豬傳染性胸膜肺炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

張文通，魏 鳳，2，王金良，2，沈志強(qiáng)，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600）

豬傳染性胸膜肺炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法綜述

張文通1，魏 鳳1，2，王金良1，2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600）

豬傳染性胸膜肺炎（APP）是由胸膜肺炎放線桿菌感染引起的豬的、以急性出血性和慢性的纖維素性胸膜肺炎病變?yōu)樘卣鞯囊环N嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)傳染病[1]。本病廣泛存在于全世界所有養(yǎng)豬國(guó)家，特別是對(duì)現(xiàn)代集約化養(yǎng)豬危害更大，是影響現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大疫病之一。本病可依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及剖檢時(shí)病理變化作出初步診斷。但隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬病越來(lái)越復(fù)雜，僅靠傳統(tǒng)診斷方法對(duì)該病診斷已顯得較為困難。進(jìn)一步確診必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。自1978年首次分離該病的病原以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病的診斷方法進(jìn)行了大量研究，取得了顯著成績(jī)。本文就該病實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)展方面，進(jìn)行了如下綜述。

1 細(xì)菌分離鑒定

無(wú)菌采取病死豬的肺臟病變組織塊或急性死亡豬的心血、胸水以及鼻腔血色分泌物，立即接種培養(yǎng)基[2]。37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察結(jié)果。典型的胸膜肺炎放線桿菌菌落為黏液型蠟樣菌落。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性，兩極著染略深的小球桿菌。胸膜肺炎放線桿菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和果糖發(fā)酵產(chǎn)酸，尿酸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性[3]。胸膜肺炎放線桿菌在金黃色葡萄球菌菌株培養(yǎng)物接種可形成衛(wèi)星現(xiàn)象，亦即NAD生長(zhǎng)依賴(lài)株。胸膜肺炎放線桿菌為典型的β溶血。將待檢菌株培養(yǎng)物直接與標(biāo)準(zhǔn)分型血清做活菌凝集檢查，可進(jìn)行菌株血清定型。細(xì)菌分離鑒定方法優(yōu)點(diǎn)為病原學(xué)診斷最可靠的方法，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)。

2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

1971年Nicolet建立了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）方法，該方法在國(guó)際上被公認(rèn)為檢測(cè)APP的標(biāo)準(zhǔn)方法[4]。

Lombin 等于1982改良年了Nicolet的方法。其基本操作程序?yàn)椋撼暡ㄌ幚砑?xì)菌，收集上清作為抗原；待檢血清56 ℃滅活后加入補(bǔ)體，再加入抗原，反應(yīng)過(guò)夜；第2天加入小牛血清（溶血素）和綿羊紅細(xì)胞（SRBCs）。如果被檢血清中含特異抗體，則抗原抗體復(fù)合物結(jié)合補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，呈陽(yáng)性反應(yīng)；反之，補(bǔ)體和溶血素與SRBCs結(jié)合，則出現(xiàn)溶血，呈陰性反應(yīng)。

1990年朱士盛等通過(guò)將多種血清型抗原以一定比例混合成全細(xì)胞抗原凍干后應(yīng)用，其抗原穩(wěn)定，改良補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)更適合豬胸膜肺炎放線桿菌病的診斷。

CFT優(yōu)點(diǎn)是敏感性高和特異性強(qiáng)，缺點(diǎn)是操作繁鎖，費(fèi)時(shí)，成本高，且檢測(cè)樣品不易標(biāo)準(zhǔn)化，一般只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

自Nicolet等于1981年首次建立檢測(cè)APP的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法以來(lái)，隨后以不同抗原（如莢膜、脂多糖 、外膜蛋白等）包被建立的ELISA方法也得以應(yīng)用。國(guó)外已有商品化的ELISA試劑盒，敏感性和特異性較高。該方法可替代CEF作為APP的分型方法。

4 凝集試驗(yàn)

凝集試驗(yàn)(AA)是一種簡(jiǎn)單快速檢測(cè)APP，并可用于血清型分型的方法。凝集試驗(yàn)包括試管凝集、玻片凝集、協(xié)同凝集等。

Rapp等比較玻片凝集試驗(yàn)與間接熒光抗體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：玻片凝集試驗(yàn)比間接熒光抗體試驗(yàn)的特異性和敏感性高。Mittal等比較了各種凝集試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：協(xié)同凝集試驗(yàn)和2-巰基乙醇試管凝集試驗(yàn)的特異性與敏感性均優(yōu)于玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)。Habrun等比較2-巰基乙醇微量凝集試驗(yàn)與ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：2-巰基乙醇微量凝集試驗(yàn)適合于早期感染檢測(cè)，ELISA試驗(yàn)對(duì)老齡豬群的檢測(cè)較2-巰基乙醇微量凝集試驗(yàn)敏感性高。

雖然快速平板凝集試驗(yàn)和協(xié)同凝集試驗(yàn)的敏感性不及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，但它們快速、簡(jiǎn)便，因而也成為實(shí)驗(yàn)室劃分APP的常規(guī)方法。

5 間接血凝試驗(yàn)

Mittal等建立了間接血凝試驗(yàn)（IHA）用于檢測(cè)APP并對(duì)其進(jìn)行血清分型。Nielson報(bào)道IHA在血清型6和8之間有交叉反應(yīng)，但能區(qū)分4型和7型。Pat Blackall應(yīng)用本方法發(fā)現(xiàn)：仍不能區(qū)分血清型6和8及血清型9和11。然而，由于此方法操作簡(jiǎn)便，目前已成為主要的檢測(cè)和分型方法。

6 間接熒光抗體試驗(yàn)

Rosendal等用間接熒光抗體試驗(yàn) (IFA)對(duì)APP進(jìn)行檢測(cè)與血清學(xué)分型。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：除血清型6與非對(duì)應(yīng)的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)外，血清型4與7之間及血清型4與5之間均發(fā)生交叉反應(yīng)。另外還發(fā)現(xiàn)IFA試驗(yàn)不能檢測(cè)血清型1。總之，間接熒光抗體試驗(yàn)的敏感性和特異性相對(duì)較低，在實(shí)際中應(yīng)用也較少。

7 乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）是一種簡(jiǎn)捷快速的檢測(cè)方法，不僅可用于檢測(cè)，亦可用于血清分型。

Inzana用同型無(wú)莢膜突變菌對(duì)有莢膜菌的抗血清進(jìn)行吸附，然后用處理過(guò)的抗血清致敏乳膠。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法特異性好、敏感性高，且簡(jiǎn)捷、快速，適合在生產(chǎn)中應(yīng)用

8 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（IDT）是一種經(jīng)典的免疫學(xué)方法。1979年，Gunnarsson等將這種方法用于APP檢測(cè)，并用于血清分型。該試驗(yàn)有較好的型特異性，是1986 年國(guó)際嗜血桿菌胸膜肺炎研究協(xié)作組推薦的方法之一。

李開(kāi)玉等用酚水抗原檢測(cè)血清，發(fā)現(xiàn)特異性最高，但仍不能區(qū)分血清型1和9，血清型3、6和8。Blackall 等用該方法檢測(cè)APP時(shí)，血清型15與7之間也有交叉反應(yīng)。

該方法雖然簡(jiǎn)單，但耗時(shí)較長(zhǎng)，在孔周?chē)某恋砭€有的很難解釋?zhuān)⑶医Y(jié)果可能不明顯。Gunnarson等建議用試管凝集試驗(yàn)代替免疫擴(kuò)散試驗(yàn)來(lái)確定APP的血清型。然而，由于每種特異的抗原-抗體復(fù)合物均可形成明顯的沉淀線，所以免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是研究APP出現(xiàn)的附加的抗原的一個(gè)有效的方法。

9 沉淀試驗(yàn)

Mittal等建立了環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(Precipitation Test)，用于檢測(cè)APP及血清分型，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性較好，而且該方法可以對(duì)凝集試驗(yàn)不能確定血清型的APP進(jìn)行分型。Mittal等建議環(huán)狀沉淀試驗(yàn)可取代試管凝集試驗(yàn)作為常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室確定APP血清型的方法。但Mittal等認(rèn)為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)所需試劑較多，應(yīng)用不便。Hommez等用APP的可溶性抗原建立了玻片沉淀試驗(yàn)，這種方法具有與環(huán)狀沉淀試驗(yàn)相同的特異性，但操作上比環(huán)狀沉淀試驗(yàn)簡(jiǎn)單。

10 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于疾病病原的診斷。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種用于診斷APP的PCR方法，這些方法敏感性和特異性均較高，且耗時(shí)短。國(guó)外已研制了一種商品化的APP PCR診斷試劑盒，可以直接用于病料中APP的檢測(cè)。

PCR方法除應(yīng)于感染動(dòng)物的快速診斷外，還可用于APP的分型。與常規(guī)的血清學(xué)分型方法相比，這種分子生物學(xué)的分型方法快速、簡(jiǎn)便，但也存在交叉反應(yīng)[6]。因此，將分子生物學(xué)的分型方法與常規(guī)血清學(xué)方法相結(jié)合，無(wú)疑會(huì)提高分型的速度和準(zhǔn)確性[7，8]。

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2016-11-23）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)SDAIT-08-17

張文通（1979-），男，漢族，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究