胚胎干細(xì)胞向體表外胚層及角膜上皮細(xì)胞分化過(guò)程中信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

侯璐璐，黃一飛

（1.解放軍總醫(yī)院眼科，北京 100853；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科中心，吉林長(zhǎng)春 130021）

胚胎干細(xì)胞向體表外胚層及角膜上皮細(xì)胞分化過(guò)程中信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

侯璐璐1，2，黃一飛1

（1.解放軍總醫(yī)院眼科，北京 100853；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科中心，吉林長(zhǎng)春 130021）

干細(xì)胞泛指體外具有自我更新和多向或定向分化潛能的細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞則可被誘導(dǎo)分化形成內(nèi)胚層、中胚層及外胚層來(lái)源的200余種不同細(xì)胞。角膜上皮細(xì)胞來(lái)源于胚胎發(fā)育時(shí)期的表皮外胚層。臨床上嚴(yán)重、廣泛的眼表?yè)p傷，需要具有增殖能力的角膜上皮細(xì)胞修復(fù)損傷。利用體內(nèi)外研究體系模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育及組織環(huán)境，闡明具有生物活性的角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，為再生醫(yī)學(xué)提供依據(jù)，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。本文介紹了Notch、Wnt、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及成纖維生長(zhǎng)因子等調(diào)控表皮外胚層發(fā)育及與角膜上皮細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路，以既往實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，就各信號(hào)通路調(diào)控的機(jī)制及主要調(diào)控因子進(jìn)行綜述。

胚胎干細(xì)胞；外胚層；角膜上皮細(xì)胞；信號(hào)通路

干細(xì)胞泛指具有自我更新能力或多向及定向分化潛能的細(xì)胞［1］。干細(xì)胞按照分化階段分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）及成體干細(xì)胞。ESC是來(lái)源于早期胚胎階段未分化的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的干細(xì)胞，屬于全能干細(xì)胞，可分化形成內(nèi)胚層、中胚層、外胚層，在體外經(jīng)不同條件的誘導(dǎo)分化，可發(fā)育成為人體的220種細(xì)胞。成體干細(xì)胞是存在于已分化組織中的未分化細(xì)胞，此類細(xì)胞能自我更新，定向分化成為組成該組織的細(xì)胞。在有機(jī)體整個(gè)生命過(guò)程中，都可通過(guò)成體干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)該類型損傷組織器官的修復(fù)或替代［2］。

早期ESC領(lǐng)域相關(guān)實(shí)驗(yàn)多以小鼠ESC作為研究對(duì)象，種屬差異性限制了研究結(jié)果在臨床的應(yīng)用。近年來(lái)，以再生醫(yī)學(xué)為基礎(chǔ)，誘導(dǎo)人ESC向內(nèi)胚層、中胚層、外胚層分化的相關(guān)研究逐漸增多，為臨床疾病的治療提供了一定的指導(dǎo)。

基于人ESC的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a與激活素A（activin A）共同作用，可促進(jìn)人ESC向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分化［3］，高水平的激活素/Nodal信號(hào)通路可有效誘導(dǎo)小鼠ESC向內(nèi)胚層方向分化。通過(guò)上調(diào)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2/Flk-1及血小板衍生生長(zhǎng)因子受體通路，可誘導(dǎo)ESC向中胚層細(xì)胞分化，形成造血細(xì)胞、血管、心肌和骨骼肌等組織結(jié)構(gòu)［4］。外胚層由神經(jīng)外胚層及表皮外胚層共同組成。神經(jīng)外胚層可分化為神經(jīng)板，進(jìn)一步分化為中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及視網(wǎng)膜。以人ESC為研究對(duì)象，利用γ-分泌酶抑制劑DAPT，Wnt抑制劑IWR1e，Hedgehog信號(hào)通路激動(dòng)劑SAG，肝糖原合成激酶3β受體選擇性抑制劑CHIR99021和Rho相關(guān)卷曲蛋白形成絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（Rho associated coiled protein serine threonine protein kinase，ROCK）特異性抑制劑Y-27632等小分子化合物，通過(guò)抑制Wnt，Notch，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（trans?forming growth factor-β，TGF-β）和ROCK等信號(hào)通路，誘導(dǎo)形成視杯及分層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)也有相關(guān)報(bào)道［5］。但誘導(dǎo)ESC向體表外胚層器官分化，特別是向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化，卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。這可能是由于角膜上皮出現(xiàn)于胚胎發(fā)育晚期，分化發(fā)育機(jī)制復(fù)雜，涉及信號(hào)通路較多，相關(guān)信號(hào)通路具體調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不明確。

角膜上皮細(xì)胞來(lái)源于第5～6周胚胎的表皮外胚層。人胚9 mm時(shí)，晶狀體泡從體表外胚層完全分離出來(lái)，晶狀體泡表面的上皮相互融合，形成了一層立方狀的上皮，其后分化成為角膜上皮。隨著胚胎不斷發(fā)育，胚眼也不斷發(fā)育完善，角膜上皮細(xì)胞逐步分化，形成完整的各層結(jié)構(gòu)。

角膜上皮細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中受到多種調(diào)控因素的共同調(diào)節(jié)，主要涉及的信號(hào)通路包括Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone mor?phogenetic protein，BMP）信號(hào)通路和堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）信號(hào)通路等。一些基因如pax6和p63等在角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。

1 Notch信號(hào)通路與表皮外胚層及角膜上皮細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系

1.1 Notch信號(hào)通路

Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中眾多細(xì)胞程序［6］，是決定細(xì)胞分化命運(yùn)的重要通路。Notch在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中都有表達(dá)，家族成員結(jié)構(gòu)具有高度保守性［7］，調(diào)節(jié)包括干細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的分化、增殖及凋亡，同時(shí)也參與調(diào)控細(xì)胞黏附和遷移等細(xì)胞間相互作用［8-10］，最終影響形態(tài)發(fā)生及組織器官形成。Notch基因最初是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其部分功能缺失可導(dǎo)致果蠅翅緣出現(xiàn)缺口，因而得名。Notch受體為相對(duì)分子質(zhì)量約30 000的Ⅰ型膜蛋白，在嚙齒類動(dòng)物和人中分為4種［11-13］，其中Notch1和Notch2在結(jié)構(gòu)上具有高度同源性，Notch3和Notch4在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上與Notch1和Notcht2不同。Notch配體也為Ⅰ型跨膜蛋白，在哺乳動(dòng)物中，其配體包括Delta樣分子、Jagged樣分子。Delta1，Jagged1和Jag?ged2是Notch1-3受體的特異性配體［14-15］。經(jīng)典的Notch信號(hào)通路也稱為C啟動(dòng)子結(jié)合因子-1/重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ（C-promoter binding factor-1/re?combination signal binding protein-Jκ，CBF-1/ RBP-Jκ）依賴途徑［1］。CBF-1/RBP-Jκ本身為轉(zhuǎn)錄抑制因子，Notch信號(hào)通路激活后與CBF-1/RBP-Jκ結(jié)合，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。

1.2 Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)體表外胚層及角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育分化

在體表外胚層分化形成角化細(xì)胞的過(guò)程中，Notch信號(hào)通路是關(guān)鍵的誘導(dǎo)分化因素［17］。在小鼠ESC及人ESC體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，Notch信號(hào)通路先于p63基因在外胚層祖細(xì)胞表達(dá)前被激活［18］。p63基因在具有高度增生能力的上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，如干細(xì)胞缺乏p63基因,其增殖能力會(huì)明顯下降。p63基因先于K14表達(dá)于外胚層發(fā)育過(guò)程中，也是復(fù)層上皮細(xì)胞得以不斷增殖的關(guān)鍵基因和重要決定因素［19］。無(wú)論是人還是小鼠ESC，在基因水平上抑制Notch信號(hào)通路，會(huì)提高外胚層發(fā)育過(guò)程中p63基因的表達(dá)水平。通過(guò)BMP-4及血清誘導(dǎo)ESC向表皮外胚層、角化細(xì)胞方向分化，檢測(cè)p63的表達(dá)水平可發(fā)現(xiàn)，p63先于K14表達(dá)于誘導(dǎo)分化過(guò)程中。同時(shí)，在表皮發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路被抑制，這種抑制保證了體表外胚層發(fā)育過(guò)程中p63的表達(dá)。通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路，可誘導(dǎo)p63的表達(dá)，同時(shí)激活BMP-4信號(hào)通路，后者與表達(dá)水平上調(diào)的p63協(xié)同作用，誘導(dǎo)小鼠ESC向角化細(xì)胞方向分化。相反，如激活Notch信號(hào)通路，則會(huì)抑制p63表達(dá)。外胚層祖細(xì)胞中p63表達(dá)受抑制，則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞最終分化成為肌肉、神經(jīng)或肝細(xì)胞。在探究Notch信號(hào)通路對(duì)角膜上皮細(xì)胞分化與增殖影響的研究中，分別抑制和激活Notch通路的表達(dá)后，使用免疫熒光標(biāo)記Notch1，Notch2，Delta1以及Jag?ged1，同時(shí)檢測(cè)其基因和蛋白表達(dá)；通過(guò)檢測(cè)Ki67和CK3的表達(dá)，印證了角膜上皮細(xì)胞的分化與增殖與Notch信號(hào)通路的關(guān)系。當(dāng)γ-分泌酶抑制Notch信號(hào)通路后，Notch1和Notch2表達(dá)下調(diào)，引起Ki67表達(dá)減少和CK3表達(dá)上升；通過(guò)Jagged1激活Notch信號(hào)通路則可上調(diào)Notch1和Notch2活性蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了Ki67表達(dá)，下調(diào)了CK3的表達(dá)。在3D培養(yǎng)體系中，γ-分泌酶不會(huì)對(duì)Ki67和CI3表達(dá)產(chǎn)生影響，Jagged1卻仍能引起CK3表達(dá)的下調(diào)。該研究說(shuō)明，抑制Notch信號(hào)通路可抑制上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)向終末角膜上皮細(xì)胞的分化；激活Notch信號(hào)通路則會(huì)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，但卻抑制了向終末上皮細(xì)胞方向的分化［20］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在小鼠角膜上皮細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，Notch信號(hào)通路的激活與其增殖水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)研究還證實(shí)，中央?yún)^(qū)角膜上皮細(xì)胞Notch信號(hào)通路要比角膜緣處活躍，這就進(jìn)一步說(shuō)明和角膜緣區(qū)相比，中央?yún)^(qū)角膜上皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的持續(xù)分化能力，但增殖能力稍弱［21］。另一項(xiàng)探究Notch通路激活后對(duì)角膜上皮細(xì)胞增殖及角膜創(chuàng)傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)，利用過(guò)度表達(dá)激活Notch1信號(hào)〔Notch的活化形式，Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD）〕的轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果證實(shí)，該轉(zhuǎn)基因小鼠角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育分化與野生型相比并無(wú)顯著差異，但NICD表達(dá)卻可促進(jìn)損傷角膜上皮的愈合，NICD的過(guò)度表達(dá)改變了損傷后角膜上皮細(xì)胞增殖修復(fù)的動(dòng)力學(xué)。在野生型小鼠中，角膜上皮細(xì)胞損傷后Notch1的表達(dá)明顯激活上調(diào)，同時(shí)伴角膜上皮細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)［22］。在角膜上皮細(xì)胞損傷修復(fù)的過(guò)程中，通過(guò)DAPT或shRNA抑制Notch信號(hào)通路的表達(dá)則能增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力［23］。

在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，Notch信號(hào)通路都對(duì)角膜上皮細(xì)胞的分化和增殖具有不同程度的影響［20-23］。在胚胎發(fā)育過(guò)程和角膜上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程中，Notch通路對(duì)角膜上皮細(xì)胞增殖和分化的影響并不完全相同，推測(cè)這種差異的出現(xiàn)，可能是由于角膜上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程與角膜上皮細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程并不完全相同。在胚胎發(fā)育過(guò)程不同階段，Notch信號(hào)通路可能對(duì)角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育產(chǎn)生不同的影響，其確切的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

2 Wnt信號(hào)通路與表皮外胚層及角膜上皮細(xì)胞分化的關(guān)系

2.1 Wnt信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路最初于1982年發(fā)現(xiàn)于乳腺癌小鼠中，此基因激活依賴小鼠乳腺癌相關(guān)病毒基因的插入。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Wnt基因編碼的Wnt蛋白可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生生長(zhǎng)刺激信號(hào)，參與不同的發(fā)育過(guò)程如細(xì)胞分化、細(xì)胞移行以及決定細(xì)胞命運(yùn)的增殖等。即Wnt信號(hào)通路組成繁雜，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。目前研究認(rèn)為，Wnt信號(hào)通路至少包括3個(gè)分支，即Wnt（Wnt/β-環(huán)聯(lián)蛋白）、Wnt/PCP-JNK和Wnt/Ca2+通路［24］。經(jīng)典的Wnt/β-環(huán)聯(lián)蛋白信號(hào)通路激活細(xì)胞核內(nèi)靶細(xì)胞的表達(dá)。Wnt蛋白通過(guò)分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族（se?creted frizzled-related proteins family，SFRP）結(jié)合后的一系列反應(yīng)，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起β-環(huán)聯(lián)蛋白在胞漿中聚集，入核后引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。TCF4是眾多調(diào)控Wnt/β-環(huán)聯(lián)蛋白信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子中的一種，β-環(huán)聯(lián)蛋白濃度的增加可抑制ESC向三胚層分化，維持其干細(xì)胞特性［24］。因此，Wnt信號(hào)通路與角膜上皮干細(xì)胞以及角膜緣干細(xì)胞具有密切的關(guān)系。

2.2 Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)體表外胚層及角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育分化

轉(zhuǎn)錄因子4（transcription factor 4，TCF4）作為Wnt信號(hào)通路中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在維持干細(xì)胞特性的過(guò)程中具有十分重要的作用。近期一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，TCF4主要表達(dá)于角膜緣上皮細(xì)胞的基底膜層，角膜上皮干細(xì)胞也集中表達(dá)于此區(qū)域。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G亞家族成員2（ATP-binding cassette sub-family G member 2， ABCG2）和p63作為角膜上皮干/祖細(xì)胞的重要標(biāo)志物，與TCF4的表達(dá)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明Wnt信號(hào)通路在角膜上皮發(fā)育，尤其是角膜上皮干細(xì)胞及祖細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，發(fā)揮重要的調(diào)控作用［24］。另一項(xiàng)關(guān)于Wnt/β-環(huán)聯(lián)蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)角膜上皮干細(xì)胞、祖細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Wnt2，Wnt6，Wnt11，Wnt16b和其他4種Wnt抑制物特異性地表達(dá)于角膜緣區(qū)域，而Wnt3，Wnt7a，Wnt7b以及Wnt10a在角膜中央?yún)^(qū)上皮高度表達(dá)。Wnt/β-環(huán)聯(lián)蛋白信號(hào)通路的激活可上調(diào)角膜上皮干細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖能力，使其祖細(xì)胞標(biāo)記ΔNp63α表達(dá)上調(diào)，而角膜分化成熟的標(biāo)志性標(biāo)記物K12表達(dá)下調(diào)［25］。TCF4與β-環(huán)聯(lián)蛋白結(jié)合，作用于Wnt信號(hào)通路的某些基因如存活蛋白（survivin），調(diào)控細(xì)胞功能。存活蛋白基因的表達(dá)已被證實(shí)與細(xì)胞的“干細(xì)胞”特性密切相關(guān)，因此三者在角膜上皮祖細(xì)胞中高表達(dá)證明TCF4對(duì)于維持人角膜上皮祖細(xì)胞的增殖能力具有重要的作用［26］。在角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路也是小分子化合物作用的重要靶點(diǎn)。Wnt抑制劑小分子化合物IWR1e，可誘導(dǎo)人ESC向神經(jīng)外胚層方向分化，形成具有視杯樣結(jié)構(gòu)及復(fù)層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的組織［5］。另一種Wnt信號(hào)通路抑制劑小分子化合物IWP-2，通過(guò)選擇性抑制Porcn介導(dǎo)的Wnt棕櫚酰化作用，抑制Wnt信號(hào)通路及其分泌。IWP-2一般不影響Wnt/β-環(huán)聯(lián)蛋白信號(hào)通路，也不影響對(duì)Wnt信號(hào)刺激的細(xì)胞反應(yīng)，具有抑制向神經(jīng)外胚層方向分化，并增加向表皮外胚層方向分化的細(xì)胞比例的作用［27］。有文獻(xiàn)報(bào)道，利用IWP-2結(jié)合其他小分子化合物，可誘導(dǎo)人ESC來(lái)源的多能干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化［28］。

研究表明，Wnt信號(hào)通路的激活可促進(jìn)角膜上皮干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖和分化，其后抑制Wnt信號(hào)通路中某些調(diào)控位點(diǎn)，則可抑制其向神經(jīng)外胚層分化，促進(jìn)其向表皮外胚層及角膜上皮細(xì)胞方向分化。抑制不同的信號(hào)通路作用位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生不同的誘導(dǎo)作用。

3 BMP信號(hào)通路在表皮外胚層及角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)育中的作用

3.1 BMP信號(hào)通路

BMP是TGF-β超家族的成員。BMP最早發(fā)現(xiàn)于骨骼系統(tǒng)的發(fā)育形成過(guò)程中。TGF超家族整合了TGF-β和BMP信號(hào)通路，以及Nodal和存活蛋白配體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終通過(guò)Smad家族，整合至Smad4分子上。BMP可作為分泌信號(hào)，調(diào)節(jié)外胚層頂嵴功能，與機(jī)體整個(gè)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)［29］。BMP有2類受體，Ⅰ型受體包括BMPRIA（ALK3），BMPRIB（ALK6）和ActRL（ALK2，ALK1和ALK8），對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起決定作用；Ⅱ型受體包括BMPRⅡ，ActRⅡA和ActRⅡB。TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的實(shí)現(xiàn)包括其與受體的膜外結(jié)構(gòu)域結(jié)合以及絲氨酸/蘇氨酸激酶的激活。

3.2 BMP信號(hào)通路調(diào)節(jié)體表外胚層及角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育分化

目前研究發(fā)現(xiàn)，BMP信號(hào)通路在神經(jīng)誘導(dǎo)、神經(jīng)發(fā)生兩階段均發(fā)揮重要的作用。它通過(guò)激活SMAD家族的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)其信號(hào)通路，并激活一系列下游基因來(lái)發(fā)揮作用，同時(shí)，BMP信號(hào)通路在許多層次上受到其他信號(hào)通路及信號(hào)的調(diào)節(jié)［30］。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt，F(xiàn)GF和BMP聯(lián)合可誘導(dǎo)單層上皮細(xì)胞形成［31］。有研究表明，小鼠ESC中，BMP-4是向外胚層分化的一個(gè)重要誘導(dǎo)劑［32］。BMP信號(hào)通路在早期外胚層發(fā)育選擇過(guò)程中起到重要作用［33-35］。角膜上皮細(xì)胞來(lái)源于第5～6周胚胎表皮外胚層，此時(shí)晶體泡從體表外胚層完全分離出來(lái)，晶體泡表面的上皮相互融合，形成了一層立方狀上皮，隨后即分化成為角膜上皮細(xì)胞。在組織學(xué)發(fā)育上，晶體、嗅上皮及部分顱神經(jīng)神經(jīng)節(jié)來(lái)源于外胚層前胚板。利用人ESC的研究發(fā)現(xiàn)，BMP信號(hào)通路在胚胎發(fā)育早期的激活對(duì)于外胚層前胚板的形成起到短暫但卻不可替代的作用［32］。之前對(duì)小鼠ESC的研究表明，BMP信號(hào)通路在上皮發(fā)育過(guò)程中是不可或缺的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子［36］。最近，BMP-4已被證實(shí)可利用小鼠ESC誘導(dǎo)分化形成角化細(xì)胞［37］，同時(shí)通過(guò)向Smad4培養(yǎng)體系中加入維甲酸處理后，神經(jīng)外胚層基因表達(dá)量明顯降低。也有文獻(xiàn)稱，BMP-4在外胚層發(fā)育通路中可誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡［36］。BMP-4通過(guò)調(diào)節(jié)miR-23a/24-2/ 27a與Smad5的結(jié)合，可抑制小鼠ESC向表皮外胚層干細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞凋亡［38］。一項(xiàng)以人ESC為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在胚胎發(fā)育過(guò)程中加入BMP，可阻斷胚胎向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，誘導(dǎo)其向表皮方向發(fā)生。BMP通過(guò)Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)AP2γ的表達(dá)。而AP2γ的過(guò)度表達(dá)可抑制向神經(jīng)外胚層方向分化，促進(jìn)向表皮外胚層方向分化［39］。

BMP信號(hào)通路在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育分化過(guò)程中起到了重要的作用，在調(diào)節(jié)外胚層方向分化過(guò)程中，激活BMP信號(hào)通路可以抑制其向神經(jīng)上皮方向的分化，增加表皮外胚層分化的比例，結(jié)合其他誘導(dǎo)劑或小分子化合物，則可進(jìn)一步誘導(dǎo)向角膜上皮細(xì)胞方向的分化發(fā)育。

4 FGF信號(hào)通路在表皮外胚層及角膜上皮分化發(fā)育中的作用

4.1 FGF信號(hào)通路

FGF屬于生長(zhǎng)因子家族。在血管形成、傷口愈合、胚胎發(fā)育及其他多種內(nèi)分泌信號(hào)通路中起到重要調(diào)控作用。在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)GF-4是最早表達(dá)的因子。在四細(xì)胞時(shí)期、原腸胚時(shí)期、卵原筒階段以及原條形成過(guò)程中，F(xiàn)GF-4都發(fā)揮重要作用［40］。FGF對(duì)干細(xì)胞自我更新發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其信號(hào)通路在外胚層的發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道稱，F(xiàn)GF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要的誘導(dǎo)作用［41］。在角膜分化發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)GF-7和FGF-10由角膜間充質(zhì)細(xì)胞分泌，它們與分布于角膜緣和中央?yún)^(qū)角膜上皮細(xì)胞的FGF受體2（FGF receptor 2，F(xiàn)GFR2）結(jié)合，參與角膜緣干細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)角膜上皮細(xì)胞的自我更新與代謝［42-44］。

4.2 FGF信號(hào)通路調(diào)節(jié)體表外胚層及角膜上皮細(xì)胞的發(fā)育分化

表皮外胚層是外胚層一個(gè)重要的分化發(fā)育方向。在表皮外胚層來(lái)源的組織器官中，大量分布FGF及其各種受體，但關(guān)于該信號(hào)通路如何精確作用，誘導(dǎo)向表皮方向分化發(fā)育的文獻(xiàn)較少［45］。既往曾有研究顯示，在皮膚附器的發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)GF-10起到重要的調(diào)控作用［46］。最近研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)人ESC來(lái)源的多能干細(xì)胞系，利用b-FGF結(jié)合2種小分子化合物，可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞樣方向分化。該實(shí)驗(yàn)中，在無(wú)血清及無(wú)滋養(yǎng)層細(xì)胞條件下，利用上述誘導(dǎo)分子，可下調(diào)干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，上調(diào)角膜發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控因子如p63和pax6等，同時(shí)先后上調(diào)K14和K12的表達(dá)水平，獲得角膜上皮樣細(xì)胞［5］。利用具有fgfr2缺陷的基因敲除小鼠fgfr2CKO，觀察其胚胎發(fā)育可以得知，其角膜上皮層與基質(zhì)層與野生型相比，明顯變薄。在胚胎發(fā)育的晚期階段，fgfr2CKO小鼠角膜上皮及基質(zhì)層無(wú)標(biāo)志性基因K12的表達(dá)。pax6在胚胎E12.5有表達(dá)，隨后在E16.5表達(dá)消失，說(shuō)明FGFR2在維持pax6的持續(xù)表達(dá)中具有重要的作用，而且FGFR2的表達(dá)不依賴于ERK1/2信號(hào)通路［47］。

結(jié)合以上研究結(jié)果，F(xiàn)GF信號(hào)通路激活后可誘導(dǎo)干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞方向分化，表達(dá)終末角膜標(biāo)志性基因K12，同時(shí)可促進(jìn)角膜上皮發(fā)育過(guò)程中重要調(diào)控因子pax6的表達(dá)。

5 其他信號(hào)通路在表皮外胚層及角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)育中的作用

除上述4種主要信號(hào)通路外，其他信號(hào)通路也在一定程度上影響到ESC向角膜上皮樣細(xì)胞方向分化發(fā)育。Noggin就是其中一種比較重要的信號(hào)通路。Noggin也叫頭蛋白，是一種分泌型多肽，由NOG基因編碼，與BMP4相同，都屬于TGF-β超家族成員。Noggin是BMP信號(hào)通路的拮抗劑，通過(guò)抑制BMP信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，來(lái)調(diào)節(jié)干細(xì)胞向外胚層、表皮外胚層以及向角膜上皮樣細(xì)胞方向的分化。hedgehog信號(hào)通路在角膜上皮分化發(fā)育過(guò)程中也具有重要的作用。在哺乳動(dòng)物和鳥類中，hedgehog具有3種配體，分別是Dhh（desert hedgehog），Ihh（Indian hedgehog）和Shh（sonic hedgehog），這些信號(hào)通路中的調(diào)控蛋白的作用具有濃度依賴性，調(diào)控胚胎角膜上皮細(xì)胞分化發(fā)育、成體角膜緣干細(xì)胞特性維持等多種過(guò)程［48］。Shh信號(hào)通路在角膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，外源性Shh信號(hào)在調(diào)控角膜上皮遷移的過(guò)程中具有Pax6濃度依賴性，而在調(diào)控角膜上皮細(xì)胞增殖過(guò)程中則與Pax6濃度無(wú)關(guān)［49］。同時(shí)，hedgehog信號(hào)通路在調(diào)節(jié)晶體發(fā)育及晶體上皮細(xì)胞的增殖、存活過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，角膜上皮細(xì)胞發(fā)育缺陷多繼發(fā)于晶體遷移移行過(guò)程中的缺陷［50］。

6 結(jié)語(yǔ)

盡管角膜組織結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，組成有序，但角膜的胚胎分化發(fā)育過(guò)程至今仍未完全明了。Notch，Wnt，BMP和β-FGF等信號(hào)通路都對(duì)干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞的分化具有一定程度的影響。但目前尚無(wú)成熟方法誘導(dǎo)干細(xì)胞形成角膜上皮樣細(xì)胞。如能進(jìn)一步了解角膜上皮細(xì)胞的分化發(fā)育過(guò)程，明確其發(fā)育過(guò)程中信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在體外通過(guò)尋找已有的或通過(guò)人工合成藥物或小分子化合物，作用于不同時(shí)期、不同信號(hào)通路，激動(dòng)或抑制某些關(guān)鍵調(diào)控因子的作用，以達(dá)到模擬正常胚胎發(fā)育過(guò)程的效果，使其分化形成角膜上皮樣細(xì)胞。將獲得的角膜上皮樣細(xì)胞及相關(guān)藥物和小分子化合物應(yīng)用于臨床，治療眼表廣泛損傷患者，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

［1］Ahmad S，Stewart R，Yung S，Kolli S，Armstrong L，Stojkovic M，et al.Differentiation of human embry?onic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche［J］.Stem Cells，2007，25（5）：1145-1155.

［2］Boyette LB，Tuan RS.Adult stem cells and diseas?es of aging［J］.J Clin Med，2014，3（1）：88-134.

［3］Sun Y，Zhou J，Lin G，Lu GX.Activin A's promo?tion of definitive endoderm differentiation from human embryonic stem cells［J］.J Northwest A F Univ（Nat Sci Ed）〔（西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）〕，2012，40（2）：13-18.

［4］Murry CE，Keller G.Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations：lessons from embryonic development［J］.Cell，2008，132（4）：661-680.

［5］NakanoT，AndoS，TakataN，KawadaM，Muguruma K，Sekiguchi K，et al.Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs［J］.Cell Stem Cell，2012，10（6）：771-785.

［6］Talora C，Campese AF，Bellavia D，F(xiàn)elli MP，Vacca A，Gulino A，et al.Notch signaling and diseases：an evolutionary journey from a simple beginning to complexoutcomes［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1782（9）：489-497.

［7］Lu ZZ，Wang LS，Wu CT.Progress in notch signaling［J］.Prog Physiol Sci（生理科學(xué)進(jìn)展），2004，35（2）：135-138.

［8］Greenwald I.LIN-12/Notch Signaling：lessons from worms and flies［J］.Genes Dev，1998，12（12）：1751-1762.

［9］Artavanis-Tsakonas S，Rand MD，Lake RJ.Notch Signaling：cell fate control and signal integration in development［J］.Science，1999，284（5415）：770-776.

［10］Kopan R，Turner DL.The Notch pathway：democ?racy and aristocracy in the selection of cell fate［J］. Curr Opin Neurobiol，1996，6（5）：594-601.

［11］Uyttendaele H，Marazzi G，Wu G，Yan Q，Sassoon D，Kitajewski J.Notch4/int-3，A mammary proto-oncogene，is an endothelial cell-specific mammalian Notch gene［J］.Development，1996，122（7）：2251-2259.

［12］Lardelli M，Williams R，Mitsiadis T，Lendahl U. Expression of the Notch 3 intracellular domain in mouse central nervous system progenitor cells is lethal and leads to disturbed neural tube develop?ment［J］.Mech Dev，1996，59（2）：177-190.

［13］del Amo FF，Gendron-Maguire M，Swiatek PJ，Jenkins NA，Copeland NG，Gridley T.Cloning，analysis，and chromosomal localization of Notch-1，a mouse homolog of Drosophila notch［J］.Genom?ics，1993，15（2）：259-264.

［14］Jarriault S，Brou C，Logeat F，Schroeter EH，Kopan R，Israel A.Signalling downstream of acti?vated mammalian Notch［J］.Nature，1995，377（6547）：355-358.

［15］Shimizu K，Chiba S，Hosoya N，Kumano K，Saito T，Kurokawa M，et al.Binding of Delta1，Jagged1，and Jagged2 to Notch2 rapidly induces cleavage，nuclear translocation，and hyperphos?phorylation of Notch2［J］.Mol Cell Biol，2000，20（18）：6913-6922.

［16］Zhao M，Han W.Advances in the research of dis?eases related to notch signaling pathway［J］.Prog Biochem Biophys（生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展），2006，33（12）：1154-1160.

［17］Yugawa T，Nishino K，Ohno S，Nakahara T，F(xiàn)ujita M，Goshima N，et al.Noncanonical NOTCH signaling limits self-renewal of human epithelial and induced pluripotent stem cells through ROCK activation［J］.Mol Cell Biol，2013，33（22）：4434-4447.

［18］Tadeu AM，Horsley V.Notch signaling represses p63 expression in the developing surface ectoderm［J］.Development，2013，140（18）：3777-3786.

［19］Senoo M，Pinto F，Crum CP，McKeon F.p63 Is essential for the proliferative potential of stem cells in stratified epithelia［J］.Cell，2007，129（3）：523-536.

［20］Ma A，Boulton M，Zhao B，Connon C，Cai J，Albon J.A role for notch signaling in human corneal epithelial cell differentiation and proliferation［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（8）：3576-3585.

［21］Djalilian AR，Namavari A，Ito A，Balali S，Afshar A，Lavker RM，et al.Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation［J］.Mol Vis，2008，14：1041-1049.

［22］Lu H，Lu Q，Zheng Y，Li Q.Notch signaling promotes the corneal epithelium wound healing［J］. Mol Vis，2012，18：403-411.

［23］Movahedan A， Majdi M， Afsharkhamseh N，Sagha HM，Saadat NS，Shalileh K，et al.Notch inhibition during corneal epithelial wound healing promotes migration［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53（12）：7476-7483.

［24］Lu R，Qu Y，Ge J，Zhang L，Su Z，Pflugfelder SC，et al.Transcription factor TCF4 maintains the prop?erties of human corneal epithelial stem cells［J］. Stem Cells，2012，30（4）：753-761.

［25］Nakatsu MN，Ding Z，Ng MY，Truong TT，Yu F，Deng SX.Wnt/β-catenin signaling regulates prolif?eration of human cornea epithelial stem/progenitor cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52（7）：4734-4741.

［26］Lu R，Bian F，Zhang X，Qi H，Chuang EY，Pflugfelder SC，et al.The β-catenin/TCF4/survivin signaling maintains a less differentiated phenotype and high proliferative capacity of human corneal epithelial progenitor cells［J］.Int J Biochem Cell Biol，2011，43（5）：751-759.

［27］ Han PP，Zheng RN.Wnt signal pathway and its role in disease［J］.Biotechnol Bull（生物技術(shù)通報(bào)），2009，（11）：13-15.

［28］Mikhailova A，Ilmarinen T，Uusitalo H，Skottman H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells［J］.Stem Cell Reports，2014，2（2）：219-231.

［29］Wong YL，Behringer RR，Kwan KM.Smad1/ Smad5 signaling in limb ectoderm functions redun?dantly and is required for interdigital programmed cell death［J］.Dev Biol，2012，363（1）：247-257.

［30］Zimmerman LB，De Jesús-Escobar JM，Harland RM. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4［J］.Cell，1996，86（4）：599-606.

［31］Benitah SA，F(xiàn)rye M.Stem cells in ectodermal development［J］.J Mol Med（Berl），2012，90（7）：783-790.

［32］Leung AW，Kent Morest D，Li JY.Differential BMP signaling controls formation and differentiation of multipotent preplacodal ectoderm progenitors from human embryonic stem cells［J］.Dev Biol，2013，379（2）：208-220.

［33］Moll R，F(xiàn)ranke WW，Schiller DL，Geiger B，Krepler R.The catalog of human cytokeratins：patterns of expression in normal epithelia，tumors and cultured cells［J］.Cell，1982，31（1）：11-24.

［34］Bakkers J，Hild M，Kramer C，F(xiàn)urutani-Seiki M，Hammerschmidt M.Zebrafish delta Np63 is a direct target of BMP signaling and encodes a transcriptional repressor blocking neural specification in theventral ectoderm［J］.Dev Cell，2002，2（5）：617-627.

［35］Wilson PA，Hemmati-Brivanlou A.Induction of epi?dermis and inhibition of neural fate by BMP-4［J］. Nature，1995，376（6538）：331-333.

［36］Gambaro K，Aberdam E，Virolle T，Aberdam D，Rouleau M.BMP-4 induces a Smad-dependent apoptotic cell death of mouse embryonic stem cellderived neural precursors［J］.Cell Death Differ，2006，13（7）：1075-1087.

［37］Coraux C，Hilmi C，Rouleau M，Spadafora A，Hinnrasky J，Ortonne JP，et al.Reconstituted skin from murine embryonic stem cells［J］.Curr Biol，2003，13（10）：849-853.

［38］Hadjimichael C，Nikolaou C，Papamatheakis J，Kretsovali A.MicroRNAs for fine-tuning of mouse embryonic stem cell fate decision through regula?tion of TGF-β signaling［J］.Stem Cell Reports，2016，6（3）：292-301.

［39］Qiao Y，Zhu Y，Sheng N，Chen J，Tao R，Zhu Q，et al.AP2γ regulates neural and epidermal devel?opment downstream of the BMP pathway at early stages of ectodermal patterning［J］.Cell Res，2012，22（11）：1546-1561.

［40］Rappolee DA，Basilico C，Patel Y，Werb Z. Expression and function of FGF-4 in peri-implanta?tion development in mouse embryos［J］.Develop?ment，1994，120（8）：2259-2269.

［41］Coutu DL，Galipeau J.Roles of FGF signaling in stem cell self-renewal，senescence and aging［J］. Aging（Albany NY），2011，3（10）：920-933.

［42］Li DQ， Tseng SC.Differential regulation of cyto?kine and receptor transcript expression in human corneal and limbal fibroblasts by epidermal growth factor，transforming growth factor-alpha，plateletderived growth factor B，and interleukin-1 beta［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，1996，37（10）：2068-2080.

［43］deIonghRU，LovicuFJ，ChamberlainCG，McAvoy JW.Differential expression of fibroblast growth factor receptors during rat lens morphogen?esis and growth［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1997，38（9）：1688-1699.

［44］Li DQ，Tseng SC.Differential regulation of kerati?nocyte growth factor and hepatocyte growth factor/ scatter factor by different cytokines in human cor?neal and limbal fibroblasts［J］.J Cell Physiol，1997，172（3）：361-372.

［45］Yue Z，Jiang TX，Wu P，Widelitz RB，Chuong CM. Sprouty/FGF signaling regulates the proximal-dis?tal feather morphology and the size of dermal papil?lae［J］.Dev Biol，2012，372（1）：45-54.

［46］Cohen MA，Itsykson P，Reubinoff BE.The role of FGF-signaling in early neural specification of human embryonic stem cells［J］.Dev Biol，2010，340（2）：450-458.

［47］Zhang J，Upadhya D，Lu L，Reneker LW.Fibro?blast growth factor receptor 2（FGFR2）is required for corneal epithelial cell proliferation and differenti?ation during embryonic development［J］.PLoS One，2015，10（1）：e0117089.

［48］Echelard Y，Epstein DJ，St-Jacques B，Shen L，Mohler J，McMahon JA，et al.Sonic hedgehog，a member of a family of putative signaling mole?cules，is implicated in the regulation of CNS polarity［J］.Cell，1993，75（7）：1417-1430.

［49］Kucerova R， Dorà N， Mort RL，Wallace K，Leiper LJ，Lowes C，et al.Interaction between hedgehog signalling and PAX6 dosage mediates maintenance and regeneration ofthe corneal epithelium［J］.Mol Vis，2012，18：139-150.

［50］Choi JJ， Ting CT， Trogrlic L， Milevski SV，F(xiàn)amilari M，Martinez G，et al.A role for smooth?ened during murine lens and cornea development［J］.PLoS One，2014，9（9）：e108037.

Signaling pathways inducing embryonic stem cells to differentiate into epidermal and corneal epithelial cells

HOU Lu-lu1,2,HUANG Yi-fei1
(1.Department of Ophthalmology,General Hospital of PLA,Beijing 100853,China;2.Department of Ophthalmology,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,China)

Stem cells are a group of self-renewal cells with the potential to differentiate into a variety of cell lineages.Embryonic stem cells can differentiate into more than 200 types of cell lineages belongingto endodermal,mesodermal and ectodermal tissues.Corneal epithelial cells derive from epidermal ectoderm during embryonic development.When the ocular surface is severely damaged,corneal epithelium with proliferation potential is essential for its reconstruction.Recent studies are focused on differentiation of bioactive corneal epithelial cells.This review summarizes signaling pathways including Notch,Wnt,bone morphogenetc protein or fibroblast growth factor pathways that are involved in regu?lating the development of embryonic ectoderm and corneal epithelial cells revealed in previous studies.

embryonic stem cells;ectoderm;corneal epithelial cell;signaling pathway

HUANG Yi-fei,E-mail:huangyf301@gmail.com

R966

A

1000-3002-（2017）02-0195-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.11

Foundation item:The project supported by National Basic Research Program of China(973 Program)(2013CB967001); and National Natural Science Foundation of China(31271059);and National Natural Science Foundation of China (81670830)

2016-06-09 接受日期：2017-02-08）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2013CB967001）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31271059）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81670830）作者簡(jiǎn)介：侯璐璐，女，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事角膜病臨床治療研究；E-mail：houluraul7@163.com；黃一飛，男，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事角膜病和眼外傷等臨床治療研究。

黃一飛，E-mail：huangyf301@gmail.com