環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)熊蜂中的微孢子蟲(chóng)

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)熊蜂中的微孢子蟲(chóng)

郭禮強(qiáng)，韓 亮，張麗萍，田國(guó)寧，趙 晗

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041）

為快速檢測(cè)進(jìn)口熊蜂中的微孢子蟲(chóng)，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplifcation，LAMP）。針對(duì)熊蜂微孢子蟲(chóng)核糖體保守基因設(shè)計(jì)LAMP引物，以熊蜂微孢子蟲(chóng)DNA、家蠶微孢子蟲(chóng)DNA、蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)DNA、兔腦炎微孢子蟲(chóng)DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，分別采用濁度法和顯色法驗(yàn)證LAMP引物的特異性；并將含微孢子蟲(chóng)基因的質(zhì)粒模板10倍梯度稀釋，考察方法的敏感性。結(jié)果表明，LAMP法能有效、特異地檢測(cè)出熊蜂寄生微孢子蟲(chóng)DNA，靈敏度比PCR法高10倍。該方法簡(jiǎn)單、快速、敏感，可應(yīng)用于熊蜂寄生微孢子蟲(chóng)的便捷檢測(cè)中。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；熊蜂；微孢子蟲(chóng)；檢測(cè)

熊蜂屬于膜翅目蜜蜂科熊蜂屬，其體毛長(zhǎng)且密集，喙長(zhǎng)，對(duì)低溫適應(yīng)性強(qiáng)，在封閉的溫室作物上能專心授粉，因而成為溫室中比蜜蜂更理性的授粉昆蟲(chóng)。我國(guó)的設(shè)施栽培果蔬面積居世界第一位，熊蜂授粉應(yīng)用潛力巨大[1]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，從國(guó)外進(jìn)口優(yōu)質(zhì)熊蜂成為一些蔬果種植企業(yè)的迫切需求。然而，熊蜂可能攜帶病原微生物，如微孢子蟲(chóng)等有害外來(lái)物種，會(huì)給國(guó)內(nèi)熊蜂和蜜蜂等昆蟲(chóng)帶來(lái)新物種入侵風(fēng)險(xiǎn)。Valeriya等[2]報(bào)道，在西班牙捕獲的16個(gè)種727個(gè)熊蜂中，有64個(gè)樣本顯示微孢子蟲(chóng)陽(yáng)性。熊蜂中主要有3種微孢子蟲(chóng)，分別為Nosena bombi、Apicystis bombi和Crithidia bombi。熊蜂微孢子蟲(chóng)存在于血淋巴細(xì)胞、馬氏管、脂肪體和直腸，為熊蜂的一種嚴(yán)重病害。其孢子長(zhǎng)4.6 ～7.0 μm，寬1.8～4.0 μm。孢子蟲(chóng)入侵熊蜂腹部，可導(dǎo)致其腹瀉，并抑制其交尾，患重病的蜂后不能越冬即死亡。中度感染的蜂后雖然可以越冬，但很難形成蜂群，即使形成小種群，蜂后也會(huì)早死。同時(shí)，微孢子蟲(chóng)宿主非常廣泛，可以是昆蟲(chóng)、魚(yú)類、嚙齒類及靈長(zhǎng)類等動(dòng)物的寄生病原[3]，其潛在的傳入風(fēng)險(xiǎn)不容低估。為此，日本因歐洲生產(chǎn)的熊蜂對(duì)其生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了不利影響[4]，在2005年開(kāi)始實(shí)施“特定外來(lái)生物法”。外來(lái)熊蜂的不利因素主要有兩個(gè)方面：一是外來(lái)熊蜂可破壞國(guó)內(nèi)昆蟲(chóng)和植物間的授粉關(guān)系；二是進(jìn)口熊蜂本體易攜帶寄生蟲(chóng)。

目前對(duì)微孢子蟲(chóng)的檢驗(yàn)主要是肉眼鑒定、顯微鏡鏡檢和分子生物學(xué)檢測(cè)[5-12]。肉眼鑒定和顯微鏡鏡檢比較方便、成本低，不需要專業(yè)的檢測(cè)技術(shù)，但監(jiān)控手段滯后，只有當(dāng)病害發(fā)展到一定程度時(shí)，才能發(fā)現(xiàn)，損失和風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法避免。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖然檢測(cè)成本略高，但靈敏度高、特異性好，在病蟲(chóng)害的早期就能發(fā)現(xiàn)，從而能做到提前預(yù)防和有針對(duì)性地治療。本研究利用 LAMP技術(shù)的高靈敏度和特異性，建立的熊峰微孢子蟲(chóng)檢測(cè)方法，為監(jiān)管部門和熊峰養(yǎng)殖企業(yè)提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

熊蜂微孢子蟲(chóng)DNA：USDA-ARS Pollinating Insects Research Unit（Department of Biology，Utah State University）提供。家蠶微孢子蟲(chóng)DNA、蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)DNA、兔腦炎微孢子蟲(chóng)DNA：北京藍(lán)譜生物科技有限公司提供；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法FDR熒光檢測(cè)試劑盒：北京藍(lán)譜生物科技有限公司（試劑盒組成：2×反應(yīng)混合液，Bst DNA聚合酶，顯色液）；2xTaq PCR Master mix：TIANGEN，貨號(hào)：KT201；臺(tái)式高速離心機(jī)：5417R，德國(guó)Eppendorf公司；PCR儀：伯樂(lè)CFX96；超微量核酸蛋白分析儀：DU-800，美國(guó)Beckman公司；實(shí)時(shí)濁度儀：LA-320c，榮研生物科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 DNA提取

參照文獻(xiàn)[12]提取樣品DNA。

1.3 引物序列

本研究根據(jù)美國(guó)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)微孢子蟲(chóng)線粒體（GenBank Accession No.AY741101.1）基因序列，以微孢子蟲(chóng)保守基因?yàn)榘袠?biāo)，通過(guò)日本榮研化學(xué)公司的引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)頁(yè)（http:// primerexplorer.jp/e/），設(shè)計(jì)5套微孢子蟲(chóng)引物，序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HPLC純化。

表1 引物序列

1.4 反應(yīng)條件

1.4.1 LAMP反應(yīng)條件。根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，利用FDR熒光檢測(cè)試劑盒配制25 μL反應(yīng)混合物：2×反應(yīng)混合液 12.5 μL，引物混合液（引物濃度40 pmol FIP 和BIP，5 pmol F3 和 B3，20 pmol LB和LF）2.6 μL，雙蒸水5.9 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，樣本DNA 2 μL，顯色液1 μL。反應(yīng)條件：65 ℃，60 min，80 ℃，10 min，在實(shí)時(shí)濁度儀上完成反應(yīng)。

1.4.2 PCR反應(yīng)條件。引物為P2-F3、P2-B3。25 μL PCR 反應(yīng)總體積的組成：2×Taq MIX 12.5 μL，各10 pmol引物，模板2 μL，補(bǔ)水至25 μL。擴(kuò)增循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后延伸7 min。

1.5 引物特異性

用熊蜂微孢子蟲(chóng)DNA、家蠶微孢子蟲(chóng)DNA、蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)DNA、兔腦炎微孢子蟲(chóng)DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，驗(yàn)證LAMP引物的特異性，分別采用濁度法和顯色法來(lái)檢測(cè)結(jié)果。

1.6 靈敏度試驗(yàn)

將含微孢子蟲(chóng)基因的質(zhì)粒模板10倍梯度稀釋，通過(guò)LAMP 反應(yīng)和PCR反應(yīng)檢測(cè)驗(yàn)證方法的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的選擇

利用5套引物對(duì)含保守DNA基因片段的質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度108拷貝/μL）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以最先開(kāi)始擴(kuò)增DNA序列的引物組合為最佳引物。從圖1中可以看出引物P2最先開(kāi)始發(fā)生LAMP反應(yīng)，故將P2引物組選為最佳引物。

圖1 最佳引物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 引物特異性試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照用含熊蜂微孢子蟲(chóng)的DNA為模板，并用家蠶微孢子蟲(chóng)、蝗蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)、兔腦炎微孢子蟲(chóng)為對(duì)照樣本檢測(cè)其特異性。當(dāng)反應(yīng)體系中存在熊蜂微孢子蟲(chóng)基因時(shí)，便發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂白色沉淀，反應(yīng)液的濁度上升。從圖2中可以看出，只有陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增雙曲線，這表明設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性。采用顯色法來(lái)觀察結(jié)果，其結(jié)果與濁度法一致（圖3）。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

圖2 最佳引物的特異性濁度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 顯色法比對(duì)結(jié)果

為考察方法的敏感性，將含微孢子蟲(chóng)基因的質(zhì)粒模板10倍梯度稀釋，濃度分別為105、104、103、102、101、100拷貝/μL，通過(guò)LAMP 反應(yīng)來(lái)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。從濁度擴(kuò)增曲線可以看出，LAMP方法的最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到10 拷貝/μL（圖4）。取PCR 產(chǎn)物8 μL，在1% 含EB瓊脂糖凝膠電泳上100 V 電泳35 min，在凝膠成像系統(tǒng)下照像檢測(cè)。從圖5可以看出，PCR最低檢測(cè)濃度為102拷貝/μL，說(shuō)明LAMP方法的靈敏度至少要比PCR方法高10倍。

2.4 反應(yīng)時(shí)間的確定

LAMP反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，其靈敏度越高，但過(guò)分追求靈敏度會(huì)造成假陽(yáng)性的幾率升高。從圖4中的敏感性濁度擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果可知，質(zhì)粒濃度為103拷貝/μL時(shí)，LAMP反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)最佳。

3 結(jié)論

本研究探索建立的熊蜂微孢子蟲(chóng)LAMP鑒別方法，具有良好的穩(wěn)定性和靈敏度，與常規(guī)PCR方法比較，靈敏度至少可以提高10倍，并省去了常規(guī)PCR方法需要電泳分析的操作，顯著降低了檢驗(yàn)檢疫的監(jiān)控成本，易于推廣普及。

圖4 最佳引物檢測(cè)的敏感性濁度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 PCR敏感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Detection of Microsporidia in Bumble Bees by Loop-mediated Isothermal Amplification

Guo Liqiang，Han Liang，Zhang Liping，Tian Guoning，Zhao Han
（Weifang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang，Shandong 261041）

In order to rapidly detect Microsporidia in imported bumble bees，a method of loop-mediated isothermal amplifcation（LAMP）was developed. Firstly，the LAMP primers were designed according to the conservative gene of Microsporidia ribosome in bumble bees，then through different DNA templates including Nosema bombi，Nosema bombycis，Nosema locustae and Encephalitozoon cuniculithe，the specifcity of this LAMP method was verifed by both turbidimetric and color-developing method. Meanwhile，its sensibility was investigated by using plasmid templates of Nosema bombi gene of 10-fold serial dilution. It's showed that the developed LAMP method could detect Nosema bombi DNA effectively and specifcally，and its sensitivity was ten times higher than that of PCR method. Due to the characteristics of simplicity，speediness and accuracy，this method could be applied to the detection of Microsporidia in bumble bees.

loop-mediated isothermal amplifcation（LAMP）；bumble bees；Microsporidia；detection

book=97,ebook=103

S851.34+7.32

A

1005-944X（2017）01-0097-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.027

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研基金 （SK201627）；濰坊市2015年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（2015ZJ1101）