黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶動力學研究

江賢君 ,魏正平

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院,湖北 武漢 430023;2.湖北天沁生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,湖北 孝感 432000)

黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶動力學研究

江賢君1,魏正平2

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院,湖北 武漢 430023;2.湖北天沁生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,湖北 孝感 432000)

以玉米粉和麩皮等混合物為發(fā)酵培養(yǎng)基，進行黑曲霉產(chǎn)糖化酶固態(tài)發(fā)酵動力學研究。用氨基葡萄糖含量表征生物量，通過試驗數(shù)據(jù)用R語言進行數(shù)據(jù)建模建立黑曲霉固態(tài)發(fā)酵細胞生長和酶合成Logistic動力學方程。以酶合成Logistic動力學方程為基礎(chǔ)考察了溫度和水分對酶合成的影響，結(jié)果表明用R語言擬合的Logistic動力學方程可用于固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化研究。

黑曲霉；糖化酶；動力學；R語言；固態(tài)發(fā)酵

1 引言

黑曲霉在生長過程中分泌的糖化酶是一類酸性糖苷水解酶，它能水解淀粉α-1，4、α-1，6等糖苷鍵生成葡萄糖。糖化酶廣泛地應(yīng)用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有機酸、甘油、淀粉糖等工業(yè)中。目前，酶制劑的生產(chǎn)有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種方法，固態(tài)發(fā)酵雖然歷史悠久，但由于其參數(shù)不易檢測、過程不易控制、勞動強度大等缺點發(fā)展一直非常緩慢，但固態(tài)發(fā)酵相對于液態(tài)發(fā)酵有許多優(yōu)點，如能耗小、工藝操作簡單、廢水少、微生物在接近自然條件下生長、克服了液體深層培養(yǎng)中酶合成的分解代謝阻遏、酶活力高等[1,2]。隨著科技的發(fā)展和機械化水平的提高，固態(tài)發(fā)酵因其固有的優(yōu)點近些年逐漸成為研究熱點。

用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶在規(guī)模上遠不及液態(tài)發(fā)酵，除了上述固態(tài)發(fā)酵缺點外，理論上固態(tài)發(fā)酵缺乏動力學支持也是生產(chǎn)停留在經(jīng)驗化生產(chǎn)水平的重要原因。研究人員對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶研究主要集中在菌種選育和培養(yǎng)基配方等方面[3]，對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶動力學研究鮮有報道。本研究以生態(tài)學領(lǐng)域的logistic方程為基礎(chǔ)，通過試驗獲得黑曲霉生長和產(chǎn)酶數(shù)據(jù)，再用R語言進行數(shù)據(jù)建模確立黑曲霉生長和產(chǎn)酶Logistic動力學方程[4]，并從動力學角度考察固態(tài)發(fā)酵重要影響因素溫度和水分對黑曲霉產(chǎn)酶影響，以期為固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化提供實用有效方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌種

黑曲霉TQ1201(Aspergillus niger)：湖北天沁生態(tài)科技有限公司提供。

2.1.2 培養(yǎng)基[5]

斜面菌種培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基(PDA)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉:麩皮:豆餅粉:米糠=2:2:1:0.5，(NH4)2SO41.0%，加水比1:1.2。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)方法

種子制備：將長滿成熟孢子的活化2次的斜面培養(yǎng)基用無菌生理鹽水洗滌，倒入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，再在120 rpm的搖床中震蕩30 min，用滅菌后的脫脂棉濾去菌絲片段，制得單孢子懸浮液作為種子。

淺盤發(fā)酵：取若干個250 mL三角瓶，每瓶加入10 g配好的發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃、1.01×105 Pa滅菌30 min。冷卻到35 ℃接入孢子懸浮液，搖勻攤平，然后在霉菌培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔12小時進行測定。每瓶操作保持一致。

2.2.2 分析方法

酶活力的測定:按GB8276-2006 食品添加劑糖化酶制劑進行，酶比活力為IU/g。

菌體量測定[6,7,8]:固態(tài)發(fā)酵因為菌絲和基質(zhì)纏織在一起，直接計量生物量非常困難，一般通過間接法計量。由于氨基葡萄糖是參與構(gòu)成真菌細胞壁中幾丁質(zhì)的主要成分，因此用氨基葡萄糖含量可表示菌體量。

將固態(tài)發(fā)酵樣品(3個平行樣)在105 ℃下烘干至恒重，稱取0.5 g干燥樣品，加入10 mL濃鹽酸，在室溫下浸泡24 h，在2 000 rpm下離心，取上清液5 mL，加2 mL蒸餾水稀釋，放入封口試管中，沸水浴水解2 h，用30%NaoH溶液中和至中性，在15 000 rpm下離心，上清液即為氨基葡萄糖溶液。

采用Elson-Morgan法測定氨基葡萄糖濃度，將2 mL氨基葡萄糖溶液與1 mL乙酰丙酮試劑混合，置人沸水中30 min，冷卻后加人2 mL無水乙醇，1 mL對二氨基苯甲醛試劑，振蕩，再加入4 mL無水乙醇，在60 ℃下保溫1 h，在530 nm下測定吸光值(以蒸餾水為空白對照)，以測定的吸光值(OD)表征菌體量。

3 結(jié)果與討論

3.1 黑曲霉淺盤發(fā)酵菌體生長和糖化酶合成

按2.2.1的方法淺盤固態(tài)培養(yǎng)黑曲霉，培養(yǎng)過程測定氨基葡萄糖和糖化酶酶活，結(jié)果如圖1所示。

圖1 黑曲霉生長和酶合成曲線圖

由圖1可以看出，在接種后黑曲霉生長和酶合成有一段約10小時左右延遲期，之后進入指數(shù)期，在第3天到第4天進入平衡期，此時菌體量和糖化酶比活力都達到最大值，試驗中黑曲霉已布滿整個培養(yǎng)基。由圖1還可以看出黑曲霉生長和糖化酶合成均呈S型曲線，同時，糖化酶的合成與黑曲霉的生長呈偶聯(lián)型關(guān)系，因為黑曲霉必須籍由糖化酶水解淀粉得以生長。

3.2 數(shù)據(jù)建模擬合動力學方程

在微生物學中描述菌體生長常用Monod方程，Monod方程在液態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下描述細菌、酵母等單細胞微生物生長比較理想，但不適合高等生物尤其在固態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)過程。在生態(tài)學領(lǐng)域描述在資源有限條件下種群增長規(guī)律的最佳數(shù)學模型是Logistic方程。Logistic方程指出當一個物種遷入到一個新生態(tài)系統(tǒng)中后，其數(shù)量會發(fā)生變化，當物種的起始數(shù)量小于環(huán)境的最大容納量時，數(shù)量會增長，且增長呈自抑制，生長曲線呈S形。因此，Logistic方程適合真菌的固態(tài)培養(yǎng)過程，其數(shù)學表達式為：

當初始條件為t=0，x=x0時，積分上式可得：

式中：x —菌體量(菌體量以氨基葡萄糖含量表示，即OD值)

um—最大比生長速率(h-1)

xm—最大菌體量

x0—初始菌體量

t—時間(h)

以3.1的試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，用開源R語言(版本R×643.3.1)對黑曲霉生長進行數(shù)據(jù)擬合，在R控制臺輸入如下代碼：

x=c(0,12,24,36,48,60,72,84,96) #()中為時間序列；

y=c(0.02,0.10,0.38,0.98,1.55,1.8,1.93,1.95,1.95) #()中與時間序列對應(yīng)的氨基葡萄糖含量序列(OD值)；

S<- getInitial(y～ SSlogis(x, alpha, xmid, scale),

data = data.frame(y= y, x = x)

xm<- S["alpha"]

um<- 1/S["scale"]

x0<- S["alpha"]/(exp(S["xmid"]/S["scale"])+1)

f<-formula(y～xm*x0*exp(um*x)/

(xm+x0(exp(um*x)-1)))

m <- nls(f, start=list(xm=xm,um=um,x0=x0))

summary(m)

cor(y, predict(m))

R在控制臺即輸出擬合結(jié)果，截圖如圖2所示。

圖2 R輸出擬合結(jié)果

從圖2可以看到xm=1.9486，um= 0.115，x0= 0.029986(擬合優(yōu)度>0.99，各參數(shù)P值?0.05)，因此，黑曲霉生長動力學方程為：

依同樣方法可以得出糖化酶合成動力學方程為(在酶合成動力學中，μm、xm、x0三個參數(shù)分別對應(yīng)比合成速率、最大比活力、初始比活)：

再用R語言繪圖函數(shù)plot()對3.1試驗數(shù)據(jù)和擬合得到的Logistic方程曲線作圖以檢驗R語言擬合效果，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 黑曲霉試驗數(shù)據(jù)與生長Logistic曲線圖

圖4 糖化酶試驗數(shù)據(jù)與酶合成Logistic曲線圖

從圖3和圖4可以看出，試驗數(shù)據(jù)與用R語言擬合出的Logistic方程曲線重合度很好，說明用R語言擬合得到的黑曲霉生長動力學方程和酶合成動力學方程可靠，也說明生態(tài)學領(lǐng)域的Logistic方程適合固態(tài)發(fā)酵過程。

3.3 溫度對糖化酶合成的影響

溫度是影響固態(tài)發(fā)酵重要因素，按2.2.1方法分別在25 ℃、30 ℃和35 ℃下進行固態(tài)發(fā)酵，其他條件保持不變。對比在25 ℃、30 ℃和35 ℃三個不同溫度下產(chǎn)酶情況，結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對酶合成的影響

從圖5可以看出，在25 ℃、30 ℃和35 ℃三個不同溫度下黑曲霉固態(tài)發(fā)酵，以30 ℃酶活最高，在25 ℃下培養(yǎng)酶活峰值接近30 ℃酶活，但發(fā)酵時間延長。在35 ℃條件下培養(yǎng)情況最差，無論酶活峰值還是速率都較低，說明黑曲霉不宜在較高溫度下發(fā)酵。

不同溫度條件下酶合成曲線都成S形，按照3.2的數(shù)據(jù)建模方法用R語言進行不同溫度條件下產(chǎn)酶動力學Logistic擬合，得到相應(yīng)的Logistic動力學參數(shù)見表1(擬合優(yōu)度均大于0.99，P<0.05)。

表1 不同溫度下擬合酶合成Logistic動力學參數(shù)表

項目30℃25℃35℃um0．130．110．08xm147731468711893x0135122153

3.4 水分對糖化酶合成的影響

在固態(tài)發(fā)酵中溫度、水分和空氣是影響發(fā)酵的三個重要因素，對于淺盤培養(yǎng)空氣不是限制因素，所以除溫度外，水分是另一個重要參數(shù)了。淺盤培養(yǎng)水分均由配料時加水比控制，培養(yǎng)過程不添加水分。這里比較了加水比為1:0.8、1:1.2和1:1.6三種情況下黑曲霉產(chǎn)糖化酶動力學，培養(yǎng)溫度為30 ℃，其它條件不變，結(jié)果如圖6所示。

圖6 水分對酶合成的影響

由圖6可以看出，當水分為1:0.8時，剛開始黑曲霉生長旺盛，產(chǎn)酶速率也高，隨著時間進行，由于水分蒸發(fā)產(chǎn)酶速度下降，而且酶活峰值最低。水分為1:1.6時，剛開始因為水分阻礙了氧的傳遞，表現(xiàn)生長很慢，產(chǎn)酶也低，隨著時間進行，水分蒸發(fā)一部分，導致后期產(chǎn)酶速率略有加快，而且產(chǎn)酶峰值較水分1:0.8情況下要高。當水分為1:1.2時，無論產(chǎn)酶速率還是酶活峰值都最高，所以水分以1:1.2為宜。

不同水分條件下酶合成曲線都成S形，按照3.2的數(shù)據(jù)建模方法用R語言進行不同水分條件下產(chǎn)酶動力學Logistic擬合，得到相應(yīng)的Logistic動力學參數(shù)見表2(擬合優(yōu)度均大于0.99，P<0.05)。

表2 不同水分下擬合酶合成Logistic動力學參數(shù)表

項目1：1．21：1．61：0．8um0．130．100．125xm147731288911764x0135121160

4 結(jié)論

本試驗進行了黑曲霉產(chǎn)糖化酶動力學研究，通過R語言對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)建模，得到黑曲霉生長Logistic動力學方程和酶合成Logistic動力學方程，通過擬合驗證表明數(shù)據(jù)建模得到的動力學方程擬合優(yōu)度高，動力學方程可靠。

淺盤固態(tài)發(fā)酵中溫度和水分是影響微生物生長和產(chǎn)物合成最重要因素。本試驗以數(shù)據(jù)建模得到的酶合成Logistic動力學方程為基礎(chǔ)，研究了溫度和水分對黑曲霉產(chǎn)糖化酶的影響，試驗結(jié)果表明操作變量改變Logistic動力學參數(shù)隨之改變，這種動力學研究方法可以為固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化提供理論技術(shù)支持。

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Study on the kinetics of glucoamylase production by solid-state fermentation of aspergillus niger

JIANG Xian-jun1, WEI Zheng-ping2

(1.School of Biology and Pharmaceutical Engeering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023,China;2.Hubei Tian qin Ecological Agriculture Development Co.,Ltd, Xiaogan 432000, China)

In this paper, kinetics of glucoamylase production by solid-state fermentation was studied by using the mixture of corn flour and wheat bran as substrates. With measured glucosamine for biomass estimation, Logistic models for Aspergillus niger growth and glucoamylase production were proposed and the model parameters were fitted by using R language. Based on the Logistic model of enzyme synthesis ,the effect of temperature and moisture on the enzymatic synthesis was investigated. Results show that the Logistic dynamics using R language fitting equation can be used in solid-state fermentation condition optimization research.

Aspergillus niger ; glucoamylase ;kinetics; R language; solid-state fermentation

2016-06-10.

江賢君(1962-),男,副教授,E-mail:1098377885@qq.com.

2095-7386(2016)04-0022-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.04.004

Q55

A