家蠶突變體相關(guān)研究進(jìn)展

楊建華 徐安英，2

(1江蘇科技大學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江212003;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018)

家蠶突變體相關(guān)研究進(jìn)展

楊建華1徐安英1，2

(1江蘇科技大學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江212003;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018)

家蠶突變體的發(fā)現(xiàn)與鑒定對(duì)家蠶功能基因組研究具有十分重要的意義。目前通過(guò)自然突變或人工誘導(dǎo)的方式獲得了大量的突變材料，涉及家蠶體色、卵色、致死等多個(gè)方面。重點(diǎn)介紹了家蠶突變體的鑒定與篩選，基于非定位克隆或定位克隆技術(shù)在分子水平上對(duì)家蠶突變體進(jìn)行的相關(guān)研究，以及利用家蠶突變品種來(lái)鑒定分析突變基因，并展望了家蠶突變種質(zhì)資源在育種方面的廣闊前景。

家蠶;突變體;自然突變;人工誘變;鑒定;育種

家蠶屬鱗翅目蠶蛾科家蠶種，是目前唯一一種被完全馴化的昆蟲(chóng)，是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，在其漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化過(guò)程中，由于地理環(huán)境和氣候條件的差異形成了不同的生態(tài)類型和地理種群［1］。家蠶作為鱗翅目模式昆蟲(chóng)，其繁殖率高、生長(zhǎng)周期短的生長(zhǎng)特點(diǎn)以及豐富的遺傳背景優(yōu)勢(shì)使得它在分子遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)方面的研究都取得了巨大進(jìn)展。

家蠶的遺傳性狀豐富多樣，為遺傳學(xué)研究的發(fā)展提供了重要材料，其豐富的基因組數(shù)據(jù)、分子標(biāo)記連鎖圖譜、遺傳變異圖譜等信息使得家蠶突變基因的研究不斷深入。目前，家蠶突變基因資源涉及體色、軀體附肢發(fā)育、體型體態(tài)、變態(tài)發(fā)育、卵形卵色、致死等多個(gè)方面，家蠶現(xiàn)保存有600余種天然突變體［2］，其中300多個(gè)突變性狀已通過(guò)連鎖檢索和定位方式確定在230多個(gè)位點(diǎn)上［3］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，一些重要經(jīng)濟(jì)性狀的研究為家蠶育種方法提供了新的思路［4］，分子輔助育種與傳統(tǒng)育種有效結(jié)合，將大大縮短育種年限，提高育種效率。本文就家蠶突變體的形成、鑒定及在育種中的應(yīng)用等方面展開(kāi)論述，供同仁參考。

1 家蠶突變體的獲得途徑

家蠶基因組計(jì)劃完成之后，其功能基因組的研究就成為家蠶研究領(lǐng)域的重要課題，而突變體為此提供了多樣的研究材料［5］。獲得家蠶突變體的方法有多種，如自然突變、人工誘變等。其中人工誘變又包括物理誘變、化學(xué)誘變以及基因敲除和轉(zhuǎn)基因等多種方式。目前保存的家蠶突變資源大部分來(lái)源于自然突變，只有少部分是通過(guò)人工誘變的方式篩選出來(lái)的。

1.1 自然突變

自然突變?cè)谏锝缰衅毡榇嬖凇ｔ敵傻龋?］發(fā)現(xiàn)了一種由常染色體上隱性基因控制的體節(jié)畸形的自然突變體，受環(huán)境條件及遺傳背景的影響，在胚胎發(fā)育中后期致家蠶幼蟲(chóng)畸形，但不具致死性，畸形嚴(yán)重的個(gè)體幼蟲(chóng)活動(dòng)能力受到影響。王先燕等［7］在湘暉原蠶中發(fā)現(xiàn)了一種體壁突變蠶，其體壁較厚，大眠蛻皮緩慢，蠶期生命率較高，化蛹蛻皮困難，化蛹的蛻皮大顏色深，蟲(chóng)蛹率低，全繭量和繭層率偏低。趙巧玲等［8］在品種選育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了酷似鶉斑的突變體褐色類鶉斑和紫色類鶉斑，它們?cè)谟紫x(chóng)時(shí)期半月紋和星狀紋正常，但無(wú)眼狀紋。趙巧玲等［9］在C603家蠶品種中發(fā)現(xiàn)了一種2齡不眠蠶突變體，其不能正常發(fā)育至3齡期，有純合致死的現(xiàn)象，推測(cè)該突變與家蠶體內(nèi)的蛻皮激素水平相關(guān)?？禈?lè)群等［10］在P33家蠶品種中發(fā)現(xiàn)了一種由常染色體上隱性基因控制的幼蟲(chóng)致死突變，該突變家蠶在3齡期生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入4齡后生長(zhǎng)基本停滯，逐漸死亡，有純合致死的現(xiàn)象。陳安利等［11］發(fā)現(xiàn)了一種由隱性基因控制的卵殼突變體l－em，其遵循偽母性遺傳，有純合致死的現(xiàn)象，該突變家蠶的蠶卵在產(chǎn)下約10 min后就出現(xiàn)失水凹陷的現(xiàn)象，1 h左右完全失水潰死，卵殼向中間凹陷，呈三角形。

1.2 物理誘變

一般常用的物理誘變手段是利用不同射線誘變處理，如X射線、γ射線、中子、激光、離子束和紫外線等。輻射誘導(dǎo)的突變效應(yīng)有可能會(huì)遺傳，也有可能只是造成某些生理生化效應(yīng)的改變［12－14］。不同家蠶品種對(duì)輻射的敏感性不同，其某些敏感部位受輻射影響可對(duì)其生理生化、生產(chǎn)性狀等方面產(chǎn)生重要影響［15］。如屠振力等［16］利用碳離子射線(12C5+)分別處理家蠶4齡幼蟲(chóng)的不同組織，發(fā)現(xiàn)家蠶不同組織對(duì)12C5+射線的敏感性不同，呈劑量效應(yīng)，且在發(fā)育早期進(jìn)行處理對(duì)家蠶生物學(xué)效應(yīng)影響更為明顯。代方銀等［17］利用60Co－γ射線照射雌蛹，待羽化后與未處理的雄蛾交配，于F3中發(fā)現(xiàn)一種由第5連鎖群上某隱性基因控制的高度油蠶突變，該突變家蠶無(wú)致死性，體質(zhì)強(qiáng)健，生殖力強(qiáng)。譚安江等［18］利用同步輻射軟X射線處理催青卵和蠶蛹，發(fā)現(xiàn)其子代的蛋白質(zhì)和酯酶同工酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酯酶同工酶活力降低，這有利于其子代體質(zhì)的增強(qiáng)及蠶繭質(zhì)量的改善。趙麗華等［19］利用不同劑量碳離子射線處理蠶卵后發(fā)現(xiàn)家蠶的孵化率、繭絲質(zhì)、蟲(chóng)蛹統(tǒng)一生命率均有所提高，但不同劑量對(duì)經(jīng)濟(jì)性狀的影響表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，其中繭絲質(zhì)隨著輻射劑量的提高效果表現(xiàn)更好，蟲(chóng)蛹統(tǒng)一生命率則隨劑量的提高而逐漸降低，而孵化率在不同劑量之間不表現(xiàn)某種同一趨勢(shì)。

1.3 化學(xué)誘變

某些化學(xué)物質(zhì)能夠與生物體相互作用而導(dǎo)致其發(fā)生突變，這些能引起突變的化學(xué)物質(zhì)就是化學(xué)誘變劑?；瘜W(xué)誘變的應(yīng)用從20世紀(jì)初就已開(kāi)始，目前使用的化學(xué)誘變劑種類很多，且不同誘變劑所導(dǎo)致的誘變結(jié)果及誘變效率也各不相同。

廣部等將家蠶蠶卵用0.05%～0.40%的秋水仙堿液處理后得到四倍體缺失型突變蠶，村地等用氮芥處理家蠶蠶卵后得到缺失型突變蠶，田島等為家蠶添食0.018～0.840 μg的5－溴去氧尿核苷和0.200～0.760 μg的5－溴－尿嘧啶(5－BU)后得到多數(shù)od斑油家蠶突變體(od)，室田等利用甲基磺酸甲酯(MMS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)和絲裂素C等誘變劑注射蛹體，誘導(dǎo)產(chǎn)生顯性致死突變［20］。林英等［21］使用化學(xué)誘變劑乙基亞硝酸脲(ENU)、甲基亞硝基脲(MNU)、DES、5－BU、EMS處理家蠶C108品種，篩選得到非滯育紅卵，長(zhǎng)圓筒繭、小繭、絲膠繭及綿繭突變體，致死突變體及無(wú)鱗毛蛾翅突變體，其中MNU、DES誘變效率較高。

1.4 基因敲除和轉(zhuǎn)基因

基因敲除技術(shù)是利用基因同源重組及胚胎干細(xì)胞技術(shù)使得特定基因失活或缺失的技術(shù)。傳統(tǒng)基因敲除手段包括由隨機(jī)插入突變進(jìn)行的基因敲除和利用RNA干擾(RNAi)引起的基因敲除。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了鋅指核酸酶技術(shù)(ZFNs)［22］、類轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶技術(shù)(TALENs)［23］及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)技術(shù)(CRISPR/Cas9)［24］，這3種基因編輯方式可作為基因敲除的有效手段。對(duì)于目前有些基因敲除后無(wú)明顯表型變化或產(chǎn)生基因致死的現(xiàn)象，采用TALENs和CRISPR/Cas9在一定程度上可以解決這一問(wèn)題［25－26］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)已形成較為完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，這為家蠶突變材料的獲得、種質(zhì)資源的創(chuàng)新、基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因家蠶一般是利用分子生物學(xué)方法將外源基因?qū)爰倚Q染色體中，使之出現(xiàn)不同的性狀或產(chǎn)物。在家蠶轉(zhuǎn)基因研究中可通過(guò)顯微注射、精子介導(dǎo)、弱病毒介導(dǎo)等方法，利用同源重組或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將外源基因整合到家蠶基因組中［27－32］。但一般通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)基因的方式獲得的突變體數(shù)量太少，且操作復(fù)雜，成本較高。

辛虎虎等［33］利用CRISPR/Cas9獲得了Bmsage缺失的純合體，該突變體幼蟲(chóng)的絲腺異常發(fā)育，中后部絲腺缺失，突變體生理特征主要表現(xiàn)在一些細(xì)胞組分的改變，與糖類、脂類及氨基酸信號(hào)通路相關(guān)，因此推測(cè)Bmsage可能參與絲腺組織的分化與形成過(guò)程。2003年，日本TOMITA等［34］利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人III型膠原蛋白整合到家蠶絲素蛋白中獲得能夠分泌人膠原蛋白的轉(zhuǎn)基因蠶。唐順明等［35］利用piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的顯微注射法獲得一種家蠶性染色體轉(zhuǎn)基因突變新品種ZEGFP，其后代呈顯性遺傳，這為Z染色體相關(guān)功能基因的研究提供了良好材料。

2 家蠶突變體的鑒定方法

2.1 形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法

早期家蠶基因定位的研究都是基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記所構(gòu)建的連鎖關(guān)系而確定的。形態(tài)學(xué)標(biāo)記是依據(jù)家蠶各時(shí)期的體色、體型、斑紋、致死突變及生理生化突變基因所構(gòu)建的經(jīng)典遺傳圖，包括約240個(gè)突變基因［36］，這些性狀位點(diǎn)坐標(biāo)的確定為后續(xù)家蠶各層次的突變性狀的研究提供了一定的基礎(chǔ)。雖然形態(tài)學(xué)標(biāo)記后使得某些遺傳性狀的研究較為方便，但由于形態(tài)學(xué)標(biāo)記過(guò)程受某些遺傳現(xiàn)象或環(huán)境因素的影響，所以其應(yīng)用有很大的局限性［37］。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)可對(duì)染色體數(shù)目和形態(tài)進(jìn)行初步分析，但由于這種標(biāo)記方式存在難度大和耗時(shí)耗力等方面的局限而導(dǎo)致其應(yīng)用不太廣泛［38－39］。

家蠶裸蛹突變體(Nd)主要表現(xiàn)為絲腺退化，不能正常吐絲結(jié)繭，劉春等［40］在形態(tài)學(xué)上對(duì)其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，突變體的后部絲腺發(fā)育緩慢是由于細(xì)胞核在分裂過(guò)程中發(fā)生異常而導(dǎo)致的。李瓊艷等［41］利用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和石蠟切片蘇木素與伊紅(HE)染色技術(shù)對(duì)正常品系大造、復(fù)眼突變系光澤眼(lustrous，lu)和光澤小眼(varnished eye，ve)的復(fù)眼表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體復(fù)眼表面具有光澤，其表面結(jié)構(gòu)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)均發(fā)生了明顯變化。

2.2 生物化學(xué)方法

由于生物體內(nèi)某些生化性狀可作為遺傳標(biāo)記，因此可通過(guò)一些蛋白質(zhì)或酶活性的檢測(cè)來(lái)作為標(biāo)記以鑒定篩選突變體。蛋白質(zhì)電泳是常用的鑒別方式，操作簡(jiǎn)便快速，但蛋白質(zhì)或酶的表達(dá)易受外界環(huán)境的影響，所以這種標(biāo)記技術(shù)具有一定的局限性。靳遠(yuǎn)祥等［42］利用雙向凝膠電泳和計(jì)算機(jī)輔助分析對(duì)正常蠶體及非膠著卵(Ng)突變體的雌蛾性附腺分泌部組織提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)蛋白，其中肌動(dòng)蛋白A3的缺失表達(dá)可能與雌性附腺膠狀粘性物質(zhì)的胞外分泌有關(guān)。陳安利等［43］利用雙向電泳對(duì)比分析正常卵與突變卵的卵蛋白，發(fā)現(xiàn)一個(gè)高豐度的蛋白在正常個(gè)體卵巢中表達(dá)，而在l－em卵突變個(gè)體的卵巢中不表達(dá)，質(zhì)譜鑒定該蛋白即為BmEP80基因編碼的BmEP80蛋白。該結(jié)果證明了BmEP80蛋白的缺失在突變體的形成中起重要作用。

2.3 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法

家蠶基因組精細(xì)圖譜及分子標(biāo)記連鎖圖譜為家蠶突變基因的研究提供了重要基礎(chǔ)，在分子水平上對(duì)家蠶突變基因的研究已取得了很大突破。分子標(biāo)記是以遺傳物質(zhì)為基礎(chǔ)，可直接反映生物個(gè)體或種群間遺傳物質(zhì)的多態(tài)性，不受個(gè)體生長(zhǎng)環(huán)境及試驗(yàn)條件的影響，與其他方法相比，具有準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點(diǎn)。突變基因分布于不同的連鎖群，基于非定位克隆及定位克隆技術(shù)，按其突變所屬類型對(duì)不同突變品系進(jìn)行如下鑒定解析。

2.3.1 基于非定位克隆技術(shù)的家蠶突變體基因研究(1)鉛黃阿斯科利油蠶(og)。高度油蠶突變體，在蛹期死亡率較高，且雌蛾不育，雄蛾在人工輔助交配的情況下可育，其在生理生化上主要表現(xiàn)為尿酸生成缺陷，突變位于第9連鎖群。利用限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)連鎖分析確定，og突變與鉬輔因子硫化酶(molybdenum cofactor sulfurase)基因緊密連鎖［44］，此基因突變使酶的活性明顯降低，og突變體有2種等位突變，一種為ogk，突變基因有3處共998 bp的明顯缺陷，導(dǎo)致基因提前終止;另一種為ogt，有一個(gè)微型反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)位因子插入og基因的外顯子中，形成的不穩(wěn)定拼接造成開(kāi)放閱讀框(ORF)不完全。(2)q油蠶(oq)。oq主要表現(xiàn)在羽化前死亡率高，雌雄蛾均難育，屬于尿酸生成缺陷型，突變位于第12連鎖群，突變體的黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XDH)活性非常低，oq突變體與此酶的存在形式有關(guān)，在正常家蠶脂肪體內(nèi)有αXDH和βXDH等2種存在形式，其中αXDH發(fā)揮主要作用［45］，突變體中編碼αXDH蛋白的Bm－XDH1基因的編碼序列出現(xiàn)8 bp的缺失，導(dǎo)致編碼蛋白不具有黃嘌呤脫氫酶活性。(3)軀體模式突變體。家蠶軀體發(fā)育突變主要是發(fā)生在E擬等位基因群，在這個(gè)突變?nèi)褐杏性S多斑紋和附肢突變體，并伴隨著基因多效現(xiàn)象。其中純合的EN突變體由于缺失Ubx和abd－A基因，使其長(zhǎng)出類似胸足及胸腹型足之間的足;ECa突變體由于缺失abd－A基因?qū)е赂棺銦o(wú)法生長(zhǎng)［46］。Nc突變體由于缺失Antp基因使其胸節(jié)神經(jīng)節(jié)不完全融合，導(dǎo)致雄性在交配時(shí)翅膀扇動(dòng)由正常的間歇性扇動(dòng)變?yōu)槌掷m(xù)不斷的扇動(dòng)［47－48］。

2.3.2 基于定位克隆技術(shù)的家蠶突變體基因研究

(1)翅型突變體。家蠶有豐富的翅突變資源，為研究家蠶翅發(fā)育提供了良好的材料。目前翅突變的主要性狀有小翅、不全翅、無(wú)翅、雛翅、伴性無(wú)翅、鰲蝦蛹、卷翅蛹等，與體色相關(guān)的翅突變有白帶黑翅、野蠶翅斑、白翅蛹等。無(wú)翅突變(fl)純合體在家蠶的蛹期和蛾期前后翅皆無(wú)，蛾的第2對(duì)和第3對(duì)足發(fā)育不良，交尾困難［49］，該突變位于家蠶第10連鎖群13 cM處。SATO等［50］利用定位克隆技術(shù)確定該突變及其等位點(diǎn)的候選基因是fng糖基轉(zhuǎn)移酶基因，此基因參與Notch信號(hào)通路，是位于上游的調(diào)控因子。與野生型相比，突變體中fng基因出現(xiàn)不同程度的缺失或無(wú)義突變，使得基因不能正常表達(dá)，無(wú)法激活下游途徑而影響翅的生長(zhǎng)。殘翅突變(Vg)的翅發(fā)育不全，有同質(zhì)型致死現(xiàn)象，該突變位于第1連鎖群38.7 cM處。FUJII等［51］確定在突變體中有一段1.5 Mb的基因組缺失，在這段區(qū)域中的絡(luò)氨酸特異的磷酸化酶第3～8外顯子缺失，且5!端與缺失片段遠(yuǎn)端的一個(gè)基因的3!端發(fā)生融合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本異常，但目前對(duì)于Vg的功能研究還不明確。無(wú)鱗毛翅突變(nlw)的鱗毛明顯減少，幾乎透明，因此也稱為透明翅，由隱性基因控制。代方銀等［52］將nlw定位在第13染色體上，王修業(yè)等［53］利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記和序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)標(biāo)記對(duì)其構(gòu)建遺傳連鎖圖及定位分析，ZHOU等［54］對(duì)其突變機(jī)理研究表明該突變與ASH2基因相關(guān)，得到8個(gè)與nlw基因連鎖的SSR標(biāo)記和1個(gè)STS標(biāo)記，在ASH2基因開(kāi)放閱讀框中出現(xiàn)12處堿基替換，且自噬相關(guān)蛋白(ATG)上游缺失26 bp堿基，導(dǎo)致基因表達(dá)受到嚴(yán)重影響。

(2)卵色突變體。家蠶的卵色是由卵殼顏色和漿液膜顏色共同決定的，其中主要是由漿液膜細(xì)胞中所含色素決定的，目前卵色突變有紅色卵、白色卵、褐色卵等，家蠶卵色呈普通遺傳［55］。第2白卵(w－2)產(chǎn)下初期為黃白色后變?yōu)榈t色，蛾的復(fù)眼為白色。這種突變是由于蛹卵中缺少將3－羥犬尿氨酸轉(zhuǎn)化為色素的酶，該突變位于第10連鎖群16.1 cM處［56］。TATEMATSU等［57］確定w－2位點(diǎn)編碼一種與果蠅猩紅色基因同源的三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它與家蠶White基因形成異二聚體，負(fù)責(zé)眼色素的轉(zhuǎn)運(yùn)，但這種異二聚體不能參與尿酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。家蠶第3白卵(w－3)復(fù)等位基因群有很多突變基因，其中有很多表現(xiàn)為白卵、復(fù)眼白色、不同程度的油蠶，如白卵油蠶(w－3oe)、三聚氰胺誘發(fā)白卵油蠶(w－3ml)及青熟白卵油蠶(w－3ol)等。該突變位于第10連鎖群19.6 cM處。KOMOTO等［58］發(fā)現(xiàn)，在w－3突變體中White3基因的第2外顯子出現(xiàn)單堿基缺失，導(dǎo)致第3外顯子5!端提前出現(xiàn)終止密碼子。紅眼紅卵突變(re)表現(xiàn)為漿液膜細(xì)胞紅色，成蟲(chóng)復(fù)眼深棕色，孵化率不齊，該突變位于第5連鎖群31.7 cM處。另一種等位突變r(jià)eC的幼蟲(chóng)頭部表現(xiàn)為可可色。OSANAI等［59］利用定位克隆確定該突變的候選基因是跨膜蛋白家族中的新成員，由于紅卵突變體中該基因的開(kāi)放閱讀框插入一個(gè)541 bp的轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本異常，同時(shí)對(duì)家蠶及其他物種中的干擾實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)該基因在眼色素合成中的重要作用。

(3)體色突變體。生物體色對(duì)其生存與進(jìn)化有著十分重要的作用，是一種變異頻率較高的生物性狀。突變體的幼蟲(chóng)體色主要有赤蟻、黃體色、淡體色、暗化型、油蠶等，這與上表皮細(xì)胞中黑色素、墨喋呤(sepiapterin，SP)及尿酸的積累有一定關(guān)系。目前對(duì)于家蠶體色轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制還不明確。一般家蠶品種的蟻蠶是黑色，但有些品種因基因突變而表現(xiàn)出赤褐色，即赤蟻。普通常染色體突變赤蟻(ch)在蟻蠶時(shí)期表現(xiàn)為全身赤褐色，在壯蠶時(shí)期斑紋及氣門(mén)篩板略呈赤褐色，若與其他性狀斑紋疊加則會(huì)呈現(xiàn)赤褐色，該突變位于第13連鎖群9.6 cM處。煤灰蠶(so)在幼蟲(chóng)時(shí)期呈現(xiàn)污灰色，在蛹及成蟲(chóng)期體色黑化，該突變位于第26連鎖群0.0 cM處。FUTAHASHI等［60］通過(guò)生物信息學(xué)分析及定位克隆技術(shù)確定家蠶中參與黑色素代謝的Bmyellow和Bmebony基因分別與ch和so突變相關(guān)。在ch及其等位突變體中yellow基因外顯子受到不同程度的破壞，導(dǎo)致剪切位點(diǎn)突變，而so突變體中ebony基因碳端外顯子大段缺失。性染色體突變赤蟻，如伴性赤蟻(sch)在蟻蠶時(shí)期頭部和體色均呈現(xiàn)紅棕色，蛻皮后表現(xiàn)為與野生型相似的黑色，而在胚胎后期具有溫敏致死性。sch是由單一基因控制的隱性性狀，位于家蠶Z染色體21.5 cM處。LIU等［61］利用定位克隆技術(shù)、生物信息學(xué)分析及芯片分析技術(shù)確定sch突變的候選基因是酪氨酸羥化酶基因(TH)，TH的表達(dá)產(chǎn)物是合成黑色素前體物質(zhì)多巴所必須的酶，而B(niǎo)mTH基因的上游調(diào)控序列中插入一個(gè)mariner like轉(zhuǎn)座子，使得體內(nèi)酶含量明顯降低而影響蟻蠶的著色和孵化。第2隱性赤蟻(ch－2)在蟻蠶時(shí)期全身呈現(xiàn)赤褐色，頭部呈黑色，食桑后性狀發(fā)生改變，赤蟻特征逐漸消失，到1齡盛食后變得與正常蠶相似。與sch相比，ch－2在催青后不表現(xiàn)出溫敏致死性，該突變位于第18連鎖群0.0 cM處。張蕊等［62－63］利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖，并經(jīng)過(guò)精細(xì)定位篩選出該突變的候選基因BmCPG6，與野生型相比，突變體在催青第9天時(shí)轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)156 bp的缺失。黃體色突變主要是由于家蠶體壁中沉積大量的SP及SP脫氨產(chǎn)物所致，目前已發(fā)現(xiàn)有6種黃體色突變體，包括黃體色(lem)、黃體色致死(lem1)、顯性黃體色(Xan)、顯性黃體色C (Xanc)、黃浮黃體色(Sel)及黃起(Ym)。lem在2齡起蠶后體表變黃，幼蟲(chóng)頭部頻繁晃動(dòng)，該突變位于第3連鎖群端部。體表變黃主要是因?yàn)轶w表處積累了大量的黃蝶啶、SP及2，4－二羥基蝶啶物質(zhì)。它還有1種等位突變leml，在第1次蛻皮后就停止食桑，在3 d內(nèi)死去。MENG等［64］對(duì)lem位點(diǎn)連鎖分析及序列分析發(fā)現(xiàn)，突變體中SP還原酶基因出現(xiàn)單個(gè)堿基的替換及開(kāi)放閱讀框內(nèi)序列插入現(xiàn)象，導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)破壞，SP還原酶合成提前終止，使得酶活性嚴(yán)重降低或失活。暗化型突變(mln)是典型的家蠶體色黑化突變品種，其在幼蟲(chóng)期頭、胸足、剛毛等骨化部位均呈現(xiàn)黑色，至成蟲(chóng)期全身明顯黑化，該突變位于第18連鎖群41.5 cM處。這是屬于全齡期表現(xiàn)黑化的突變類型且黑化部位與其骨化程度相關(guān)［65］。喬梁等［66］利用定位克隆技術(shù)確定mln突變的候選基因，發(fā)現(xiàn)在突變體中有96 bp的混合序列缺失，而在內(nèi)含子中又插入了29 bp的序列，導(dǎo)致其產(chǎn)生2種異常轉(zhuǎn)錄本，使得編碼的潛在異常蛋白破壞了乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。紅血突變(rb)在幼蟲(chóng)期皮膚呈現(xiàn)紅棕色，血液于空氣中變?yōu)榧t色，該突變位于第21連鎖群0.0 cM處。MENG等［67］分離出細(xì)菌型犬尿氨酸酶候選基因，發(fā)現(xiàn)編碼基因中出現(xiàn)一個(gè)堿基的替換，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第102位的異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸，使得酶活性明顯降低。褐頭尾斑突變(bts)的頭部、胸足及肛板在幼蟲(chóng)期呈深棕褐色，它還有一種等位突變體第2褐頭尾斑(bts2)，一般第2褐頭尾斑比褐頭尾斑著色深。ITO等［68］利用連鎖分型分析發(fā)現(xiàn)，2種突變體中的yellow－e基因都出現(xiàn)異常轉(zhuǎn)錄本，bts中的yellow－e基因第5外顯子缺失，而bts2中的yellow－e基因第6外顯子多了385 bp，第7、8外顯子處缺失了6 kb片段，導(dǎo)致yellow－e基因的功能域被破壞，功能上出現(xiàn)缺陷。油蠶皮膚透明主要有2個(gè)原因:一個(gè)是尿酸合成受阻，如oq和og由于XDH活性降低而導(dǎo)致尿酸合成途徑異常，蠶體內(nèi)尿酸含量過(guò)低;另一個(gè)是生成的尿酸運(yùn)輸受阻，如蠟油蠶突變(ow)，ITO等［69］利用質(zhì)譜分析(SNP)技術(shù)確定該突變的候選基因?yàn)锽m-Varp，發(fā)現(xiàn)在其開(kāi)放閱讀框的1 291 nt處插入了一段25 bp的片段，從而導(dǎo)致移碼，目前推測(cè)該基因與尿酸鹽在真皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。

(4)繭色及繭絲突變體。蠶繭根據(jù)顏色可分為白色繭和彩色繭，蠶繭的顏色與家蠶中腸和中部絲腺的色素透過(guò)性相關(guān)，受遺傳基因控制。天然彩色繭有黃紅繭和綠繭2類，黃紅繭主要是由類胡蘿卜素的種類和分布所控制;綠繭主要是由黃酮類色素的種類和分布所控制［70］。控制家蠶黃紅繭系的基因眾多，其中黃血基因Y被認(rèn)為是繭色的決定性因子，其它的繭色基因控制的對(duì)應(yīng)表型的出現(xiàn)都是以Y基因的存在為前提的，這其中包括黃繭基因C、肉色繭基因F、紅色繭基因Pk、銹色繭基因Rc等。Y基因編碼一個(gè)類胡蘿卜素結(jié)合蛋白(CBP)。C基因的產(chǎn)物為Cameo2，是一個(gè)屬于CD36家族的跨膜蛋白，該家族的成員為跨膜的脂蛋白受體。Cameo2和CBP分別為跨膜蛋白和胞內(nèi)載體蛋白，協(xié)同促進(jìn)類胡蘿卜素特別是葉黃素由家蠶中腸到絲腺的運(yùn)輸，最終使蠶繭著黃色。而另外一個(gè)黃血抑制基因I，可以使類胡蘿卜素氧化分解，最終導(dǎo)致無(wú)色的血液和白色的蠶繭［71－73］。綠繭b突變(Gb)由于黃酮類物質(zhì)在蠶繭中積累過(guò)多，在紫外光下會(huì)呈現(xiàn)出亮黃色的熒光，該蠶繭具有較好的抗紫外穿透能力。DAIMON等［74］發(fā)現(xiàn)，Gb位點(diǎn)基因能夠編碼一種槲皮黃酮5－O－葡糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白，由于突變體在該基因處有38 kb的缺失，使得基因結(jié)構(gòu)缺陷。裸蛹突變(Nd)主要表現(xiàn)為繭層較薄，易被撕破，繭絲中只含有絲膠，還有部分幼蟲(chóng)根本無(wú)法結(jié)繭，該突變位于第25連鎖群0.0 cM處。裸蛹突變還有一種等位突變橋本裸蛹(NdH)，楊曉博等［75］利用SSR分子定位技術(shù)對(duì)裸蛹突變進(jìn)行連鎖定位，精細(xì)定位后篩選出1個(gè)可能參與裸蛹突變的候選基因;在野生型和突變型中該基因的表達(dá)有明顯差異，且在突變體中出現(xiàn)異常選擇性剪切［76］。絲膠繭突變體(Nd－s)是只含絲膠，易被撕破的蠶繭，其突變是由絲素輕鏈基因突變導(dǎo)致絲素輕鏈蛋白不能合成而引起的，位于第14連鎖群19.2 cM處，與野生型相比，絲素輕鏈基因的不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)差異［77－78］。

(5)變態(tài)發(fā)育類突變體。蛻皮激素和保幼激素對(duì)昆蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育具有一定的調(diào)節(jié)作用，家蠶中就有一類“蛻皮多態(tài)型”突變體——二眠蠶突變(mod)，該突變主要表現(xiàn)為蠶體在經(jīng)歷2次眠期后就進(jìn)入老熟(也有少量經(jīng)歷3次眠期后老熟的)，且在幼蟲(chóng)期血淋巴中缺乏保幼激素，該突變位于第11連鎖群27.4 cM處。DAIMON等［79］通過(guò)定位克隆的方式研究發(fā)現(xiàn)，二眠蠶突變的候選基因是細(xì)胞色素P450家族成員CYP15C1，在mod中該基因的第6外顯子有68 bp的缺失，在生化實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中也證明了該基因參與保幼激素的合成，對(duì)家蠶的變態(tài)發(fā)育具有重要作用。還有一類“蛻皮多態(tài)型”突變體——光澤不眠蠶突變(nm－g)，該突變幼蟲(chóng)不蛻皮，約存活2周后死亡。NIWA等［80］通過(guò)定位克隆技術(shù)對(duì)nm－g突變體中蛻皮激素的合成路徑進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了1個(gè)能夠編碼短鏈脫氫酶的蛻皮甾醇合成基因，在其第3外顯子處插入一段5.2 kb序列，使得開(kāi)放閱讀框破壞，導(dǎo)致突變體中蛻皮激素濃度很低。

(6)軀體發(fā)育突變體。為更好地適應(yīng)外部環(huán)境的改變，昆蟲(chóng)形態(tài)會(huì)發(fā)生多樣性改變，這與軀體發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因的差異化表達(dá)相關(guān)。軀體模式突變中存在很多同源異型突變體，其中除了過(guò)剩半月紋退化腹肢為隱性遺傳［81－82］外，其他的都是顯性突變且大部分突變體為純合致死，在純合致死中主要為胚胎后期致死。家蠶軀體模式的主調(diào)控基因是同源異型基因(homeotic genes，Hox)，它被定位在第6染色體上。在家蠶中軀體發(fā)育突變主要為E群突變，還存在許多與E群突變相類似的變異，涉及到幼蟲(chóng)的斑紋、腹肢、成蟲(chóng)翅及生殖系統(tǒng)等方面［83］。家蠶姬過(guò)剩肢突變體主要表現(xiàn)為全身素白，無(wú)任何斑紋，在第2腹節(jié)有1對(duì)形似正常腹肢遠(yuǎn)端部分的較小過(guò)剩腹肢，其爪鉤數(shù)量少，長(zhǎng)度短，在腹肢頂端呈環(huán)狀。姬過(guò)剩肢突變位于第6連鎖群的21.2 cM處。李丹丹［84］利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)姬過(guò)剩肢突變基因定位，篩選出Bm－AbdA候選基因，同時(shí)在mRNA及蛋白質(zhì)水平上對(duì)候選基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了除Bm－AbdA基因原有的3種剪切方式外還存在2種新的剪切方式。

(7)其它突變體。臭蠶突變(sku)幼蟲(chóng)的糞便中因含有過(guò)量的異戊酸而散發(fā)出異常的氣味，且其血淋巴中含有大量的支鏈氨基酸，在蛹前期就會(huì)死亡，該突變位于第22連鎖群，表現(xiàn)出常染色體隱性致死的現(xiàn)象。URANO等［85］在對(duì)sku的連鎖分析中發(fā)現(xiàn)，該突變位點(diǎn)與家蠶IVD基因緊密連鎖，突變體中IVD基因開(kāi)放閱讀框第1 127位發(fā)生堿基替換(G－T)，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，酶活性明顯下降。肌肉缺陷型突變(Md)中的雄蛾失去扇動(dòng)翅膀的能力，影響其移動(dòng)及捕獲信息素完成交配的過(guò)程。FJUII等［86］利用缺失定位及染色體片段易位的方式確定其突變位置，得到3個(gè)在果蠅中參與肌肉構(gòu)建及與翅膀運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因，在突變體中這3個(gè)基因均缺失，目前還不清楚哪個(gè)基因的缺失會(huì)直接導(dǎo)致Md突變?？?型濃核病突變(nsd－2)對(duì)DNV－2病毒不敏感，有明顯的抗性，該突變位于第17連鎖群，目前經(jīng)典座位還不確定。ITO等［87］利用BAC文庫(kù)染色體步移技術(shù)，最終篩選出nsd－2的候選基因，該突變基因中有6 kb的缺失，編碼的跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)域受到損壞，因此可能失去了與病毒顆粒結(jié)合或轉(zhuǎn)運(yùn)病毒的能力。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)，當(dāng)該基因存在時(shí)，確實(shí)能與病毒結(jié)合或參與病毒轉(zhuǎn)運(yùn)，而使家蠶染病死亡。

3 家蠶突變體在育種中的應(yīng)用

3.1 在抗病品種選育方面的應(yīng)用

在養(yǎng)蠶業(yè)中，病毒性疾病會(huì)造成巨大的損失［88］，培育抗病蠶品種是蠶業(yè)發(fā)展中更加經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。秦儉等［89］在抗?jié)夂瞬≌{(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了28個(gè)抗性品種，之后以斑紋基因作為遺傳標(biāo)記，使得家蠶第15染色體上同時(shí)具有抗?jié)夂瞬』蚝桶呒y基因眼紋全黑基因，從而培養(yǎng)出帶有斑紋標(biāo)記的家蠶抗?jié)夂瞬〔牧?，?chuàng)建了不用添毒篩選抗性品種的選育方法。

3.2 在限性品種選育方面的應(yīng)用

通過(guò)誘發(fā)突變所產(chǎn)生的獨(dú)特效應(yīng)育成限性品種，如限性斑紋系統(tǒng)、限性卵色系統(tǒng)、限性蠶體色系統(tǒng)等，不僅能夠解決生產(chǎn)中雌雄鑒別的問(wèn)題，大大提高了工作效率，降低了生產(chǎn)成本，而且可以在生產(chǎn)中利用雄蠶繅絲，提高出絲率及生絲品位。劉新濤等［90］以一種黑白雙色卵家蠶品種為材料，將黑白卵色基因向2個(gè)方向分離為目標(biāo)，選育出1個(gè)白色卵品系、1個(gè)黑色卵品系及2個(gè)黑卵為雌白卵為雄的黑白限性品系。

3.3 在致死性品種選育方面的應(yīng)用

我國(guó)從俄羅斯引進(jìn)的家蠶伴性連鎖平衡致死品系S－8、S－14等，因其雄蠶與任何品種的雌蠶交配，成活的幾乎均為雄卵，實(shí)現(xiàn)了專養(yǎng)雄蠶的目的［91］。此后科研人員在經(jīng)濟(jì)性狀方面不斷對(duì)其進(jìn)行改良，并達(dá)到了實(shí)用化水平，目前已經(jīng)在浙江省湖州市等蠶區(qū)推廣應(yīng)用。利用sch胚胎溫敏致死性，通過(guò)連續(xù)回交的傳統(tǒng)育種方式將od100和XT000分別導(dǎo)入夏芳、秋白品種中，成功育成具有高溫致死性的蠶品種夏sch和秋sch，其經(jīng)濟(jì)性狀已達(dá)到實(shí)用化水平，有較大的應(yīng)用價(jià)值［92］。

3.4 在其它方面的應(yīng)用

突變品種中的絲膠繭突變體蠶繭只含絲膠，李軍等［93］通過(guò)雜交育種、系統(tǒng)選育及目的基因定向?qū)氲确椒ㄟx育出絲膠繭新素材，生產(chǎn)出的高純度絲膠為食用及化妝品方面的利用提供了高質(zhì)量材料。在蠶種繁育中，一般會(huì)采用散卵來(lái)提高原種質(zhì)量，而蠶卵在產(chǎn)出時(shí)表面會(huì)附有一層蛋白膠質(zhì)，使蠶卵具有粘附性，蠶卵無(wú)膠質(zhì)突變使蠶卵不具有粘附性，可以自然形成散卵，省去上漿脫漿等工序，提高了蠶種繁育的效率。林昌麒等［94］采用多元雜交法成功育成蠶卵無(wú)膠著力品種9357、9214等，經(jīng)濟(jì)性狀達(dá)到實(shí)用化水平，且組配繁育的四元雜交種在農(nóng)村試養(yǎng)效果良好。

4 結(jié)語(yǔ)

基因突變是生物進(jìn)化的重要?jiǎng)恿?，作為重要的遺傳模式生物——家蠶有著5 000多年的馴化歷史，在自然突變和人工選擇過(guò)程中積累了豐富的突變資源。這些突變體為研究家蠶的生理機(jī)制，完善家蠶的代謝途徑提供了重要材料。雖然，目前對(duì)家蠶突變性狀的研究取得了許多重大進(jìn)展，但仍有一些重要突變的形成機(jī)制尚未解析，還需要進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。而且對(duì)于突變基因在育種方面的開(kāi)發(fā)還有些滯后，應(yīng)用于育種工作中的突變基因所占突變基因總量比例很小。因此，在以后的工作中要加大對(duì)突變基因的鑒定與培育力度，開(kāi)發(fā)出更多有應(yīng)用前景的素材，實(shí)現(xiàn)家蠶種質(zhì)創(chuàng)新，提高蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展空間。分子生物技術(shù)與育種工作相結(jié)合，在基因水平上分析突變品種的基因型，可以更好地提高育種工作中的選擇性，對(duì)于有益突變可以通過(guò)分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)育種手段的結(jié)合，使育種工作定向發(fā)展。

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S881.2

B

1007－0982(2017)02－0042－10

10.16839/j.cnki.zgcy.2017.02.009

2016－12－14;接受日期:2017－04－18

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(編號(hào)CARS－22)。

信息:楊建華(1990—)，女，山西朔州，碩士研究生。E-mail:1084030835@qq.com

信息:徐安英(1958—)，研究員，碩士生導(dǎo)師。Tel:0511－85616575，E-mail:srixay@126.com