microRNAs在結(jié)直腸癌患者糞便中的表達(dá)及其臨床意義

肖興元 王永強(qiáng)△ 楊潔 張大平 徐健 楊熊飛

(1.昆山市第一人民醫(yī)院肛腸外科，江蘇 昆山 215300；2.甘肅省人民醫(yī)院肛腸外科，甘肅 蘭州 730000)

?

microRNAs在結(jié)直腸癌患者糞便中的表達(dá)及其臨床意義

肖興元1王永強(qiáng)1△楊潔1張大平1徐健1楊熊飛2

(1.昆山市第一人民醫(yī)院肛腸外科，江蘇 昆山 215300；2.甘肅省人民醫(yī)院肛腸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143在結(jié)直腸癌(CRC)患者中的表達(dá)特點(diǎn)，評(píng)價(jià)糞便中microRNAs的表達(dá)水平檢測(cè)對(duì)于CRC的診斷價(jià)值。方法：采用病理對(duì)照研究方式，選取47例CRC患者以及30例健康體檢者進(jìn)行對(duì)比研究，采集納入人群的糞便標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)患者檢測(cè)其糞便中的miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143表達(dá)水平，并比較16例行CRC根治性手術(shù)患者于術(shù)前1 d以及術(shù)后7 d糞便中的miRNAs的變化情況。結(jié)果：CRC患者糞便中的miR-16、miR-21、miR-106a表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，在CRC患者腫瘤切除后7 d其糞便的miR-16以及miR-106a的表達(dá)水平明顯低于術(shù)前(P<0.05)。結(jié)論 miR-16、miR-21、miR-106a可以作為結(jié)直腸癌的新的腫瘤標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌； 微小RNAs； 糞便

我國(guó)結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)病率逐年增高，結(jié)直腸腫瘤的早期診斷和治療能延長(zhǎng)患者生存期，提高生存質(zhì)量，降低社會(huì)醫(yī)療成本。成熟的微小RNA(microRNAs，miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA，對(duì)基因表達(dá)起到調(diào)節(jié)作用[1]。miRNA的特異性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，甚至起到抑癌基因或癌基因的效果。研究[2]發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)的miRNAs有十幾種，其中常見(jiàn)的有miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143。本研究旨在探討聯(lián)合檢測(cè)糞便中的上述標(biāo)志物在診斷CRC及其主要早期病變CRA中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月至2014年1月間于我院住院治療的47例結(jié)直腸癌患者(結(jié)直腸癌組)，其中男29例，女18例，年齡43～73歲，平均年齡(57.2±3.7)歲，均經(jīng)術(shù)后病理確診為腺癌，入院前未予以任何放化療處理；其中結(jié)腸癌32例、直腸癌15例。病理學(xué)類型：中分化30例、低分化17例。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。選取同時(shí)期于我院行健康體檢者30例作為健康對(duì)照組，其中男18例，女12例，年齡42～75歲，平均年齡(55.9±5.3)歲，兩組患者的年齡、性別等基本資料間比較無(wú)明顯差異，具有可比性，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 制備標(biāo)本 將糞便標(biāo)本收集后加入40 mL的緩沖液[含有Hanks溶液、10%胎牛糞便以及25 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)緩沖液，pH值為7.35]中將其混勻，以200 r/min的速度離心1 min，離心半徑18 cm，隨后利用孔徑為512 μm的濾紙作過(guò)濾處理。向?yàn)V液中加入80 μL免疫磁珠，在室溫下孵育45 min，隨后在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取RNA 將500 μL標(biāo)本置于離心管中，在75 ℃條件下預(yù)熱5 min，42 ℃條件下孵育1 h，提取RNA。具體步驟：向處理后的樣本中加入等體積的TRIzol試劑，混勻，室溫下靜置5 min；加入200 μL三氯甲烷，振蕩15 s后繼續(xù)靜置2 min；4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液；加入等體積異丙醇，混勻，-20 ℃沉淀過(guò)夜后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液；向沉淀中加入500 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7的乙醇，將沉淀洗滌，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，棄上清液；將沉淀晾干，用適量焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液將其溶解，得到純化后的RNA樣本。

1.2.3 miRNAs定量分析 實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)10 μL預(yù)處理過(guò)的RNA樣本。糞便標(biāo)本中的內(nèi)參照為U6小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)L4J。具體過(guò)程：加入1 μL 2 μmol/L引物、1 μL 10 mmol/L=磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、4 μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL RNase抑制劑、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶、1 μL 0.1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)溶液。反應(yīng)總體積為20 μL，在16 ℃中反應(yīng)5 min，42 ℃中反應(yīng)1 h，82 ℃中反應(yīng)5 min。取2 μL反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系為2.5 μL 10×PCR擴(kuò)增緩沖液、0.5 μL 2.5mmol/LdNTP、1 μL熒光綠染料(SYBRGreenI)、0.2 μL 5U/μL Taq、1 μL擴(kuò)增引物，加去離子水使反應(yīng)體系達(dá)25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，每份樣本重復(fù)2次。測(cè)定mi-R21、miR-106a及其內(nèi)參照的Ct(thresholdcycle)值，△Ct-Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因，miR-16、miR-21、miR-29a、miR-106a及miR-143的相對(duì)含量為2-△Ct。

2 結(jié) 果

2.1 五種miRNAs在CRC患者糞便中的表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照相比，miR-16、miR-21 及miR-106a在結(jié)直腸癌患者糞便中的表達(dá)水平明顯升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而miR-29a以及miR-143在兩組患者糞便中的表達(dá)水平之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 miRNAs在兩組間的表達(dá)水平比較

2.2 不同分化程度結(jié)直腸癌患者的糞便miR-16、miR21 及miR-106a表達(dá)比較 根據(jù)患者的術(shù)后病理診斷結(jié)果將47例結(jié)直腸癌不同分化程度，將CRC患者分為中分化30例以及低分化17例，結(jié)果顯示，miR-16、miR-21 及miR-106a表達(dá)水平在中、低分化組中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同分化CRC患者的miR-16、 miR-21 及miR-106a表達(dá)水平比較

2.3 手術(shù)前后結(jié)CRC患者的糞便miRNAs水平比較 對(duì)于行結(jié)直腸癌根治手術(shù)治療的16例患者，比較手術(shù)前1 d以及術(shù)后7 d的糞便miRNAs的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-16以及miR-106a表達(dá)水平于術(shù)后7 d的表達(dá)水平明顯降低，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而miR-21在術(shù)后的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 手術(shù)前后患者的miRNAs水平比較

3 討 論

現(xiàn)在對(duì)于CRC早期診斷的主要方法有糞便隱血檢查、結(jié)腸鏡檢查、鋇灌腸氣鋇雙重造影以及糞便RNA特異性基因檢測(cè)等[2]。結(jié)腸鏡檢查的靈敏度雖較高，對(duì)于高危人群或疑似患者的檢查能夠有效降低結(jié)直腸癌患者的死亡率[3]。但是其需要較高的檢查費(fèi)用，檢查準(zhǔn)備工作較為繁瑣，檢查過(guò)程難免痛苦，人群接受率不高。目前還不能進(jìn)行推廣。有研究[4-5]指出結(jié)直腸腫瘤特異性DNAs1以及RNAs等標(biāo)志物的檢測(cè)效果較好，其中miRNA可能作為一個(gè)預(yù)后的良好指標(biāo)。有研究[6]指出不同的腫瘤都具有各自不種類型的特異性miRNAs表達(dá)譜，應(yīng)用高通量微陣列芯片技術(shù)分析了前列腺癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌及肺癌糞便miRNAs表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)患者的糞便miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)能夠有效辨別腫瘤的類型。S.Mi等[7]研究證實(shí)miR-106a以及和miR-173p在結(jié)直腸癌患者的血漿中明顯表達(dá)升高，在腫瘤切除術(shù)后表達(dá)水平明顯下降。此外，研究[8]指出miR-21在結(jié)直腸癌以及食管癌患者的糞便中表達(dá)水平上升，提示其有可能成為多種腫瘤的診斷和預(yù)后指標(biāo)。通過(guò)本次研究結(jié)果可以看出，相比于健康對(duì)照組，CRC患者糞便中的miR-16、miR-21 及miR-106a表達(dá)水平明顯上升(P<0.05),但是miR-29a以及miR-143a表達(dá)水平則無(wú)明顯變化，miR-16、miR-21 及miR-106a在低分化和中分化CRC患者糞便中表達(dá)水平無(wú)明顯差異，提示miR-16、miR-21 及miR-106a異常高表達(dá)有助于早期診斷CRC，但無(wú)法鑒別診斷中、低分化程度的CRC。通過(guò)比較CRC根治術(shù)患者術(shù)前、術(shù)后糞便中的miRNAs表達(dá)水平可以看出miR-16以及miR-106a在患者術(shù)后7 d的表達(dá)水平明顯下降，且趨于正常水平，提示糞便中上升的miR-16以及miR-106a可能來(lái)源于腫瘤組織的釋放，術(shù)后對(duì)其監(jiān)測(cè)有助于評(píng)判患者的預(yù)后。

[1] 張人華,鄒美平， 李珀，等.KLF6、KLF4及APC基因蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和意義[J].貴州醫(yī)藥,2013,37(7):579-581。

[2] Huang Z,Huang D,Ni S.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J].International Journal of Cancer,2010，127(1)：118-126.

[3] 王海艷，許春偉，吳永芳，等.結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中KRAS和BRAF基因突變的分子病理檢測(cè)分析[J].貴州醫(yī)藥,2015，39(11):961-963.

[4] Yu G,Tang JQ,Tian ML.Prognostic values of the miR 17-92 cluster and its paralogs in colon cancer[J].Journal of Surgical Oncology,2012，106(3)：232-237.

[5] Wu CW,Ng SS,Dong YJ.Detection of miR-92a and miR-21 in stool samples as potential screening biomarkers for colorectal cancer and polyps[J].Gut,2012，61(5)：739-745.

[6] Osada H,Takahashi T.let-7 and miR-17-92:small sized major players in lung cancer development[J].Cancer Science,2011，102(1)：9-17.

[7] Mi S,Li Z,Chen P.Aberrant overexpression and function of the miR-17-92 cluster in MLL-rearranged acute leukemia[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2010，107(8)：3710-3715.

[8] Duan YF,Li DF,Liu YH.Decreased expression of DAB2IP in pancreatic cancer with wild-type KRAS[J].Hepatobiliary & Pancreatec Diseases International,2013,12(2):204-209.

昆山市科技計(jì)劃項(xiàng)目合同 (項(xiàng)目編號(hào)：KS1340)

R735.3+5

B

1000-744X(2016)05-0478-02

2016-01-03)

△通信作者，E-mail:896811396@qq.com