EMT在大腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的作用及分子機(jī)制研究

向德兵，董 蕻，全 晉，孫貴銀△，李夢俠，王 東

(1.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科 402260；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042)

EMT在大腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥中的作用及分子機(jī)制研究

目的 探討上皮-間葉轉(zhuǎn)化(EMT)在大腸癌耐藥中的作用及分子機(jī)制。方法 采用藥物濃度遞增的方法建立大腸癌LOVO細(xì)胞奧沙利鉑(L-OHP)耐藥細(xì)胞株LOVO/L-OHP，免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)檢測LOVO和LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)；Westernblot檢測核轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist表達(dá)；噻唑藍(lán)(MTT)檢測細(xì)胞增殖。結(jié)果 與LOVO細(xì)胞比較，LOVO/L-OHP皮表型消失，細(xì)胞膜E-cadherin表達(dá)減弱(22.63±3.25)%(P<0.01)，獲得間葉細(xì)胞表型，表達(dá)Vimentin(475.42±58.36)%(P<0.01)。LOVO/L-OHP細(xì)胞株Twist表達(dá)輕度增加(116.42±18.36)%(P>0.05)，Snail表達(dá)顯著增加(382.18±41.33)%(P<0.01)。siSnail上調(diào)E-cadherin表達(dá)(246.82±31.57)%(P<0.01)，下調(diào)Vimentin表達(dá)(28.75±3.96)%(P<0.01)；siSnail顯著增強(qiáng)LOVO/L-OHP細(xì)胞株L-OHP化療敏感性，對照組和siSnail組的IC50分別為23.75μg/mL和12.42μg/mL。結(jié)論EMT在大腸癌細(xì)胞L-OHP耐藥中可能起重要作用，抑制EMT可恢復(fù)耐藥細(xì)胞化療敏感性。

結(jié)直腸腫瘤；上皮細(xì)胞；奧沙利鉑；RNA，小分子干擾；Snail

大腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，化療是大腸癌綜合治療的主要方法之一，奧沙利鉑是大腸癌的一線化療藥物，但腫瘤細(xì)胞獲得性耐藥是腫瘤化療失敗的主要原因，其發(fā)生機(jī)制目前仍不十分清楚。上皮-間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 現(xiàn)象在上皮源性腫瘤細(xì)胞中普遍存在，其重要特征就是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜E-cadherin、β-catenin等上皮標(biāo)記表達(dá)缺失，獲得間葉細(xì)胞表型，表達(dá)Vimentin，細(xì)胞黏附能力減弱，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。近年的研究顯示，EMT可能參與了肺癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞耐藥[1-4]。本項(xiàng)目建立大腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株，比較耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞表型差異及EMT信號途徑關(guān)鍵分子(E-cadherin、Vimentin、Snail、Twist等)的表達(dá)差異， 抑制EMT信號途徑對耐藥細(xì)胞化療敏感性的影響，以期獲得EMT參與大腸癌耐藥的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人大腸癌LOVO細(xì)胞株引自美國ATCC。LipofectAmineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體、MTT和二甲亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，鼠抗人E-cadherin、Vimentin、Snail和Twist單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，抗鼠IgG-HRP二抗、IgG-TRITC二抗和化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Pierce公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。奧沙利鉑(L-OHP)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸癌L-OHP耐藥細(xì)胞株LOVO/L-OHP的建立 采用藥物濃度遞增的方法。取對數(shù)生長期LOVO細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，加入終濃度為0.5 μg/mL的L-OHP培養(yǎng)液連續(xù)作用48 h，棄去上清液；加入不含L-OHP的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，消化傳代，再用含終濃度為0.5 μg/mL的L-OHP培養(yǎng)液連續(xù)作用細(xì)胞48 h。如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高L-OHP的濃度 ，當(dāng)細(xì)胞在含2 μg/mL的L-OHP培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長時，以含加倍濃度大劑量L-OHP作用LOVO細(xì)胞，最終獲得對L-OHP耐藥的LOVO細(xì)胞，即LOVO/L-OHP。

1.2.2 Snail siRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Snail siRNA和對照siRNA序列根據(jù)課題組以前的文獻(xiàn)[5]，兩端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)粘端，分別合成發(fā)卡樣單鏈DNA,退火后與siRNA載體pSilencer連接。隨機(jī)選取兩個轉(zhuǎn)化菌隔夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，對插入序列進(jìn)行測序。得到重組載體pSilencer-Snail siRNA和pSilencer-Control siRNA，簡稱siSnail 和siCon。按LipofectAmineTM2000操作說明轉(zhuǎn)染LOVO/L-OHP細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后換液,加入含有抗生素的完全培養(yǎng)基37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞存活率 常規(guī)培養(yǎng)LOVO/L-OHP細(xì)胞，以4×103/孔接種于96孔板培養(yǎng)，24 h后吸除原培養(yǎng)液，更換新RPMI 1640培養(yǎng)液，以0～100 μmol/L的L-OHP處理細(xì)胞，另設(shè)只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞和藥物的為空白組。每組3個復(fù)孔。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，每孔加20 μL MTT (5 g/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。

1.2.4 免疫熒光染色 對數(shù)期生長的LOVO及LOVO/L-OHP細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)蓋玻片上，每孔1×105個細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后免疫熒光染色檢測E-cadherin和Vimentin表達(dá)。蓋玻片預(yù)冷甲醇固定10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，0.5% Triton X-100室溫15 min，PBS沖洗2次，然后以30 mL/L正常山羊血清工作液封閉30 min，吸掉封閉液，加入鼠抗人一抗(1∶1 000)溶液，4 ℃過夜。PBS沖洗2次，加入羊抗小鼠IgG-TRITC二抗溶液(稀釋度1∶500)，37 ℃孵育30 min。PBS沖洗2次，加入200 μg/mL RNA酶，室溫下孵育30 min；加入5 μmol/L 核酸熒光染料TOPRO-3復(fù)染 5 min，PBS沖洗2次。自然晾干切片，緩沖甘油封片，在Leica TCS SP激光共聚焦顯微鏡下觀察和掃描。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.5 Western blot分析 收集細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度為10%,積層膠濃度為5%)。電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5 %脫脂奶粉封閉后，加入一抗，4 ℃孵育過夜后室溫下?lián)u床孵育1 h，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫下?lián)u床孵育1 h。以ECL 試劑盒顯色。用Bio-Rad公司Quantity one凝膠掃描分析系統(tǒng)掃描X線片，Labwork 3.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，測定各條帶光密度值，結(jié)果以積分光密度值(IOD)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以CalcuSyn Demo Version 2統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50。以SPSS 17.0 版專用統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)Ω鹘M數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大腸癌LOVO/L-OHP細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 建立了大腸癌L-OHP耐藥細(xì)胞株LOVO/L-OHP，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了EMT，上皮細(xì)胞特性消失，具有間葉細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞極性消失，排列松散，出現(xiàn)較多偽足。見圖1。

圖1 耐藥細(xì)胞株LOVO/L-OHP細(xì)胞形態(tài)學(xué)(×400)

2.2 大腸癌LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá) 免疫熒光檢測結(jié)果顯示LOVO/L-OHP上皮表型消失，細(xì)胞膜E-cadherin表達(dá)減弱，獲得間葉細(xì)胞表型，表達(dá)Vimentin，見圖2。Western blot結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致，分別以LOVO細(xì)胞的E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平為100%，LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平為(22.63±3.25)%(P<0.01)，Vimentin表達(dá)水平為(475.42±58.36)%(P<0.01)，見圖3。

圖2 免疫熒光檢測LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)(×200)

圖3 Western blot檢測LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)

2.3 大腸癌LOVO/L-OHP細(xì)胞Snail和Twist表達(dá) 分別以LOVO細(xì)胞的Snail和Twist表達(dá)水平為100%，LOVO/L-OHP細(xì)胞Snail表達(dá)水平為(382.18±41.33)%(P<0.01)，Twist表達(dá)水平為(116.42±18.36)%(P>0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測LOVO/L-OHP細(xì)胞Snail和Twist表達(dá)

2.4 siSnail對LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)的影響 siSnail和對照siCon轉(zhuǎn)染LOVO/L-OHP細(xì)胞48 h后，Western blot檢測LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)，分別以對照組siCon的E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平為100%，siSnail組E-cadherin 表達(dá)水平為(246.82±31.57)%(P<0.01)，Vimentin表達(dá)水平為(28.75±3.96)%(P<0.01)。見圖5。

圖5 Western blot檢測LOVO/L-OHP細(xì)胞轉(zhuǎn)染siSnail后E-cadherin和Vimentin表達(dá)

圖6 不同劑量L-OHP處理后LOVO/L-OHP細(xì)胞存活曲線

2.5 siSnail體外增強(qiáng)LOVO/L-OHP細(xì)胞L-OHP化療敏感性 L-OHP作用72 h后LOVO/L-OHP細(xì)胞的存活曲線圖可見，隨著L-OHP濃度的增加，LOVO/L-OHP細(xì)胞存活率逐漸下降，與對照組siCon比較，siSnail組下降更明顯，L-OHP每個劑量點(diǎn)均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siCon和siSnail 組的IC50分別為23.75 μg/mL和12.42 μg/mL。見圖6。

3 討 論

EMT是指上皮組織喪失上皮特征而獲得間葉的表型，是上皮細(xì)胞在特定的生理或病理情況下向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，是胚胎發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)等過程中的基礎(chǔ)過程。大量的研究發(fā)現(xiàn)EMT在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[6]。新近研究發(fā)現(xiàn)EMT在腫瘤化療耐藥中可能起更重要的作用[7]。順鉑和培美曲塞耐藥的肺癌細(xì)胞、氟尿嘧啶耐藥的乳腺癌細(xì)胞、吉西他濱耐藥的胰腺癌細(xì)胞等均出現(xiàn)了典型的EMT形態(tài)學(xué)改變和表型特征[1-4]，且抑制EMT可恢復(fù)耐藥細(xì)胞化療敏感性[4]。因此上皮源性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT在化療藥物耐藥中可能發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步探討EMT在大腸癌細(xì)胞L-OHP耐藥中的作用及分子機(jī)制具有重要的意義。

本研究建立了大腸癌L-OHP耐藥細(xì)胞株LOVO/L-OHP，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)LOVO/L-OHP細(xì)胞的上皮細(xì)胞特性消失，具有間葉細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，出現(xiàn)較多偽足。免疫熒光及Western blot檢測結(jié)果顯示LOVO/L-OHP細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減弱，獲得間葉細(xì)胞表型，表達(dá)Vimentin。因此大腸癌L-OHP耐藥細(xì)胞出現(xiàn)了典型的EMT表型特征。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素耐藥的大腸癌細(xì)胞也發(fā)生了EMT，其機(jī)制與阿霉素上調(diào)TGF-β信號有關(guān)；Toden等[9]在氟尿嘧啶耐藥的大腸癌細(xì)胞也觀察EMT現(xiàn)象，且抑制EMT可恢復(fù)耐藥細(xì)胞化療敏感性。EMT 的機(jī)制主要由于上皮細(xì)胞本身或周圍微環(huán)境改變，導(dǎo)致一系列信號傳導(dǎo)途徑激活，細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控作用。不同程度的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程是由精確的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)控，細(xì)胞外多種信號通過與細(xì)胞表面特異受體結(jié)合，活化不同的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子的共同特征是含有能識別靶基因啟動子上的E-box基序的DNA 結(jié)合序列，從而調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，啟動EMT。Snail已被證明與上皮性腫瘤進(jìn)展過程中觸發(fā)EMT有關(guān)，是EMT發(fā)生的關(guān)鍵點(diǎn)。Snail的表達(dá)與E-cadherin的減少或缺失相關(guān)，而且充當(dāng)E-cadherin 轉(zhuǎn)錄的直接抑制子[10]。Twist 是另一個調(diào)控EMT 的重要轉(zhuǎn)錄因子，其誘導(dǎo)EMT的機(jī)制即通過E-box基序直接或間接結(jié)合E-cadherin啟動子，從而抑制E-cadherin表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與親代大腸癌LOVO細(xì)胞比較，LOVO/L-OHP細(xì)胞Snail表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，Twist表達(dá)輕微升高(P>0.05)。進(jìn)一步構(gòu)建siSnail表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染LOVO/L-OHP細(xì)胞后可逆轉(zhuǎn)EMT，E-cadherin 表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Vimentin表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，且siSnail可顯著增強(qiáng)LOVO/L-OHP細(xì)胞L-OHP化療敏感性。因此，研究結(jié)果顯示大腸癌L-OHP耐藥及EMT可能主要是通過Snail轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實(shí)大腸癌L-OHP耐藥細(xì)胞發(fā)生EMT，上皮表型消失，獲得間葉細(xì)胞表型，其機(jī)制可能與L-OHP誘導(dǎo)Snail表達(dá)升高有關(guān)。本研究為深入探索大腸癌細(xì)胞L-OHP耐藥的分子機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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The role and molecular mechanism of epithelial-mesenchymal transition in chemoresistance to oxaliplatin in colorectal cancer cells*

XiangDebing1,DongHong1,QuanJin1,SunGuiyin1△,LiMengxia2,WangDong2

(1.DepartmentofOncology,JiangjinCentralHospital,Chongqing402260,China;2.CancerCenter,ResearchInstituteofFieldSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To investigate the role and molecular mechanism of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in chemoresistance to oxaliplatin in colorectal cancer cells.Methods Oxaliplatin resistant LOVO/L-OHP cells were established by gradually increasing the concentration of oxaliplatin and intermittent treatment with high-dose concentration on parental cells (LOVO).The expression of E-cadherin and Vimentin was detected by indirect immunofluorescence and Western blot analysis.The expression of Snail and Twist was detected by Western blot analysis. cell proliferation was detected by MTT.Results Compared with LOVO cells,the epithelial phenotype of LOVO/L-OHP cell line was lost,and the expression of E-cadherin was decreased (22.63±3.25)% (P<0.01),an increase in the mesenchymal marker Vimentin (475.42±58.36)%(P<0.01).LOVO/L-OHP cell line Twist expression was slightly increased (116.42±18.36)% (P>0.05),Snail expression was significantly increased (382.18±41.33)% (P<0.01).The expression of siSnail increased E-cadherin (246.82±31.57)% (P<0.01).The expression of Vimentin (28.75±3.96)% (P<0.01);siSnail significantly enhanced sensitivity to oxaliplatin based chemotherapy in LOVO/L-OHP cell line,IC50control group and siSnail group were 23.75 μg/mL and 12.42 μg/mL.Conclusion EMT may play an important role in chemoresistance to oxaliplatin in colorectal cancer cells,inhibition of EMT can restore chemosensitivity of resistant colorectal cancer cells

colorectal neoplasms;epithelial cells;oxaliplatin;RNA,small interfering;Snail

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972874)；重慶市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會科研項(xiàng)目(2011-2-445，2011-2-447，2012-1-106，2012-2-381)。 作者簡介：向德兵(1972-)，主任醫(yī)師，博士，主要從事大腸癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)治療研究?！?/p>

E-mail:Sunriseok@126.com。

向德兵1，董 蕻1，全 晉1，孫貴銀1△，李夢俠2，王 東2

(1.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科 402260；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042)

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1671-8348(2016)36-5045-04

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2016-09-16)