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    通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒基因組及其高通量測序

    2017-01-14 00:46:37王楷宬紀(jì)海旺莊青葉王素春于建敏許榮強(qiáng)陳繼明
    中國動物檢疫 2017年1期
    關(guān)鍵詞:高通量流感病毒毒株

    王楷宬,邱 源,紀(jì)海旺,彭 程,莊青葉,王 通,王素春,于建敏,許榮強(qiáng),陳繼明

    (1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;2. 嶗山區(qū)王哥莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,山東青島 266105)

    通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒基因組及其高通量測序

    王楷宬1,邱 源1,紀(jì)海旺2,彭 程1,莊青葉1,王 通1,王素春1,于建敏1,許榮強(qiáng)1,陳繼明1

    (1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;2. 嶗山區(qū)王哥莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心,山東青島 266105)

    為探索使用高通量測序方法測定甲型流感病毒的基因組,設(shè)計(jì)了一對通用引物進(jìn)行甲型流感病毒全基因組的RT-PCR擴(kuò)增,并分析了該方法的敏感性。結(jié)果顯示,該方法能夠擴(kuò)增的甲型流感病毒多種亞型的全部8個節(jié)段的基因,其擴(kuò)增敏感性為100 pg RNA。

    甲型流感病毒;通用引物;基因組;高通量測序

    甲型流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬,為有包膜分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA 病毒。其基因組由8個單股負(fù)鏈RNA片段組成,每個基因在3′末端和5′末端都帶有12~13個保守核苷酸序列。這8個片段可編碼10種蛋白,其中8個蛋白(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)為結(jié)構(gòu)蛋白,NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白,位于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中[1]。根據(jù)HA 和NA 抗原性的差異,甲型流感病毒可分為若干亞型,迄今已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞型(H1~H18)和11種NA亞型(N1~N11)[2-4]。任何一對HA 和NA 均可組合成一個亞型,如H1N1、H5N1、H7N9等。

    甲型流感病毒能產(chǎn)生低保真RNA聚合酶。其可引起流感病毒的高突變率以及基因重組,可使流感病毒呈現(xiàn)分子多樣性,使每個病毒亞型可進(jìn)化為多個分支[5]。由于甲型流感病毒亞型多、突變率高、易發(fā)生重配,因此對流行毒株進(jìn)行基因組分析尤為重要。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展,采用高通量測序方法進(jìn)行甲型流感病毒基因組的測定[6],已被科研人員廣泛接受。已經(jīng)有研究人員報道,在1個RT-PCR反應(yīng)中,使用1對通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒所有8個基因節(jié)段的方法,從而使得流感病毒全基因組的測序更為簡單[7]。傳統(tǒng)測序方法雖然經(jīng)濟(jì)高效,但僅能測定某一特異性擴(kuò)增片段,且不能測定準(zhǔn)種[8]。而我國現(xiàn)在用于高通量測序平臺的甲型流感病毒基因組擴(kuò)增試劑主要依賴進(jìn)口,購買該試劑的費(fèi)用較高。本文參照文獻(xiàn),設(shè)計(jì)了1對通用引物進(jìn)行甲型流感病毒全基因的RT-PCR擴(kuò)增,并分析了該方法的敏感性。

    1 材料和方法

    1.1 材料和儀器

    Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑,均購自Life technologies公司;超凈工作臺(Forma Scientifc);移液器(Eppendorf);孵化器(德州誠信孵化設(shè)備有限公司);高速臺式離心機(jī)(Heraeus Biofuge primoR);PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600)。

    1.2 毒株和核酸提取

    各亞型甲型流感毒株由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測室保存,毒株詳細(xì)信息見表1。病毒株接種9~11日齡雞胚,72小時內(nèi)收取雞胚尿囊液進(jìn)行病毒核酸RNA提取。按照說明書操作,使用RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit,Qiagen)提取病毒RNA,并使用Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑測定RNA濃度。

    表1 禽流感病毒株信息

    1.3 引物合成

    按 照 文 獻(xiàn)[6]合 成 引 物。MBTuni-12:5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG;MBTuni-13:5'-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。

    1.4 甲型流感病毒基因組擴(kuò)增

    使 用 PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2(Takara)進(jìn)行甲型流感病毒全基因擴(kuò)增,反應(yīng)體系:2×1 Step Buffer 25 μL,MBTuni-12(10 pM)和MBTuni-13(10 pM)各2 μL,PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL,RNA 10 μL,RNase Free dH2O 9 μL。反應(yīng)條件 :45 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h;95 ℃4 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共40個循環(huán);72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行鑒定。

    1.5 文庫構(gòu)建

    使用AMPure XP核酸純化磁珠(Beckman)對擴(kuò)增得到的甲型流感病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增,將純化后的全基因cDNA稀釋成35 μL中含有200 ng DNA的溶液,使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit將病毒全基因組DNA打斷為200 bp的片段,加入含有Barcode的接頭,構(gòu)建為PGM測序儀可識別的DNA文庫。

    1.6 測序

    將DNA文庫稀釋為26 pM,應(yīng)用Ion PGM Template OT2 200 Kit對DNA文庫進(jìn)行測序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 318 芯片,置于PGM測序儀進(jìn)行測序。將測序序列經(jīng)PGM自帶的FluAnalysis(v4.0)軟件進(jìn)行序列拼接。

    1.7 敏感性試驗(yàn)

    以A/avian/China/A32/2012的基因組RNA為模板,稀釋成含有1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL和0.01 pg/ μL的RNA溶液,使用PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2) 和 引 物MBTuni-12/ MBTuni-13進(jìn)行甲型流感病毒的全基因擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行鑒定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 流感病毒全基因組擴(kuò)增及文庫構(gòu)建

    使用該對引物能夠擴(kuò)增出9個毒株(8個HA亞型和3個NA亞型)的目的條帶,得到該病毒全基因的所有節(jié)段擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。純化后的cDNA濃度均能滿足測序文庫構(gòu)建的需要,經(jīng)稀釋后構(gòu)建成含有Barcode接頭的200 bp DNA文庫。

    圖1 甲型流感病毒基因組擴(kuò)增結(jié)果

    2.2 測序數(shù)據(jù)分析

    測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),該方法能夠完成這些亞型的全基因組測序,測序數(shù)據(jù)拼接后可覆蓋甲型流感病毒的所有8個節(jié)段。各毒株每個節(jié)段的平均測序深度見表2。包括各節(jié)段的5′和3′端序列,所有毒株的節(jié)段至少平均被測199次(A/avian/China/P174/2013的PA基因)。綜合分析所有9個毒株8個節(jié)段的平均測序深度發(fā)現(xiàn):M基因的平均測序深度最大,為5 533;PA基因的平均測序深度最小,為1 497。通過FluAnalysis(v4.0)軟件對各毒株的HA和NA亞型進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)除第8和第9株通過高通量測序鑒定的亞型與常規(guī)檢測結(jié)果不同外,其余均一致(表2)。

    表2 毒株各節(jié)段的測序深度

    2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

    不同濃度的A/avian/China/A32/2012的基因組RNA,經(jīng)使用PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2和引物MBTuni-12/ MBTuni-13進(jìn)行甲型流感病毒全基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖2。由圖2可見,反應(yīng)體系中加入10 μL濃度為10 pg/μL的RNA(100 pg)仍能檢測到清晰的所有流感病毒節(jié)段的條帶。

    圖2 不同濃度的引物RT-PCR檢測甲型流感病毒敏感性的比較

    3 討論

    甲型流感病毒全基因測序?qū)α私饬鞲胁《镜姆肿由飳W(xué)特性、基因重配機(jī)制、準(zhǔn)種分析[14]等具有十分重要的意義。甲型流感病毒全基因測定的傳統(tǒng)方法常是采用每個基因的特異性引物擴(kuò)增的方法,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)直接測序或克隆測序得到全基因序列。這種方法操作繁瑣,且針對某些亞型的甲型流感病毒需要采用亞型特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。這在毒株亞型未知的情況下,更會加大工作量。為了解決這些問題,使用通用的一對引物,一步RT-PCR擴(kuò)增全部亞型的全基因方法被逐步建立和應(yīng)用[1,9],但將全部8個節(jié)段的擴(kuò)增產(chǎn)物在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行測序仍是一項(xiàng)復(fù)雜工作。隨著高通量測序的發(fā)展,這種混合樣品的測序問題被逐步得到解決,從而使得甲型流感病毒的全基因測序技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展[6]。采用高通量測序,可以開展甲型流感病毒的監(jiān)測[10]、亞型鑒定[11]、全基因測序與進(jìn)化分析[12],以及突變頻率[13]和準(zhǔn)種分析[14]等工作。

    我國用于甲型流感病毒全基因高通量測序的配套試劑全部依賴進(jìn)口,國內(nèi)鮮見有關(guān)通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒全基因的報道。本文依據(jù)文獻(xiàn)報道,建立了此種通用引物擴(kuò)增方法。結(jié)果顯示,所采用的建庫與測序方法能夠測定甲型流感病毒的全基因,并且測序深度較大,能滿足序列分析的需要。本實(shí)驗(yàn)在一次測序中完成了9種亞型甲型流感病毒的全部8個基因的測序,并分析出各毒株的HA和NA亞型。但常規(guī)測序判定為H10和H11的兩株病毒,在本實(shí)驗(yàn)中卻被分別分析為H1和H10,此結(jié)果產(chǎn)生的原因?qū)谙乱徊降难芯恐蟹治?。此?xiàng)技術(shù)的建立,將提高我國甲型流感病毒監(jiān)測和分析的能力和效率,減少我國相關(guān)試劑的購買費(fèi)用,待技術(shù)成熟后,可向科研院所和疾病防控機(jī)構(gòu)推廣。

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    (責(zé)任編輯:朱迪國)

    Genome Amplification of Influenza A Virus by Universal Primers and Sequencing by High-throughput Sequencing

    Wang Kaicheng1,Qiu Yuan1,Ji Haiwang2,Peng Cheng1,Zhuang Qingye1,Wang Tong1, Wang Suchun1,Yu Jianmin1,Xu Rongqiang1,Chen Jiming1
    (1. China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong 266032;2. Agricultural Service Center of Wanggezhuang Street in Laoshan District,Qingdao,Shandong 266105)

    To sequence the genome of infuenza A virus by high-throughput sequencing,a pair of universal primers was designed to amplify the genome by RT-PCR. The sensibility of the method was also analyzed. The results showed that all the 8 genes of several subtypes infuenza A virus could be amplifed,and the lowest detection limit was 100 pg RNA.

    infuenza A virus;universal primers;genome;high-throughput sequencing

    book=90,ebook=96

    S851.3

    A

    1005-944X(2017)01-0090-04

    10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.025

    科技部科技基礎(chǔ)性專項(xiàng)(SQ2012FY3260033);中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金(2015IF-0004FF)

    陳繼明

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