建立嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的影響因素及研究進(jìn)展

劉欣，張倩倩，王圣霞，張旺信，張漢霆

（泰山醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)研究所，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)心理學(xué)教研室，3.腦科研究所，山東泰安271000；4.泰安市中心醫(yī)院眼科，山東泰安271000；5.Departments of Behavioral Medicine&Psychiatry and Physiology&Pharmacology，Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute，West Virginia University Health Sciences Center，Morgantown，WV 26506，USA）

建立嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的影響因素及研究進(jìn)展

劉欣1，2，3＊，張倩倩1，2＊，王圣霞4，張旺信2，張漢霆1，5

（泰山醫(yī)學(xué)院1.藥理學(xué)研究所，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)心理學(xué)教研室，3.腦科研究所，山東泰安271000；4.泰安市中心醫(yī)院眼科，山東泰安271000；5.Departments of Behavioral Medicine&Psychiatry and Physiology&Pharmacology，Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute，West Virginia University Health Sciences Center，Morgantown，WV 26506，USA）

酒精使用障礙（AUD）是威脅人類健康乃至生命的重要因素之一。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球每年因AUD而死亡的人數(shù)約330萬(wàn)。AUD已成為一個(gè)全球性公共衛(wèi)生和社會(huì)性問(wèn)題，但其神經(jīng)行為學(xué)機(jī)制并未完全闡明。因此，建立有效和可靠的酒精飲用動(dòng)物模型對(duì)AUD機(jī)制的探討非常重要。本文從動(dòng)物品系和造模方法等方面進(jìn)行綜述，探討可能對(duì)造模結(jié)果 造成偏差的相關(guān)影響因素，以期對(duì)AUD的動(dòng)物行為學(xué)研究有所裨益。

酒精；動(dòng)物品系；飲酒模型；嚙齒類動(dòng)物

酒精使用障礙（alcohol use disorder，AUD）包括酒精濫用和酒精依賴，酒精依賴又分為軀體依賴和心理依賴?；颊哂捎诜磸?fù)飲酒，往往出現(xiàn)強(qiáng)烈渴求攝入酒精的心理狀態(tài)，表現(xiàn)為酒精耐受性升高、飲酒行為的控制能力喪失及停止飲酒后出現(xiàn)酒精戒斷癥狀等，從而給自身及社會(huì)帶來(lái)一系列問(wèn)題［1］。僅在美國(guó)，依據(jù)最新的DSM-5標(biāo)準(zhǔn)，AUD的12個(gè)月患病率達(dá)到13.9%，而終生患病率達(dá)到29.1%，造成每年約2490億美元的醫(yī)療及相關(guān)開支［2-3］。時(shí)至今日，盡管AUD已成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)，但其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍不明確。本文從酒精飲用動(dòng)物模型的先天遺傳背景與后天建模方式等影響因素進(jìn)行綜述，希望對(duì)其動(dòng)物行為學(xué)研究有所啟示，從而對(duì)AUD發(fā)生機(jī)制及藥物干預(yù)研究提供有意義的參考。

1 不同品系嚙齒類動(dòng)物的選擇

嚙齒類動(dòng)物的品系是影響酒精攝入量及偏愛性的主要因素之一。由于嗜酒天性不同，即使在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，不同品系的動(dòng)物也會(huì)產(chǎn)生迥異的結(jié)果 。

1.1 C57BL/6J小鼠

C57BL/6J小鼠因其高度嗜酒的天性而常被用于酒精成癮的研究。Carrara-Nascimento等［4］對(duì)該系小鼠進(jìn)行連續(xù)3周雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，其對(duì)15%酒精消耗量每天可達(dá)20 g·kg-1，血液酒精濃度（blood ethanol concentration，BEC）可達(dá)250 mg·dL-1。Yoneyama等［5］對(duì)包含C57和C58小鼠在內(nèi)的22個(gè)近交系鼠進(jìn)行3%，6%和10%酒精的雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，各品系小鼠的酒精消耗量均隨酒精濃度的增加而升高，其中C57BL/6J小鼠酒精攝入量最高，分別達(dá)每天4，11和15 g·kg-1。這充分體現(xiàn)了C57BL/6J小鼠高度嗜酒的特點(diǎn)，使得該品系小鼠成為AUD實(shí)驗(yàn)最常用的造模動(dòng)物之一。

1.2 Wistar大鼠

Wistar大鼠具備繁殖快、易飼養(yǎng)等特點(diǎn)，也常用于酒精飲用動(dòng)物造模研究。鄭雪梅［6］將成年Wistar大鼠分為3組，以酒精濃度梯度遞增法分別給予6%，8%和12%的酒精溶液3個(gè)月，3組大鼠的BEC依次為153.05±5.25，175.71±9.86和（187.81± 6.28）mg·dL-1。Momeni等［7］對(duì)不同來(lái)源的Wistar大鼠進(jìn)行20%酒精間歇雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)（間歇時(shí)間為24 h，總時(shí)間6周），結(jié)果 顯示，其酒精攝入量最高達(dá)每天4.5 g·kg-1。Simms等［8］用同樣的方法考察Wistar大鼠酒精攝入量。結(jié)果 顯示，其每天酒精攝入量為（5.8±0.8）g·kg-1，而給予酒精30 min后的攝入量為（1.3±0.2）g·kg-1。因此，Wistar大鼠也是研究AUD常用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.3 Long-Evans大鼠

Long-Evans大鼠亦可用于酒精飲用動(dòng)物模型的建立。Simms等［8］采用Long-Evans大鼠進(jìn)行20%酒精的間歇性雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)（給予酒精間隔時(shí)間為24 h，酒精暴露時(shí)間為20 d），其酒精攝入量達(dá)每天（5.1±0.6）g·kg-1，酒精偏愛性為（47±5）%，給予酒精30 min后酒精攝入量為（0.87±0.14）g·kg-1。對(duì)上述Long-Evans大鼠再進(jìn)行40 d酒精剝奪實(shí)驗(yàn)，其酒精攝入量和偏愛性進(jìn)一步增高，分別為每天（6.3±0.8）g·kg-1和（57±5）%。Morales等［9］對(duì)Long-Evans大鼠進(jìn)行20%酒精濃度的間歇性雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)（間歇時(shí)間為24 h，總時(shí)間5周），大鼠的酒精偏愛性由25%上升至40%?？梢娫撓荡笫笠部蛇_(dá)到較穩(wěn)定的酒精攝入水平。

1.4 Sprague-Dawley（SD）大鼠

SD大鼠對(duì)低、中濃度酒精溶液的攝入量非常穩(wěn)定［10］。Broadwater等［11］研究表明，成年SD大鼠未經(jīng)任何訓(xùn)練時(shí)，對(duì)20%酒精的攝入量每30 min可達(dá)1.4 g·kg-1。Fu等［10］在20%酒精的間歇雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)（間歇時(shí)間為24 h，酒精暴露25 d）中發(fā)現(xiàn)，SD大鼠每天酒精攝入基線水平可由2.6 g·kg-1升至（4.38±0.36）g·kg-1，酒精偏愛性由15%升至32%。因此，SD大鼠也是一種價(jià)值較高的酒精模型備選動(dòng)物。

1.5 Fawn（FH）/Wjd大鼠

因具有酒精攝入量大、偏愛性高、酒精攝入有明顯的晝夜節(jié)律性和酒精剝奪效應(yīng)顯著的特點(diǎn)，該系大鼠成為建立AUD模型的理想動(dòng)物之一［12］。Rezvani等［13］對(duì)它們進(jìn)行雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，該大鼠對(duì)10%酒精的攝入量＞每天6 g·kg-1，經(jīng)過(guò)24 h的酒精戒斷其酒精攝入量還可提高25%～30%。景麗等［12］以先天嗜酒的該系大鼠為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，它們對(duì)5%酒精的攝入水平為每天（4.3±0.2）g·kg-1，酒精偏愛性為（82.9±2.0）%；對(duì)10%酒精的攝入水平為每天（6.4±0.2）g·kg-1，酒精偏愛性為（69.2±2.0）%。因此，F(xiàn)H/Wjd大鼠對(duì)酒精敏感性高的特點(diǎn)使其非常適合于AUD的動(dòng)物行為學(xué)研究。

1.6 豚鼠

豚鼠亦可被用于構(gòu)建酒精疾病的動(dòng)物模型的研究。尤其在構(gòu)建產(chǎn)前酒精暴露模型中，豚鼠在妊娠期因大腦發(fā)育較大鼠和小鼠更為成熟，這使其能更好的模擬人類胎兒乙醇譜系障礙（fetal alcohol spectrum disorders，F(xiàn)ASD）的情況［14］。豚鼠一般通過(guò)口腔給藥方式給予酒精，飲酒量能達(dá)到每天3～6 g·kg-1。另外，豚鼠是唯一出生后即有毛發(fā)覆蓋的嚙齒類動(dòng)物，而某些FASD生物靶標(biāo)如脂肪酸乙酯可積聚于新生兒毛發(fā)，這也使其成為開展類似研究的理想動(dòng)物模型［15］。但選用豚鼠制備飲酒動(dòng)物模型需注意其探索天性較差的特點(diǎn)。所以，在很多行為學(xué)測(cè)試中豚鼠檢測(cè)結(jié)果 的敏感性較大鼠和小鼠差，這一點(diǎn)是研究者在實(shí)驗(yàn)中需考慮的［16］。

2 常用嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的造模方法

除品系對(duì)建立酒精飲用動(dòng)物模型有顯著影響以外，不同造模方法也會(huì)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的明顯差異。以下對(duì)目前常用的嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要分析。

2.1 酒精流質(zhì)食物暴露模型

酒精流質(zhì)食物暴露模型是最早被廣泛應(yīng)用的嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型。在該方法中，往往把包含一定酒精成分的流質(zhì)飼料作為動(dòng)物的唯一食物。最常用的此類飼料其酒精成分所提供的熱量占整體食物熱量的35%，即相當(dāng)于6.61%（V/V）的酒精濃度［14］。該法可造成較好的酒精攝入水平，如Gil-Mohapel等［17］指出，在不同大鼠中采用酒精流質(zhì)食物可使之平均每天酒精攝入量達(dá)到12 g·kg-1；在BEC方面，該模型可以使大鼠達(dá)到低至中度的BEC水平［16］。該模型優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，流質(zhì)飼料既可自主飲用又可灌胃，缺點(diǎn)是不能保證動(dòng)物達(dá)到醉酒狀態(tài)且BEC難以維持穩(wěn)定［18］。

2.2 酒精灌胃模型

嚙齒類飲酒動(dòng)物模型亦可以通過(guò)灌胃或胃內(nèi)插管的方式建立。研究者可用灌胃針或玻璃導(dǎo)管通過(guò)食管將酒精灌入模型動(dòng)物胃中，同時(shí)給對(duì)照組動(dòng)物灌胃同等熱量的麥芽糖或蔗糖溶液來(lái)排除應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)等方面的干擾［13］。該模型中，每日灌胃次數(shù)、酒精濃度、灌胃劑量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間是影響結(jié)果 的重要因素［18］。Fidler等［19］以C57BL/6J和DBA/2J小鼠為研究對(duì)象，探索建立2個(gè)品系小鼠酒精灌胃模型的最佳條件，認(rèn)為給予酒精劑量以4 g·kg-1為起點(diǎn)，每日遞增0.5 g·kg-1，每天3次，可明顯提高2個(gè)品系的酒精攝入量，最終2個(gè)品系小鼠的酒精攝入量可達(dá)到每天22和12 g·kg-1。該模型優(yōu)點(diǎn)是可以精確控制給予動(dòng)物的酒精劑量和達(dá)到的BEC，缺點(diǎn)是構(gòu)建方法屬于侵入性，且打破了動(dòng)物飲酒的自主時(shí)間規(guī)律。此外同時(shí)灌胃產(chǎn)生的并發(fā)癥，如誤吸、感染和死亡等會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的準(zhǔn)確性［18-20］

2.3 單瓶強(qiáng)制飲酒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

單瓶強(qiáng)制飲酒實(shí)驗(yàn)是僅允許動(dòng)物飲用單一酒精溶液，旨在通過(guò)禁水而促進(jìn)動(dòng)物對(duì)酒精的攝入。Broadwater等［11］以間歇單瓶飲酒方法，強(qiáng)制未成年SD大鼠飲10%酒精+0.125%糖精+3%蔗糖溶液8 d，其酒精攝入量每30 min可達(dá)1.2 g·kg-1。鄭雪梅［6］對(duì)Wistar大鼠進(jìn)行連續(xù)單瓶飲酒實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，大鼠對(duì)6%，8%和12%酒精的攝入量分別為3.70± 0.64，4.69±0.83和（5.70±0.48）g·d-1。這些結(jié)果 說(shuō)明，單瓶強(qiáng)制飲酒實(shí)驗(yàn)可使動(dòng)物酒精消耗量達(dá)到較高的水平。該模型在酒精對(duì)外周組織（如肝和腎等）造成損傷的相關(guān)研究中被廣泛采用，但因其不能模擬人類飲酒的自主選擇性，制約了其在酒精成癮及相關(guān)中樞機(jī)制研究中的應(yīng)用［6］。

2.4 雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)是目前國(guó)際最常用的自主酒精飲用動(dòng)物模型［21-22］，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)給予動(dòng)物酒精溶液和水。與單瓶強(qiáng)制飲酒實(shí)驗(yàn)相比，雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)芨玫啬M人類飲酒習(xí)慣［23］?；诮o予酒精時(shí)間安排的不同，該實(shí)驗(yàn)又可分為持續(xù)性和間歇性雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)，前者一般持續(xù)給予酒精24 h，而后者則一般隔日給予。兩者結(jié)果 存在差異，持續(xù)實(shí)驗(yàn)可建立較穩(wěn)定的動(dòng)物酒精攝入量［24］；間歇實(shí)驗(yàn)則由于限制動(dòng)物獲得酒精的時(shí)間而可能誘發(fā)酒精剝奪效應(yīng)，從而促使其飲用更大量的酒精［25］。如Morales等［9］研究顯示，間歇實(shí)驗(yàn)（間歇時(shí)間24 h，總時(shí)間5周）期間，Long-Evans大鼠對(duì)20%酒精攝入量達(dá)到每天5～6 g·kg-1。此外，間歇實(shí)驗(yàn)更適合考察動(dòng)物飲酒量和BEC之間的相關(guān)性，這是研究者在選擇不同酒精飲用模型時(shí)應(yīng)注意的［26-27］。

與雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)類似的還有3瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)和4瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)，其原理都是給動(dòng)物提供了可同時(shí)選擇飲用不同溶液的機(jī)會(huì)，區(qū)別之處是除水外，實(shí)驗(yàn)還同時(shí)為動(dòng)物提供了不同濃度的酒精溶液，可更加細(xì)致而高效地考察動(dòng)物對(duì)特定濃度酒精溶液的攝取和偏好［28］。

2.5 操作性飲酒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/p>

操作性飲酒實(shí)驗(yàn)?zāi)苣M人類的飲酒習(xí)慣，但需訓(xùn)練動(dòng)物學(xué)會(huì)通過(guò)壓桿獲得酒精強(qiáng)化。Doherty等［29］用成年雄性Long-Evans大鼠進(jìn)行10%酒精+ 10%蔗糖溶液的單瓶強(qiáng)制操作性飲酒實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，大鼠在前35 min的酒精消耗量可達(dá)1.3 g·kg-1。Wang等［30］以雄性Long-Evans大鼠為研究對(duì)象，進(jìn)行壓桿后強(qiáng)制性飲20%酒精實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠前30 min酒精消耗量可達(dá)0.8，甚至＞1 g·kg-1。但亦有研究者采用該模型未取得理想的效果［31］，認(rèn)為主要由于一些動(dòng)物因?qū)凭a(chǎn)生厭惡而不再壓桿所致。操作性飲酒實(shí)驗(yàn)與間歇雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)相比更能體現(xiàn)動(dòng)物飲酒的自主性，并將動(dòng)物對(duì)酒精的尋求與攝入2個(gè)過(guò)程分離［32］。其不足之處在于，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)動(dòng)物酒精攝入量低，甚至不能自主攝入酒精的情況；另外，壓桿后給予酒精的劑量、濃度以及壓桿次數(shù)與給予酒精次數(shù)的比例也不易控制［30-32］。

2.6 酒精剝奪模型

酒精成癮動(dòng)物的一個(gè)重要特征就是在經(jīng)歷短期（＜24 h）或長(zhǎng)期（＞1周）酒精剝奪階段后，會(huì)出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀和之后飲酒量的反彈［33］。因此，研究者在給予選擇飲酒動(dòng)物一定階段的酒精刺激后，予以酒精剝奪一段時(shí)間，之后再次給予酒精，可觀察到動(dòng)物飲酒量較之前有所提升。如Heyser等［34］給予Wistar大鼠每天30 min的操作性飲酒實(shí)驗(yàn)，之后酒精剝奪14～28 d，結(jié)果 其BEC從基線水平的31.45±4.56明顯上升至（86.56±5.87）mg%。因此，長(zhǎng)期酒精剝奪實(shí)驗(yàn)可被用作研究酒癮復(fù)發(fā)及其藥物干預(yù)的有效動(dòng)物模型［35］。

2.7 黑暗環(huán)境飲酒模型

黑暗環(huán)境飲酒（drinking-in-dark，DID）模型是近年來(lái)研究豪飲（binge-drink）行為的典型動(dòng)物模型。其原理是嚙齒類動(dòng)物飲酒量在黑暗環(huán)境下會(huì)顯著升高。該模型模式主要由4 d實(shí)驗(yàn)組成，研究者往往將動(dòng)物置于黑暗環(huán)境下3 h，然后用一個(gè)盛有20%酒精溶液的瓶子替換掉飲水瓶。在前3 d實(shí)驗(yàn)中讓動(dòng)物自主飲用20%酒精溶液2 h，檢測(cè)其飲酒量；在第4天則讓動(dòng)物自主飲用20%酒精溶液4 h，并在2 h和4 h時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)其飲酒量［36］。利用該模型可顯著促進(jìn)動(dòng)物的飲酒行為，并達(dá)到穩(wěn)定的高BEC水平，如C57BL/6J小鼠BEC一般可＞100 mg·dL-1，甚至表現(xiàn)出明顯的酒精中毒行為［37］。因此，該模型可作為模擬酒精成癮者短時(shí)間內(nèi)大量飲酒的良好動(dòng)物模型。有研究指出，經(jīng)典的4 d實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ酵鶗?huì)出現(xiàn)第1天酒精攝入結(jié)果 與之后幾天的結(jié)果 不相關(guān)的情況，認(rèn)為這是因?yàn)閯?dòng)物第1天不適應(yīng)所致。因此，在正式實(shí)驗(yàn)前預(yù)先給予至少1～2 d的預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果 可能會(huì)更加穩(wěn)定［37］。

2.8 建立嚙齒類嗜酒動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)

雖然嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的構(gòu)建方法不同，其效果表現(xiàn)出一定差異，但建立成功的動(dòng)物模型仍有其統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。McBride等［35］提出嚙齒類嗜酒動(dòng)物模型必須滿足以下條件：①動(dòng)物應(yīng)自主飲用酒精；②酒精攝入量應(yīng)超過(guò)其代謝量，BEC應(yīng)達(dá)到藥理學(xué)升高水平；③動(dòng)物攝取的主要目的為酒精的藥理學(xué)作用，而非單純因酒精所含的熱量、味道或氣味等因素；④酒精的攝取應(yīng)是正強(qiáng)化的過(guò)程，動(dòng)物對(duì)飲酒的渴求會(huì)不斷增加，甚至愿意克服障礙以獲取酒精；⑤動(dòng)物在長(zhǎng)期飲酒過(guò)程后應(yīng)能產(chǎn)生酒精耐受性；⑥長(zhǎng)期飲酒過(guò)程后給予酒精剝奪，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)酒精戒斷反應(yīng)。

3 模型構(gòu)建中的其他影響因素

在AUD模型動(dòng)物的行為學(xué)研究中，由于動(dòng)物品系和遺傳背景不同，以及實(shí)驗(yàn)方法的區(qū)別，有時(shí)會(huì)造成結(jié)果 差異較大，影響實(shí)驗(yàn)的可信度，并妨礙不同研究結(jié)果 間的比較和分析。為此，本文對(duì)常見的差異之處進(jìn)行總結(jié)和討論，以期對(duì)研究者更好地選擇和建立酒精飲用動(dòng)物模型有所裨益。

3.1 動(dòng)物的遺傳背景與篩選

如前所述，不同品系動(dòng)物的飲酒特點(diǎn)明顯不同。因此，研究者在建立酒精飲用動(dòng)物模型時(shí)，需首先考慮這一點(diǎn)。如C57BL/6J小鼠是一種先天嗜酒程度較高的小鼠，而DBA/2J小鼠則嗜酒程度很低，所以兩系小鼠可納入同一實(shí)驗(yàn)中相互對(duì)照進(jìn)行研究［5］。

此外，在研究中尤需注意的是，即使同一品系動(dòng)物，因?yàn)槠鋪?lái)源不同，也可能在飲酒量方面存在差異。Momeni等［7］對(duì)3家供應(yīng)商提供的Wistar大鼠進(jìn)行20%酒精間歇雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)（間歇時(shí)間為24 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)間6周）顯示，不同供應(yīng)商提供的大鼠的酒精消耗量及偏愛性均存在差異，這可能是基因型的不同所致。而在飲酒動(dòng)物模型中廣泛使用的C57BL/6J小鼠，亦是如此［38-39］。如Blednov等［39］對(duì)敲除基因的C57BL/6J小鼠進(jìn)行雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Gnat3基因編碼的G蛋白參與味覺(jué)傳遞；Tas1r3基因與酒精依賴易感基因（1p13-35）毗鄰的1p36有保守同線性；Trpm5基因編碼的蛋白可以接收和傳遞味覺(jué)信號(hào)。所以Gnat3，Tas1r3和Trpm5 3個(gè)基因任何一個(gè)改變都會(huì)降低C57BL/6J小鼠的酒精攝入量和偏愛性。這就要求研究者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物酒精攝入偏好性進(jìn)行初篩［27］，以保證被試動(dòng)物的一致性，避免基因突變帶來(lái)行為學(xué)結(jié)果 的誤差。

3.2 動(dòng)物的性別和年齡

Ceylan-Isik等［40］發(fā)現(xiàn)，大量飲酒時(shí)，女性產(chǎn)生的相關(guān)癥狀較男性更為嚴(yán)重。但由于臨床上女性AUD患病率低于男性［2-3，40］，所以大多數(shù)研究?jī)H采用雄性動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然而，Broadwater等［11］研究表明，雌性SD大鼠酒精攝入量明顯高于雄性。因此，不同性別因素對(duì)動(dòng)物酒精攝入量所造成的影響也是AUD研究中一個(gè)需注意的方面。

在年齡方面，有研究表明，在連續(xù)雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)中，未成年C57BL/6J小鼠對(duì)15%酒精攝入量與成年小鼠存在差異，實(shí)驗(yàn)3周時(shí)兩者的酒精偏愛性分別為70%和78%［4］。Vendruscolo等［41］也指出，不同年齡Wistar大鼠酒精消耗量不同。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不同年齡動(dòng)物也會(huì)對(duì)結(jié)果 帶來(lái)差異。

3.3 操作細(xì)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的影響

操作過(guò)程中的液體丟失及動(dòng)物的位置偏愛性等細(xì)節(jié)亦較易對(duì)結(jié)果 帶來(lái)誤差。有研究表明，雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)與操作性飲酒實(shí)驗(yàn)的酒精攝入量和BEC結(jié)果 均應(yīng)呈明顯正相關(guān)，但水瓶取放過(guò)程中造成液體丟失可使該相關(guān)性不明顯［42］。有鑒于此，可放置1只不包含動(dòng)物的空籠盒，其水瓶的操作和其他籠子完全一致，這樣計(jì)算其前后結(jié)果 的變化作為校正數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差［22，26］。此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物可能會(huì)對(duì)瓶子或其位置產(chǎn)生偏好，即在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物僅使用某只瓶子或攝入某個(gè)位置的液體。位置偏愛性及瓶子偏愛性目前仍然主要依靠每24 h更換1次瓶子位置進(jìn)行平衡。另有研究者采用單瓶強(qiáng)制飲用法，即在正式實(shí)驗(yàn)前，對(duì)嗜酒動(dòng)物和嗜水動(dòng)物分別進(jìn)行7 d單瓶強(qiáng)制飲水、飲酒實(shí)驗(yàn)［43］。這種強(qiáng)制動(dòng)物攝入非偏愛溶液的方法亦可減小偏愛性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的影響。

3.4 酒精溶液中加甜味劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的影響

甜味對(duì)嚙齒類動(dòng)物飲酒量和偏好性有明顯影響。因此，在酒精中添加甜味劑成為很多研究者建立穩(wěn)定的動(dòng)物飲酒基線的有效手段。Fidler等［44］用5%蔗糖溶液、5%酒精溶液、5%蔗糖+5%酒精溶液和水分別對(duì)幼年Wistar大鼠進(jìn)行連續(xù)16 d（出生后30～46 d）雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 顯示，蔗糖能促進(jìn)大鼠攝入酒精。另外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸甜味劑時(shí)所處的年齡階段也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 。Broadwater等［11］在研究酒精溶液中加糖對(duì)SD大鼠偏愛性和酒精攝入量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，幼年大鼠暴露于10%酒精+0.125%糖精+3%蔗糖溶液，會(huì)使其成年后對(duì)該溶液的消耗量增加，這可能與激活幼年時(shí)已建立的獎(jiǎng)賞回路有關(guān)。

3.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中不同模型的聯(lián)合應(yīng)用

目前很多研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都傾向于聯(lián)合采用2種以上的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行綜合的飲酒動(dòng)物模型構(gòu)建，以此彌補(bǔ)單一模型的不足和局限，從而對(duì)靶行為和AUD中樞神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行更全面的考察［45］。一個(gè)典型的例子就是慢性酒精給藥和酒精剝奪實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕Y(jié)合，如Rhodes等［46］聯(lián)合采用酒精蒸氣吸入模型和DID模型，取得較好的效果。另外，持續(xù)性和間歇性雙瓶自由選擇實(shí)驗(yàn)也常常在時(shí)間上先后應(yīng)用，以建立動(dòng)物較高而穩(wěn)定的BEC，更利于考察藥物對(duì)AUD的作用［47］。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外AUD患者的不斷增多，對(duì)酒精成癮機(jī)制的研究和新藥開發(fā)的需求愈加迫切。在這樣的形勢(shì)之下，嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的不斷完善和發(fā)展，會(huì)對(duì)AUD機(jī)制的闡明及相關(guān)干預(yù)手段的發(fā)展產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用。但是，由于酒精飲用動(dòng)物模型構(gòu)建涉及到品系、操作方法、性別和年齡等諸多因素，如何去選擇、改進(jìn)，甚至進(jìn)一步建立全新的、能更好模擬人類飲酒特點(diǎn)的動(dòng)物模型是一個(gè)非常重要的問(wèn)題。在未來(lái)酒精飲用動(dòng)物模型的發(fā)展中，有幾個(gè)方向值得關(guān)注。

首先，基因研究會(huì)對(duì)篩選和完善動(dòng)物模型產(chǎn)生愈加明顯的促進(jìn)作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)AUD相關(guān)的神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)、神經(jīng)免疫、離子通道和神經(jīng)肽信號(hào)通路等上百種靶基因位點(diǎn)進(jìn)行探索，利用基因編輯技術(shù)探索特定基因?qū)X類動(dòng)物飲酒行為的影響，取得了豐碩成果［48］。在這一過(guò)程中，這些動(dòng)物研究成果若能與人類酒精飲用相關(guān)基因靶點(diǎn)的研究進(jìn)行結(jié)合，從而相互參照，相信會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的發(fā)展，并給人類AUD遺傳機(jī)制的探索帶來(lái)啟示［14，25，46，48］。

其次，在動(dòng)物模型中如何更好地模擬人類酒精飲用的社會(huì)因素，亦是一個(gè)值得關(guān)注的方面。人類AUD的產(chǎn)生除有基因方面的原因外，與壓力、家庭、教育和環(huán)境影響等社會(huì)因素息息相關(guān)［2-3，40］?，F(xiàn)在已有諸多關(guān)于產(chǎn)前酒精暴露、孤養(yǎng)和其他應(yīng)激因素等對(duì)AUD影響的動(dòng)物行為學(xué)研究［4，14，49］，這些成果都為進(jìn)一步理解飲酒行為提供了啟示。未來(lái)研究者若能參照動(dòng)物品系特點(diǎn)，進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，從而更全面地模擬人類飲酒的種種社會(huì)性影響因素，必會(huì)進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)的現(xiàn)實(shí)意義。

最后，如何在技術(shù)層面改良甚至建立新的嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型也是促進(jìn)AUD研究的必要途徑。在改良現(xiàn)有的酒精飲用動(dòng)物模型方面，可將不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的有效影響因素相結(jié)合，從而進(jìn)一步挖掘潛力。如經(jīng)典DID模型一般是讓動(dòng)物單瓶飲用酒精，而MacFadyen等［50］采用改良的方式，在黑暗環(huán)境下給動(dòng)物提供了3瓶不同溶液供其自主飲用（分別為0.05%糖精溶液、0.05%糖精+10%酒精溶液和0.05%糖精+15%酒精溶液）取得較好的效果；另外，近年來(lái)也有研究者利用傳感器和無(wú)線信號(hào)芯片等技術(shù)手段建立了新的動(dòng)物模型，如Smutek等［51］建立的群居小鼠自主飲酒模型（model of voluntary alcohol drinking by group-housed mice），該模型采用IntelliCage系統(tǒng)，給C57BL6J小鼠植入信號(hào)發(fā)射芯片，研究者通過(guò)鼠籠上的傳感器不僅可考察個(gè)體動(dòng)物的飲酒行為，還可考察群體環(huán)境對(duì)飲酒的影響。因此，動(dòng)物造模技術(shù)層面的改進(jìn)無(wú)疑可開拓思路，深化對(duì)AUD的行為學(xué)研究。

綜上所述，在建立嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型的發(fā)展過(guò)程中，從強(qiáng)制飲酒到自主飲酒，從單純注重動(dòng)物的酒精攝入量到注重酒精偏愛性，不同類型的酒精飲用動(dòng)物模型不斷得到完善和發(fā)展，從而進(jìn)一步促進(jìn)了對(duì)AUD的行為學(xué)及其神經(jīng)藥理學(xué)的研究。目前，對(duì)AUD的中樞神經(jīng)作用機(jī)制亟待闡明，臨床能治療AUD的一線藥物也極為有限，這都對(duì)完善和改進(jìn)嚙齒類酒精飲用動(dòng)物模型提出新的要求。行為學(xué)研究取得的進(jìn)展必將對(duì)AUD的基礎(chǔ)、臨床前和臨床治療研究發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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Factors affecting establishment of rodent alcohol drinking models and recent advances

LIU Xin1,2,3＊,ZHANG Qian-qian1,2＊,WANG Sheng-xia4,ZHANG Wang-xin2,ZHANG Han-ting1,5
(1.Institute of Pharmacology,2.Department of Medical Psychology,School of Basic Medical Sciences, 3.Key Lab of Cerebral Microcirculation in Universities of Shandong,Taishan Medical College, Tai′an 271000,China;4.Department of Ophthalmology,Tai′an Central Hospital,Tai′an 271000, China;5.Departments of Behavioral Medicine&Psychiatry and Physiology&Pharmacology, Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute,West Virginia University Health Sciences Center,Morgantown,WV 26506,USA)

Alcohol use disorder(AUD)is one of the main factors that threaten human health and life.WHO data show that about 3.3 million people die each year worldwide due to AUD.AUD has become a global public health concern,but its neurobiological and behavioral mechanisms remain unclear.Therefore,it is particularly urgent to develop valid and reliable animal models to investigate the underlying mechanisms of AUD.This review summarizes the animal species and modeling methods of AUD in order to explore the potential influence on the deviation of modeling in alcohol intake and provide helpful inputs to behavioral research of AUD.

alcohol;animal strains;alcohol drinking models;rodent

The project supported by Foundation of Overseas Distinguished Taishan Scholars of Shandong Province; Natural Scientific Foundation of Shandong Province(ZR2014CL011);High-Level Project Cultivating Grants of Taishan Medical College(2013GCC08);High-School Scientific Research Development Program of Shandong Province(2016J16LL57); and Scientific Foundation of Students of Taishan Medical College

ZHANG Han-ting,E-mail:hzhang@hsc.wvu.edu，Tel:(0538)6231386

R965.1

A

1000-3002-（2017）06-0607-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.016

2017-03-03接受日期：2017-06-15）

（本文編輯：趙楠）

山東省政府“泰山學(xué)者海外特聘專家”專項(xiàng)基金；山東省自然基金（ZR2014CL011）；山東省高等學(xué)?？蒲杏?jì)劃（2016J16LL57）；泰山醫(yī)學(xué)院高層次課題孵育計(jì)劃（2013GCC08）；泰山醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研基金

劉欣，男，碩士，講師，主要從事動(dòng)物成癮行為和神經(jīng)藥理學(xué)研究；張倩倩，女，泰山醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生，主要從事動(dòng)物成癮行為和神經(jīng)生物學(xué)研究。

張漢霆，E-mail：hzhang@hsc.wvu.edu，Tel：（0538）6231386

＊共同第一作者。

＊Co-first author.