Lohner和 Hilpert，2016；Zhang和 Gallo，2016）。而在實(shí)際生產(chǎn)中，多是通過向飼料中添加抗菌肽制劑來提高甲殼動(dòng)物的免疫能力。在中華絨螯蟹的日糧中添加0.4%的抗菌肽，飼喂60 d后，可以明顯提高肝臟、肌肉組織中超氧化物歧化酶（SOD）和總抗氧化能力水平，從而提高中華絨螯蟹的免疫能力（王一娟等，2011）。在凡納濱對蝦的日糧中添加10 g/kg的抗菌肽，飼喂30 d后，進(jìn)行10 d的（鰻弧菌）水浴攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，抗菌肽可顯著提高凡納濱對蝦相對增重率、成活率和免疫保護(hù)率，同時(shí)也可提高對蝦的總抗氧化能力（宋理平等，2010）。與在凡納濱對蝦飼料中添加家蠅的抗菌肽結(jié)果類似（陳冰等，2015、2010）。

綜上所述，飼料中添加抗菌肽可以顯著提高甲殼動(dòng)物的免疫能力。一方面可能是抗菌肽在蝦蟹動(dòng)物體內(nèi)直接發(fā)揮殺菌的作用；另一方面可能是抗菌肽可以清除甲殼動(dòng)物血清中過量的氧自由基，從而消除其對機(jī)體生物分子造成的損傷，提高機(jī)體自身的非特異性免疫能力，從而使甲殼動(dòng)物機(jī)體達(dá)到有機(jī)平衡。

2.2 促進(jìn)生長 在凡納濱對蝦的基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的納豆菌抗菌肽，結(jié)果表明，100 mg/kg試驗(yàn)組對蝦的生長速度最快，成活率最高，表明抗菌肽可顯著促進(jìn)凡納濱對蝦的生長 （石廣舉等，2014）。另有研究證實(shí)，飼料中添加抗菌肽新型預(yù)混合劑可使凡納濱對蝦的畝產(chǎn)量提高20.1%，增產(chǎn)效果明顯，且親蝦的孵化率和蝦苗的成活率也顯著提高（歐陽冰等，2013；黃自然等，2006），原因可能在于抗菌肽能有效殺滅霉腐微生物從而保證蝦卵不被霉菌侵蝕。在日本沼蝦的基礎(chǔ)日糧中添加強(qiáng)生肽S807 150 mg/kg，試驗(yàn)組日本沼蝦的平均增長是對照組的1.35倍，產(chǎn)量是對照組的1.7倍（周興旺等，2011）。

由此可見，在飼料中添加適量抗菌肽可以促進(jìn)甲殼動(dòng)物的生長。相關(guān)研究表明，抗菌肽能抑制腸道中的有害微生物，促進(jìn)腸道微生物菌群平衡，保證腸黏膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，提高甲殼動(dòng)物對飼料的消化和吸收，提高餌料系數(shù)，從而促進(jìn)生長。

2.3 甲殼動(dòng)物的保鮮 甲殼動(dòng)物蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)豐富，因此在捕撈、運(yùn)輸和加工過程中極易受到細(xì)菌侵襲而變質(zhì)。低溫冷藏是傳統(tǒng)常用的水產(chǎn)品保鮮方法，但是也不能長久保存，并且不便于長途運(yùn)輸。因此，開發(fā)高效、安全而又長久的生物保鮮劑是當(dāng)前急需解決的課題。而抗菌肽作為新型的微生物保鮮劑已經(jīng)在食品保鮮方面得到廣泛應(yīng)用。

納豆菌抗菌肽APNT-6對凡納濱對蝦中的多種腐敗菌有良好的抑制效果，經(jīng)0.5 mg/mL抗菌肽保鮮劑處理后，可使貨架期延長2～3 d（王東等，2012）。從藍(lán)蟹血淋巴中分離得到的Callinectin蛋白，具有較強(qiáng)的大腸桿菌抗性，濃度為1.44 μmol/L時(shí)便可殺死大腸桿菌。因此，可以用于易被大腸桿菌污染的食品保鮮（Fantle等，1999）。

綜上所述，抗菌肽能夠?qū)讱?dòng)物保鮮的根本原因在于抗菌肽能夠抑制易使蝦蟹腐敗變質(zhì)的細(xì)菌等微生物的滋生。

3 展望

抗菌肽的抗菌機(jī)制包括膜結(jié)構(gòu)破壞模式和非膜結(jié)構(gòu)破壞模式兩種，但具體的作用機(jī)制尚不完全清楚，多數(shù)抗菌肽的作用機(jī)制還建立在模型研究的基礎(chǔ)上。對甲殼動(dòng)物而言，不同抗菌肽的抗菌機(jī)理及效益機(jī)制亦有所不同。因此，針對不同的抗菌肽開展其抗菌機(jī)理及調(diào)控機(jī)制的研究，是闡明甲殼動(dòng)物免疫機(jī)制的基礎(chǔ)。

目前，甲殼動(dòng)物抗菌肽的分離多集中于血淋巴，而且種類一般不超過10種。而在哺乳動(dòng)物中的腸、生殖腺、心臟等多個(gè)組織中都發(fā)現(xiàn)有抗菌肽的存在。研究表明，在擬穴青蟹射精管中發(fā)現(xiàn)可能生殖免疫相關(guān)的Scygonadin2（SCY2）（Qiao等，2016）。表明甲殼動(dòng)物除血淋巴之外的其他組織也可能分泌抗菌肽，與此有關(guān)的報(bào)道還較少，是今后研究的熱點(diǎn)。

甲殼動(dòng)物幼體和成體在形態(tài)結(jié)構(gòu)上截然不同，并且幼體和成體均存在蛻皮變態(tài)現(xiàn)象。在蛻皮后至外骨骼未完全硬化之前，其軀體呈現(xiàn)為一個(gè)“柔軟的肉團(tuán)”，這時(shí)極易受到水中細(xì)菌等病原微生物的攻擊，抗菌肽作為免疫因子必然在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，開展不同發(fā)育階段特別是蛻皮后期相關(guān)抗菌肽的研究，有助于全面解析抗菌肽在甲殼動(dòng)物中的作用機(jī)制。

抗菌肽作為來源于甲殼動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性小分子蛋白，殺菌效果明顯，并且將細(xì)菌降至安全濃度后，甲殼動(dòng)物體內(nèi)的蛋白酶便可將其降解，檢測不到殘留物，也不會使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥性。因此，尋求、設(shè)計(jì)適用于甲殼動(dòng)物的新型抗菌肽，來替代傳統(tǒng)的抗生素也是當(dāng)前亟待解決的課題。

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Crustacean have only innate immune system that is different from that of vertebrate.Antimicrobial peptide is a kind of biological peptides with antimicrobial activity，which play an important role in crustaceans immune system.This paper reviewed the research progress of antimicrobial peptides in crustacean and its application prospects in the future.

antimicrobial peptide；immune；growth；crustaceans

S966.1

A

1004-3314（2017）02-0022-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170206

山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2016CM12）；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J16LE59）

*通訊作者