煙曲霉素對(duì)蜜蜂微孢子蟲治療效果研究

煙曲霉素對(duì)蜜蜂微孢子蟲治療效果研究

一、前言

煙曲霉素是一種從煙曲霉中分離得到的抗生素，是目前唯一一種能夠有效治療微孢子蟲病的藥物，近六十年來被廣泛應(yīng)用于西方蜜蜂微孢子蟲病的治療。最近發(fā)現(xiàn)它也能抑制東方微孢子蟲的繁殖。

2004年，Huang WF等發(fā)現(xiàn)，從中華蜜蜂中提取的東方孢子蟲可以感染意大利蜜蜂，這引起了人們對(duì)于蜜蜂健康的擔(dān)憂。在意大利和西班牙，蜜蜂的數(shù)量逐年下降，這與孢子蟲病的盛行不無關(guān)系。Pajuelo AG和Williams GR等人研究證明，在一定的濃度下，煙曲霉素不但可以控制西方孢子蟲的繁殖，對(duì)東方孢子蟲同樣有效。這導(dǎo)致煙曲霉素的銷量上升，蜂產(chǎn)品中抗生素的殘留情況也隨之加劇。因此，在美國，煙曲霉素是禁止在流蜜期使用的，蜂農(nóng)在晚秋和早春施用煙曲霉素用作對(duì)微孢子蟲病的預(yù)防，流蜜期間煙曲霉素會(huì)逐漸降解，整個(gè)禁止期長達(dá)六個(gè)月。

這種間歇式的給藥方式使蜜蜂和微孢子蟲持續(xù)處于煙曲霉素的暴露當(dāng)中，盡管這種方式有利于形成煙曲霉素抗性的微孢子蟲，但是Higes M，Cox-Foster DL等人研究證明，西方孢子蟲并沒有形成抗性，而東方孢子蟲卻表現(xiàn)出對(duì)煙曲霉素的不敏感性，這使東方孢子蟲取代西方孢子蟲成為一個(gè)趨勢(shì)。

煙曲霉素能夠抑制兔腦炎原蟲（一種以人為寄主的微孢子蟲）的甲硫氨酸氨肽酶2（MetAP2），大多數(shù)的真核生物有兩種MetAP的亞型，MetAP1和MetAP2，其中MetAP2是煙曲霉素的靶點(diǎn)蛋白。然而，MetAP2蛋白基因在所有的真核生物中有60%的同源性，因此，煙曲霉素雖然被用作治療微孢子蟲和某些癌癥的藥物，同時(shí)也會(huì)對(duì)人和其它脊椎動(dòng)物的健康造成一定的危害。Webster TC和Rada V已經(jīng)證明，攝入煙曲霉素的蜂王和工蜂壽命會(huì)縮短，但是這種抗生素對(duì)蜜蜂的潛在毒性目前研究的還較少。

本文中，Wei-Fone Huang等用低濃度的煙曲霉素來探究降解過程中的煙曲霉素對(duì)東方和西方孢子蟲的影響。為了探明不同種屬的微孢子蟲（東方孢子蟲、西方孢子蟲、熊蜂孢子蟲）對(duì)煙曲霉素敏感性的差異，他們比較了三種孢子蟲的MetAP2蛋白的基因序列。此外，他們對(duì)未感染微孢子蟲而使用了煙曲霉素的蜜蜂中腸蛋白進(jìn)行了二維電泳。結(jié)果顯示：低濃度的煙曲霉素不但無法抑制微孢子蟲的增殖，反而會(huì)干擾蜜蜂中腸組織的生理機(jī)能。

二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果

1. 煙曲霉素給藥組微孢子蟲繁殖情況

感染孢子蟲的蜜蜂給以不同濃度的煙曲霉素處理（25 mg/l以及0.02×，0.01×，0.002×，0.001×，0.0002×，0.00006×，0.00001×，0.0000033×，0×），結(jié)果顯示，東方孢子蟲和西方孢子蟲的繁殖情況明顯不同。

對(duì)于0.01×和0.001×給藥組，東方孢子蟲的數(shù)量分別比西方孢子蟲高165%和129%，東方孢子蟲煙曲霉素空白組的數(shù)量比西方孢子蟲高30%。1.0×煙曲霉素對(duì)東西方孢子蟲均有顯著抑制作用。0.04×濃度組的東方孢子蟲數(shù)量顯著低于煙曲霉素空白組。0.02×濃度組抑制作用不顯著，并且在后期有一個(gè)重新爆發(fā)的趨勢(shì)。0.01×濃度組孢子數(shù)與煙曲霉素空白組孢子數(shù)相似。作為對(duì)照，西方孢子蟲在0.01×濃度時(shí)即受到抑制。濃度為0.002×?xí)r，煙曲霉素對(duì)兩種孢子蟲均失去效果。濃度在0.0000033×~0.01×范圍內(nèi)，東方孢子蟲數(shù)量明顯高于煙曲霉素空白組。而對(duì)于西方孢子蟲來說，濃度≤0.002×范圍內(nèi)，孢子數(shù)量與煙曲霉素空白組沒有明顯差異。

2. MetAP2蛋白基因序列的比較

比較了東方孢子蟲、西方孢子蟲、熊蜂孢子蟲的MetAP2基因，并與蜜蜂和人的MetAP2蛋白基因進(jìn)行比較。熊蜂孢子蟲為868 bp（GenBank編號(hào)：JQ927011），西方孢子蟲為926 bp（GenBank編號(hào)：JQ927010）。這些序列在C末端缺少65個(gè)氨基酸序列的堿基對(duì)，N末端缺少2個(gè)氨基酸序列的堿基對(duì)。但是包含所有的煙曲霉素結(jié)合位點(diǎn)和必要的金屬離子配位點(diǎn)序列，足以用來探究煙曲霉素和MetAP2的相互作用。

結(jié)果顯示，東方孢子蟲和熊蜂孢子蟲相似度為83%，東方孢子蟲和西方孢子蟲相似度73%，西方孢子蟲和熊蜂孢子蟲相似度82%。

3. 煙曲霉素處理組蜜蜂中腸的蛋白提取和2-D凝膠電泳

0.0，1.0，0.01和 0.001×25 mg/l煙曲霉素處理組的未感染蜜蜂用于蛋白試驗(yàn)。通過對(duì)二維電泳蛋白點(diǎn)的有無、數(shù)量和位置進(jìn)行鑒定比較煙曲霉素對(duì)蜜蜂中腸蛋白的影響。ESI-LC/MS和Mascot (Matrix Science)數(shù)據(jù)庫鑒定出45種與能量代謝、線粒體、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)輸有關(guān)的蛋白。在不同煙曲霉素濃度組中，α-肌動(dòng)蛋白的亞型處于凝膠的不同位置，數(shù)量有所增加。α-葡萄糖苷酶Ⅱ的亞型也有所變化，其三種亞型在所有的處理組中都被發(fā)現(xiàn)，但是其比率有所不同。位于線粒體中的H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶β亞基的亞型Ⅰ，在不同的煙曲霉素濃度處理組中呈現(xiàn)不同的分子質(zhì)量。另外，在所有煙曲霉素濃度組中，均發(fā)現(xiàn)一種依賴電壓的陰離子選擇通道蛋白，其沒有出現(xiàn)在煙曲霉素空白組中。

4. 相關(guān)基因和蛋白的序列號(hào)信息

西方孢子蟲和熊蜂孢子蟲MetAP2蛋白基因的部分序列可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到，序列號(hào)分別是JQ927010和JQ927011。東方孢子蟲MetAP2蛋白的GenBank基因序列號(hào)為XM002996491。蜜蜂和人的MetAP2蛋白的氨基酸序列號(hào)分別是XP624161 和 NP006829，果蠅是AAC05144，酵母是S45411，兔腦炎原蟲是AF440270，hellem大腸桿菌是AY224694，intestinalis大腸桿菌是AY224693。

三、討論

低濃度的煙曲霉素可以促進(jìn)東西方孢子蟲的繁殖，這種情況在東方孢子蟲中更加嚴(yán)重，低濃度煙曲霉素或許能影響孢子蟲和宿主的相互關(guān)系。西班牙的一個(gè)蜂場試驗(yàn)報(bào)道，施用煙曲霉素三個(gè)月以后其濃度會(huì)降到0.001×，雖然美國聯(lián)邦藥物管理局禁止在流蜜期使用煙曲霉素，市場上蜂蜜檢測(cè)到的煙曲霉素的濃度仍然在60 ng/g，大約是0.0024×濃度。經(jīng)過計(jì)算，煙曲霉素在蜂場中的降解速度大約是-log10/月。利用這個(gè)計(jì)算結(jié)果，推測(cè)使用煙曲霉素以后，東方孢子蟲重新增殖的時(shí)間大約是2~5.5個(gè)月，后期還需要更多的蜂場試驗(yàn)來驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)。

相對(duì)于西方孢子蟲，在使用煙曲霉素以后，東方孢子蟲能夠更快的重新增殖，同一條件下其孢子蟲數(shù)量是西方孢子蟲的兩倍，而在未使用煙曲霉素的情況下，東方孢子蟲的數(shù)量僅稍多于西方孢子蟲。對(duì)煙曲霉素的低敏感性，預(yù)示著東方孢子蟲可能會(huì)取代西方孢子蟲，成為蜜蜂孢子蟲病的主要病原體。

對(duì)三種孢子蟲的MetAP2基因序列的比較也許可以揭示不同孢子蟲對(duì)煙曲霉素敏感性不同的原因，對(duì)于MetAP2的基因序列和氨基酸序列來說，東方孢子蟲和熊蜂孢子蟲更為接近，而系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示，西方孢子蟲和熊蜂孢子蟲親緣關(guān)系更近（熊蜂孢子蟲不受煙曲霉素控制）。這說明三種孢子蟲的MetAP2沒有明顯的差別，預(yù)示著MetAP2可能不是唯一影響煙曲霉素藥效的因素。蜜蜂與孢子蟲MetAP2高度的相似性預(yù)示著東方孢子蟲大量增殖時(shí)，蜜蜂也會(huì)受到某種潛在的影響。

MetAP2參與很多蛋白的翻譯修飾，但是其全部功能還不為所知。使用了煙曲霉素的蜜蜂中腸蛋白分析結(jié)果表明，低濃度的煙曲霉素不但會(huì)加速微孢子蟲的繁殖，反而會(huì)影響蜜蜂中腸正常的生理機(jī)能。與高濃度的煙曲霉素相比，0.001×濃度時(shí)，與結(jié)構(gòu)和代謝相關(guān)的蛋白變化微弱，但是仍然可以觀察到。雖然沒有找到能夠抑制微孢子蟲的蛋白，但是一些蛋白的亞型例如α-肌動(dòng)蛋白、葡萄糖苷酶，在不同煙曲霉素濃度處理組有所變化。肌動(dòng)蛋白的變化可以作為蜜蜂成功感染胞內(nèi)頂復(fù)門寄生蟲的標(biāo)志，α-葡萄糖苷酶Ⅱ亞型是碳水化合物代謝所必須，其它一些變化的蛋白位于線粒體，與能量的代謝有關(guān)。這些蛋白亞型的變化有可能與MetAP2的蛋白修飾作用被干擾有關(guān)。

殺蟲劑和東方孢子蟲之間可能的協(xié)同作用之前已經(jīng)被報(bào)道過，我們發(fā)現(xiàn)煙曲霉素的作用與這些殺蟲劑高度的相似，煙曲霉素降解成低濃度以后這種協(xié)同作用會(huì)增強(qiáng)。煙曲霉素的使用是為了控制微孢子蟲的繁殖，但是這種抗生素很有可能會(huì)導(dǎo)致東方孢子蟲的盛行和傳播。雖然說有必要進(jìn)行更多的蜂場試驗(yàn)來驗(yàn)證煙曲霉素對(duì)孢子蟲是否有效，但是更重要的是找到一種控制孢子蟲的新方法。以孢子蟲為靶點(diǎn)，又不影響蜜蜂的生理機(jī)能的新的藥物的研制對(duì)于控制蜜蜂微孢子蟲的發(fā)展至關(guān)重要。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所 孫明輝 編譯