免疫膠體金技術在動物疫病診斷領域中的專利進展

哈登楚日亞，趙永剛，趙 明，吳曉東，吳樹清，王志亮

（1.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古呼和浩特 010018；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.青島市動物疫病預防控制中心，山東青島 266100）

免疫膠體金技術在動物疫病診斷領域中的專利進展

哈登楚日亞1，2，趙永剛2，趙 明3，吳曉東2，吳樹清1，王志亮2

（1.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古呼和浩特 010018；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；3.青島市動物疫病預防控制中心，山東青島 266100）

免疫膠體金技術（GICT）現已廣泛應用于各檢測領域。本文通過檢索我國國家知識產權局專利數據庫，介紹了該技術的原理和特點，分析了其在病毒、細菌和寄生蟲檢測等方面的應用，并對我國免疫膠體金技術在動物疫病檢測領域中的專利進展進行了綜述。

動物疫??；免疫膠體金技術；專利；檢測；應用

膠體金，又稱膠體納米金，是一種新型免疫學檢測技術，其操作簡便、特異性強、制作成本低、無需特殊儀器，是納米診斷中最穩(wěn)定的材料之一[1]。1959年，美國學者Yalow和Berson首次發(fā)明放射免疫技術，在此基礎上，后期又出現了酶聯(lián)免疫標記、熒光免疫標記、同位素免疫標記、乳膠免疫標記，以及膠體金免疫標記技術等多項標記技術[2]。1962年，Feldherr和Marshall首次將膠體金顆粒作為電子顯微鏡下的示蹤標志。1971年，Faulk和Taylor[3]將膠體金作為標記物應用于免疫學，免疫膠體金技術由此廣泛應用于疾病診斷領域。本文通過介紹免疫膠體金技術的原理、特點，以及我國免疫膠體金的相關專利情況，以期為該技術在動物疫病診斷檢測中的應用發(fā)展提供參考。

1 膠體金技術原理及特點

1.1 膠體金技術的原理

膠體金的原理是通過還原劑將氯金酸（HAuCl4）溶液中的金離子（Au3+）轉化為金原子，生成大小不同的膠體金顆粒。因該顆粒的電子密度高，在顯微鏡下，蛋白與標記物結合處可見黑褐色顆粒，當這些顆粒大量聚集時，肉眼可見紅色斑點。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質的正電荷基團牢固結合。由于這種結合是靜電結合，因此不會影響蛋白質的生物學特性。除與蛋白質靜電結合外，膠體金還可以與多種毒素、抗生素、激素等非共價結合[4]。在動物疫病診斷中，最常用到的是斑點金免疫滲濾法（DIGFA）和膠體金免疫層析法（GICA）。這兩種方法都是將待檢樣品加入抗原或抗體中，經過滲濾作用或毛細管作用使兩者結合，再使用膠體金進行標記[5]。例如，在免疫層析試紙條檢測中，首先將被檢樣品與金標抗體結合，形成抗原抗體復合物；其次前進到檢測線時，被檢樣品和金標抗體復合物與已知抗體形成復合物，即雙抗夾心；最后到質控線處，形成金標抗體與抗金標抗體復合物。

1.2 免疫膠體金的技術特點

1.2.1 易操作。不需任何特殊實驗儀器或試劑，減少了檢測時間，降低了操作誤差，提高了工作效率。

1.2.2 檢測面廣。免疫膠體金技術既可以檢測抗原，又可以檢測抗體，這給檢測提供了較多選擇。

1.2.3 應用廣泛。免疫膠體金技術可應用于電鏡、生物傳感器、疾病快速診斷、獸藥殘留檢測、重金屬殘留檢測、智能健康檢測、毒品檢測、古代絲織品等方面。

1.2.4 準確率高。免疫膠體金自身具有高特異性和高敏感性，可以確保檢驗的準確率。

1.2.5 制作成本低，反應迅速。制作耗材、使用樣本量、試劑用量等相對較少，只需5～10 min，就可直接用肉眼判斷檢測結果。

2 應用

登陸中華人民共和國國家知識產權局專利數據庫，對關鍵詞“免疫膠體金”進行檢索，可檢索到1995—2016年的相關專利512項，其中已授權專利191項。按申請日統(tǒng)計顯示，在2000年以后，申請免疫膠體金的相關專利數總體呈上升趨勢（圖1）。發(fā)明專利中，涉及動物病原微生物檢測的比例最高，為31.45%，植物病原微生物檢測的占14.06%，人類病原微生物檢測的占13.28%，藥物、抗生素殘留檢測的占24.80%，激素、添加劑檢測的占11.52%，其他（如檢測重金屬、毒品、古代絲織品等）占14.06%。其中，檢測的動物病原微生物包括病毒、細菌、寄生蟲、霉形體等（圖2）。

2.1 病毒檢測

圖1 我國免疫膠體金相關專利申請情況（截至2016年7月）

圖2 我國免疫膠體金相關專利技術領域分類（截至2016年7月）

在病毒檢測方面，金梅林等[6]發(fā)明了豬流感病毒H3亞型膠體金檢測試劑盒，對200份豬肺臟樣品進行檢測，并檢出的7份陽性樣品進行病毒分離驗證，結果全部分離出病毒，說明該試劑盒檢測豬肺臟樣品的特異性為100%。栗紹文等[7]發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）膠體金抗體檢測試紙條可在5～10 min內判定結果，將PRRS標準陽性血清分別倍比稀釋至1:2 048，各取100 μL稀釋的樣品，按該發(fā)明方法進行試驗的同時，用PRRS間接ELISA試劑盒進行對比檢測。結果表明，該試紙條靈敏度接近間接ELISA，實驗結果均達到28（體積比1:256稀釋）。吳斌等[8]發(fā)明了一種檢測豬偽狂犬病毒（PRV）gE血清抗體的試紙卡。該試紙卡操作簡便、快速，結果直觀、準確、靈敏度高，有較好的穩(wěn)定性。將該試紙條分別置于室溫和4 ℃，每隔一個月取出，同時檢測10份PRV gE陽性血清和10份陰性血清樣本，結果與預期結果一致，6個月后在室溫和4 ℃保存的試紙條仍較為穩(wěn)定。楊少華等[9]發(fā)明了一種基于新城疫病毒（NDV）血凝素蛋白單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測試紙條，對53份樣品進行檢測，結果顯示，陽性率為22.60%，血凝抑制試驗結果顯示陽性率為26.40%，兩者符合率為96.20%。

目前，分別對豬流感病毒、豬藍耳病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬2型細環(huán)病毒、豬流行性腹瀉病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、J亞群禽白血病病毒、鴨坦布蘇病毒、雞傳染性貧血病毒、雞傳染性法氏囊病毒、狂犬病毒、犬瘟熱病毒、細小病毒、小反芻獸疫病毒、登革熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、皰疹病毒、家蠶核型多角體病毒、白斑綜合征病毒、擬穴青蟹呼腸孤病毒等發(fā)明了免疫膠體金快速檢測方法，已證實具有良好的特異性、敏感性和檢測速度（表1）。

2.2 細菌檢測

閆廣謀等[10]發(fā)明了一種布魯氏菌抗體免疫膠體金檢測試紙條，對89份牛血清與虎紅平板凝集試驗進行對比檢測，結果虎紅平板凝集試驗檢出13份陽性，試紙條15份陽性，兩種實驗符合率為86.40%；將虎紅平板凝集試驗檢測為陽性的血清用試紙條檢測全部為陽性，兩者符合率為100%。葛海鵬等[11]發(fā)明了一種檢測霍亂弧菌的免疫層析試紙條，其制備方法簡單，檢測速度快，成本低廉。該試紙條可用于檢測106～107CFU/mL的霍亂弧菌菌懸液標本，并且不與其他生物發(fā)生交叉反應，具有較高的敏感性及特異性。端青等[12]發(fā)明的一種檢測炭疽芽孢桿菌的免疫層析試紙條具有良好的穩(wěn)定性和特異性，對枯草桿菌、蘇云金桿菌等8種相關細菌進行檢測，結果均顯示為陰性，而對制備好的包被有炭疽芽孢桿菌的兔多克隆抗體和羊抗兔IgG顯示陽性。郭愛珍等[13]發(fā)明了牛結核抗體鑒別試紙條，對200份臨床牛血清進行檢測，并且與結核菌素試驗（TST檢測）作比較。結果TST檢出陽性牛100頭，試紙條檢出陽性牛85頭，陽性符合率為68.00%；TST陰性牛100頭，試紙條陰性牛115頭，陰性符合率為83.00%，總符合率為75.50%。

表1 免疫膠體金檢測動物疫病病原微生物專利統(tǒng)計

目前，免疫膠體金檢測技術在布魯氏菌、牛結核桿菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、鴨疫里默桿菌、鰻弧菌、出血性大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、副雞禽桿菌、空腸彎曲菌、炭疽桿菌、李斯特菌、土拉熱弗朗西斯菌、破傷風桿菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌等多種致病菌上均有涉及，與其他檢測技術相比明顯縮短了檢測時間，靈敏性和特異性也相對較高（表1）。

2.3 寄生蟲檢測

宮鵬濤等[14]發(fā)明了一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測試紙條，對已處理好的含安氏隱孢子蟲、藍氏賈第蟲、柔嫩艾美爾球蟲和微小隱孢子蟲糞便進行檢測，結果顯示，該試紙條只對微小隱孢子蟲檢測呈陽性，其他均為陰性，說明其具有良好的特異性。用在4 ℃環(huán)境中保存的試紙條對標準陽性樣本進行定期檢測，結果顯示，4 ℃保存60天后，試紙仍均呈穩(wěn)定的陽性反應。余新炳等[15]發(fā)明的華支睪吸蟲免疫膠體金試劑盒操作簡單快速，檢測結果清楚易于判斷，特異性強、敏感性高，無需儀器設備或只需簡單的儀器，非常適于發(fā)病現場、門診等的臨床樣品檢測使用。劉志杰等[16]發(fā)明的檢測羊泰勒蟲病免疫膠體金檢測試紙條與rTuIPELISA同時檢測127份樣品，兩者同時檢出40份陰性樣品，陰性符合率為100%；兩者共檢出陽性樣品87份，其中試紙條檢出81份，陽性符合率為93.10%。這說明該試紙條具有較好的檢測性能，能夠完全滿足基層實驗室和獸醫(yī)從業(yè)者的使用。目前對小隱孢子蟲、羊泰勒蟲、瘧原蟲、華支睪吸蟲、弓形蟲等寄生蟲病均發(fā)明了免疫膠體金檢測方法，已證實其特異性和敏感性較高，且比其他檢測方法更簡便快速（表1）。

3 小結

關于免疫膠體金技術在動物疫病診斷中的應用進展，已有多篇文章進行了報道。如秦立得等[17]的膠體金免疫層析試紙條在禽病檢測方面的應用與展望，莊金秋等[18]的膠體金免疫層析技術在獸醫(yī)臨床診斷中的應用進展等，都是以國內外最新研究情況為參考進行的綜述。而本文主要是通過檢索國家知識產權局專利數據庫，圍繞免疫膠體金檢測技術專利注冊方面，對其在動物疫病診斷上的應用進行歸納和總結。

免疫膠體金技術是一種新型檢測方式。多類文獻報道表明，該技術相對于ELISA、HA、AGP等其他檢測技術，具有特異性高、樣本用量少、檢測速度快、操作簡單、不需任何特殊儀器設備等優(yōu)點。該技術在多個檢測領域中已得到廣泛應用，涉及病原體、藥物、激素、毒品、重金屬、絲織品等方面。自2000年以來，該技術的相關專利申請數總體呈上升趨勢。該技術的申請專利中，涉及病毒、細菌、寄生蟲等動物疫病病原體檢測的專利共計161項，占總數的31.45%，其中動物疫病檢測是一個主要發(fā)展方向。然而，該技術在實際應用中仍存在一些問題，如假陰性結果多、檢測范圍有限、靈敏度低等。柳愛春[19]發(fā)明了一種半定量免疫膠體金試紙條，能夠對食用農產品中氟喹諾酮類藥物殘留量實現半定量快速檢測或現場檢測。該試紙條靈敏度高、特異性好，對農產品中16種氟喹諾酮類藥物的最低檢出限可達1～10 μg·kg-1，適用于各類企業(yè)及檢測機構，對青霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素或磺胺嘧啶等抗菌素的交叉反應率均低于1%。Jelinek等[20]報道過免疫膠體金檢測技術出現假陽性問題。新型免疫膠體金技術在此基礎上進行了改進，并在較大程度上克服了這一問題。李溢軍[21]發(fā)明的一種四聯(lián)（豬瘟、豬偽狂犬病、豬藍耳病和豬口蹄疫）抗體快速金標測試卡，其不僅可以同時檢測出4種不同病毒抗體，而且操作簡單，樣品用量較少。

免疫膠體金技術是動物疫病快速檢測領域的一個主要發(fā)展方向和模式。若該技術能進一步提高其特異性和靈敏度，減少假陽性和假陰性數量等問題，在動物疫病檢測領域中，其將有更廣闊的應用前景。

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[9]楊少華，許傳田，胡北俠，等.一種基于NDV血凝素蛋白單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測試紙條：201410145689.7[P].2014-07-23.

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[12]端青，檀華，朱虹，等.一種檢測炭疽芽孢桿菌的免疫層析試紙及其制備方法：200610000294.3[P].2007-07-18.

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[14]宮鵬濤，張西臣，刁玉梅，等.一種微小隱孢子蟲免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法：201110067042.3[P].2011-09-14.

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[18]莊金秋，梅建國，沈志強. 膠體金免疫層析技術在獸醫(yī)臨床診斷中的應用進展[J].中國動物檢疫，2012，29（9）：70-75.

[19]柳愛春. 一種半定量免疫膠體金試紙條及其應用：201610094288.2 [P].2016-06-01.

[20] JELINEK T，WASTLHUBER J，PR?LL S，et al. Influence of rheumatoid factor on the specificity of a rapid immunochromatographic test for diagnosing dengue infection[J]. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases，2000，19（7）：555-556.

[21]李溢軍. 一種四聯(lián)對豬瘟、豬偽狂犬、豬藍耳和豬口蹄疫抗體快速金標測試卡：201420767358.2[P].2015-06-03.

（責任編輯：杜憲）

Patent Progress on Immune Colloidal Gold Technique （GICT）in Animal Diseases Diagnosis

Hadengchuriya1，2，Zhao Yonggang2，Zhao Ming3，Wu Xiaodong2，Wu Shuqing1，Wang Zhiliang1
（1. Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；3. Qingdao Animal Disease Prevention and Control Center，Qingdao，Shandong 266100）

At present，immune colloidal gold technique（GICT）has been applied in the feld of detection widely. By retrieving data from patent database of the State Intellectual Property Offce of China，the principles and characteristics of GICT were introduced，and its use in detecting viruses，bacteria and parasites was analyzed. Meanwhile，the parent progress on GICT in diagnosis of animal diseases in China was summarized.

animal disease；immune colloidal gold technique（GICT）；patent；detection；application

book=81,ebook=87

S851.34

A

1005-944X（2017）01-0081-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.023

“十三五”國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0501104）

吳樹清、王志亮