NOD樣受體在免疫耐受中的作用①

章旭之 馬 毅

(中山大學附屬第一醫(yī)院器官移植科,廣州510080)

NOD樣受體在免疫耐受中的作用①

章旭之 馬 毅

(中山大學附屬第一醫(yī)院器官移植科,廣州510080)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)和NOD樣受體(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)為代表的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRR)在固有免疫等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，其中NLR作為一類胞內(nèi)模式識別受體在免疫耐受領(lǐng)域也得到越來越多的關(guān)注。本文對NLR在免疫耐受領(lǐng)域近年的研究進展作一綜述。

1 NLR概況

NLR，即核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域受體，是一類廣泛存在于固有免疫細胞胞漿內(nèi)的PRR[1]，由介導配體蛋白的C端亮氨酸富集重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat domain，LRRs)、具有ATP酶結(jié)構(gòu)域的中心核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding domain，NBD)和結(jié)合下游分子的N端結(jié)構(gòu)域組成。目前NLR家族已發(fā)現(xiàn)22個成員[2]，其LRRs和NBD基本相同(除NLRP10缺乏LRRs)，但其N端結(jié)構(gòu)域則存在異質(zhì)性，以此為依據(jù)分為5個亞家族：大多數(shù)NLR的N端含1～2個胱天蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(Caspase-activation and recruitment domain，CARD)或熱蛋白結(jié)構(gòu)域(Pyrin domain，PYD)，前者屬NLRC亞家族，包括2種NOD蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain protein，NOD)和3種NLRC蛋白；后者屬NLRP亞家族，包括14種NLRP蛋白。值得注意的是NLRP蛋白舊稱NALP蛋白(Neutrophilic apoptosis LRR pyrin domain protein，NALP)，兩種命名法通用。還有少數(shù)NLR的N端含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)體(Baculovirus inhibitor of apoptosis protein repeat，BIR)，稱NAIP蛋白(Neut-rophilic apoptosis inhibitory protein,NAIP)，屬NLRB亞家族[3]；N端含線粒體靶向序列的稱NLRX蛋白，屬NLRX亞家族[4]；而NLRA亞家族的NLRA蛋白，又稱Ⅱ型反式激活子(ClassⅡtransactivator,CⅡTAs)，其CARD和NACHT結(jié)構(gòu)域之間還存在一段功能尚不清楚的可被酸性環(huán)境激活的結(jié)構(gòu)域稱酸性激活結(jié)構(gòu)域(Acidic activation domain,AD)[5]。

NLRC亞家族中，NOD蛋白N端的CARD結(jié)構(gòu)域可結(jié)合和激活絲-蘇氨酸激酶RIP2，使IκB磷酸化，進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，通過NF-κB信號通路和MAPK信號通路介導下游炎性細胞因子的表達[6]；近期有報道稱NOD蛋白還可激活胱天蛋白酶和ATG16L蛋白，介導細胞的凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)作用[7,8]。根據(jù)CARD結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同，NOD蛋白可分為NOD1和NOD2，其N端分別含有1個或2個CARD結(jié)構(gòu)域。NOD1蛋白的配體是N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)，與革蘭陰性菌細胞壁成分mDAP結(jié)構(gòu)相似[9]；NOD2蛋白的配體則為胞壁酰二肽(NAM-L-Ala-D-Glu，MDP)，在大多數(shù)革蘭陰性菌和陽性菌的肽聚糖中均存在[10]。而同含有CARD結(jié)構(gòu)域的NLRC蛋白在N端另含一個高度保守的、和凋亡信號傳導有關(guān)的、被稱為死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)的折疊區(qū)[11]。值得一提的是，近期發(fā)現(xiàn)NLRC5能上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(Major histocompatibility complex-Ⅰ,MHCⅠ)基因的轉(zhuǎn)錄，這在免疫耐受調(diào)控領(lǐng)域成為新熱點[12]。

NLRP亞家族N端的PYD結(jié)構(gòu)域可激活胱天蛋白酶1(caspase-1)，介導早期反應(yīng)性細胞因子IL-1β的活化與釋放。這個過程通過NLR蛋白炎性體(NLRs protein inflammasome)介導。炎性體由NLR、接頭蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)及前體胱天蛋白酶1組成，其中ASC蛋白的PYD結(jié)構(gòu)域和CARD結(jié)構(gòu)域可分別結(jié)合與NLRP和pre-caspase-1相同的結(jié)構(gòu)域[13]。當LRRs識別配體后，pre-caspase-1被激活并剪切為成熟的caspase-1，同時促進IL-1β和IL-18的成熟與分泌，激活炎癥反應(yīng)[14]。在NLRP亞家族中，NLRP3有20余種配體，包括ATP、膽固醇結(jié)晶、尿酸鹽結(jié)晶、菌毛蛋白、dsDNA等[15]，受到較多關(guān)注。

NLRA、NLRB和NLRX亞家族的報道較少。NLRA亞家族的CⅡTAs主要通過上調(diào)MHCⅡ類分子的表達，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[16]。NLRB亞家族的NAIP是一類凋亡抑制蛋白，能夠阻止細胞凋亡[17]。而NLRX亞家族的NLRX則可增強線粒體活性，產(chǎn)生更多活性氧和自由基發(fā)揮抗感染功能[18]。

2 免疫耐受

免疫耐受(Immune tolerance)是免疫系統(tǒng)在抗原刺激下不能激活，從而不能執(zhí)行免疫應(yīng)答的現(xiàn)象。按形成機制，可分為中樞耐受(Central tolerance)和外周耐受(Peripheral tolerance)，前者指未成熟淋巴細胞在中樞免疫器官遭遇自身抗原形成的耐受，后者指成熟淋巴細胞在外周免疫器官接觸內(nèi)外源性抗原形成的耐受[19]。目前認為中樞耐受是由于在中樞免疫器官中，未成熟淋巴細胞經(jīng)過陰性選擇(Negative selection)，表面MHC分子與接觸的自身抗原發(fā)生高親和力結(jié)合者均被克隆清除(Deletion)所致[20]。而外周耐受的機制則存在多種理論，包括克隆清除、免疫忽視(Immunological ignorance)、克隆失能、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導障礙、免疫隔離(Immunological privileged)、免疫抑制等，目前認為其形成是多種因素調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)的共同作用結(jié)果[21]。同時，外周耐受的形成與抗原和機體因素密切相關(guān)，其中抗原因素包括劑量、性狀、接觸途徑、存在時間、表位特點及表位變異等，而機體因素則包括遺傳背景和發(fā)育年齡(越接近胚胎期越易形成耐受)[22]。免疫耐受的失調(diào)會造成多種疾病，如耐受狀態(tài)的破壞會導致移植物排斥、自身免疫性疾病及超敏反應(yīng)，而慢性感染持續(xù)狀態(tài)及免疫逃避的腫瘤細胞均和耐受狀態(tài)的形成有關(guān)[23]。因此，對免疫耐受的研究具有積極的臨床意義。

3 NLR與免疫耐受

目前針對NLR與免疫耐受領(lǐng)域的研究主要集中于NLRC亞家族的NOD蛋白和NLRP亞家族的NLRP3蛋白，而NLRA亞家族的CⅡTAs和NLRC亞家族的NLRC蛋白近期亦有研究所涉及。

3.1NOD和免疫耐受 現(xiàn)關(guān)于NOD蛋白和免疫耐受的報道多集中于自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)，包括2型糖尿病、哮喘及克羅恩病(Crohn′s disease,CD)等。2型糖尿病的胰島素抵抗被認為與自身免疫因素有關(guān)。Shiny等[24]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者體內(nèi)i-EDAP和MDP表達顯著升高；體外實驗顯示NOD1和NOD2蛋白能通過RIPK2和NF-κB等促炎信號增加TNF-α和IL-6的釋放，促進單核細胞表達活化標記物CD11b和CD36，而活化單核細胞水平則與胰島素抵抗的程度呈正相關(guān)。可見單核細胞中的NOD蛋白介導的炎癥反應(yīng)可破壞機體耐受狀態(tài)，與2型糖尿病的胰島素抵抗相關(guān)。氣道對過敏原耐受程度低是造成哮喘等呼吸道超敏反應(yīng)性疾病的原因。Duan等[25]發(fā)現(xiàn)，胸腺基質(zhì)淋巴細胞中的NOD2蛋白識別PAMP后， IL-25分泌增加，并表達T細胞共刺激配體OX40，促進Th1細胞的分化，激活適應(yīng)性免疫，破壞氣道耐受環(huán)境。

而NOD蛋白在CD中的作用則比較復(fù)雜。CD是一種自身免疫性腸病，與黏膜免疫失調(diào)有關(guān)，而NOD2蛋白的慢性刺激則介導腸道黏膜對腸道菌群耐受性誘導和維持[26]。Strober等[27]發(fā)現(xiàn)，CD患者NOD2基因多表現(xiàn)為多態(tài)性，其功能缺失導致小腸黏膜潘氏細胞分泌α防御素減少，造成腸道菌群失調(diào)，激活適應(yīng)性應(yīng)答，破壞黏膜耐受狀態(tài)；而功能正常的NOD2蛋白則可防止腸道過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。但是腸道菌群的作用及調(diào)節(jié)機制迄今尚未明晰，故NOD2在CD中的作用并非絕對，如Kim等[28]發(fā)現(xiàn)，志賀桿菌PGN(Shigella flexneri PGN,flexPGN)正是通過NOD2途徑激活NF-κB誘導CD的發(fā)生，而使用能夠抑制免疫應(yīng)答的植物乳桿菌脂磷壁酸(Lactobacillus plantarum lipoteichoic acid,pLTA)處理單核細胞系THP-1細胞，結(jié)果NOD2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達均顯著下降?？梢姡P(guān)于NOD蛋白在腸道黏膜免疫耐受狀態(tài)中的作用，需根據(jù)機制具體分析，如Cantó等[29]認為CD的發(fā)生與NOD2通路和TLR4通路平衡的破壞有關(guān)，任意一方的過度活化均會破壞耐受狀態(tài)，此為CD發(fā)生的危險因素。

3.2NLRP3和免疫耐受 NLRP蛋白主要通過形成炎性體發(fā)揮作用，目前關(guān)注最多的是NLPR3與胰島素耐受及中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病的關(guān)系。肥胖患者易發(fā)生糖耐量異常和胰島素抵抗，這被認為與過量脂肪導致的輕微炎癥反應(yīng)破壞免疫耐受的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。Healy等[30]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體能促進釋放IL-1β誘導胰島素耐受，而在高脂喂養(yǎng)小鼠中使用酪蛋白水解物(Casein hydrolysate,CH)降低caspase-1蛋白活性后，IL-1β表達降低，AkT磷酸化水平升高，小鼠對胰島素的敏感性提高。類似的，Mocanu等[31]發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠空腸-Roux-en-Y胃旁路手術(shù)后90 d脂肪組織中NLPR3、caspase-1、ASC等炎性體成分及IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1等炎性因子表達均顯著降低，同時血糖控制情況良好，胰島素抵抗減輕。Chi等[32]在胰島素抵抗的燒傷大鼠模型中及Vandanmagsar等[33]在對人類患者的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)論。

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一類自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，與免疫耐受的破壞關(guān)系密切。Inoue等[34]發(fā)現(xiàn)NLRP3能通過促進IL-1β的分泌誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)適應(yīng)性免疫細胞的聚集，而在NLRP3敲除小鼠上建立的實驗性變應(yīng)性腦炎(Experimental allergic encephalitis,EAE)模型中脫髓鞘現(xiàn)象減輕，Th1和Th17細胞的比例均減少，可見NLRP3對免疫耐受的破壞與MS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

3.3CⅡTAs和免疫耐受 CⅡTAs可以特異性上調(diào)MHCⅡ類分子的表達，在移植免疫耐受領(lǐng)域得到更多關(guān)注。Liu等[35]在大鼠肝移植模型中沉默受體CⅡTAs，發(fā)現(xiàn)IL-2等炎癥細胞因子和MHC-Ⅱ類分子表達顯著下降，移植肝的存活時間更長，提示移植耐受的形成。而Yang等[36]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，突變的Ⅱ型反式激活子(mutants of classⅡtransactivator,mCⅡTAs)能促進IL-33等細胞因子的釋放，誘導Th2細胞的分化，使Th2/Th1比例升高，增加IL-4、IL-10等炎癥抑制因子的表達，抑制Th1細胞功能，有利于移植耐受的誘導和維持。可見抑制CⅡTAs表達有利于移植耐受的形成，但此類研究甚少，仍需更多的實驗數(shù)據(jù)支持。

3.4NLRC和免疫耐受 目前認為NLRC蛋白在抗感染免疫和移植免疫中有一定意義。綠膿桿菌可分泌幾丁質(zhì)3樣1(Chitinase 3-Like 1,Chi3L1)誘導免疫耐受，限制宿主的炎癥反應(yīng)，故導致的醫(yī)院獲得性肺炎死亡率很高。Marion等[37]發(fā)現(xiàn)，Chil1可與宿主的IL-13受體結(jié)合，抑制NLRC4活性，阻止炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，形成免疫耐受；而敲除Chil1后，IL-1β和TNF-α表達顯著升高，細菌在宿主中的免疫耐受狀態(tài)被破壞?？梢娖茐牟≡w在宿主中的耐受狀態(tài)是防止病原體感染加重或慢性化的方法之一。而Ludigs等[38]發(fā)現(xiàn)，處于免疫耐受狀態(tài)的NLRC5缺陷小鼠和MHCⅠ缺陷小鼠的自然殺傷細胞(Natural killer cells,NK cells)表面的可清除活化T淋巴細胞的抑制性受體均增多，提示NLRC5可能通過增加T細胞表面MHCⅠ類分子表達，保護其免遭NK細胞清除。故抑制NLRC5表達或阻斷其信號通路，可激活機體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，阻止免疫應(yīng)答的增強，進而維持免疫耐受狀態(tài)。

4 小結(jié)與展望

NLR蛋白家族在固有免疫領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，其可識別PAMP，激活免疫系統(tǒng)，破壞免疫耐受狀態(tài)；而設(shè)法抑制NLR的功能則有利于免疫耐受狀態(tài)的形成。利用NLR這一特點，我們可以誘導或破壞免疫耐受狀態(tài)，以糾正移植排斥、超敏反應(yīng)、自身免疫性疾病、感染或腫瘤免疫逃逸等臨床問題。但是，關(guān)于NLR對免疫耐受的影響，其研究尚處于細胞、動物實驗階段，尚未有臨床應(yīng)用探索；且其機制仍未完全明晰，故仍須更深入的研究。

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[收稿2016-10-09]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.026

①本文為國家自然科學基金面上項目(81370574、81670591)和廣東省自然科學基金重點項目(2016A030311028)。

章旭之(1992年-)，男，在讀碩士，主要從事移植免疫方面的研究，E-mail：zhxuzh@foxmail.com。

及指導教師：馬 毅(1968年-)，男，醫(yī)學博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事移植免疫的研究，E-mail：anhuimayi2002@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)06-0930-04