早期非小細胞肺癌ALK陽性患者的臨床研究進展

高瓊瓊 蔣湘俐 黃純

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來成為我國癌癥死亡最主要的原因[1]。據(jù)國家癌癥中心2015年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：2006年-2011年我國肺癌5年患病率是130.2（1/10萬）。其中男性84.6（1/10萬），居惡性腫瘤第2位；女性45.6（1/10萬），居惡性腫瘤第4位[2]。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌患者的85%[3]。流行病學數(shù)據(jù)顯示，不足43%的NSCLC患者初診時為早期，并獲得根治性治療機會。然而，57%以上的NSCLC患者初診時即為晚期，已經(jīng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。對于晚期NSCLC患者，除一線含鉑雙藥化療外，分子靶向治療越來越多的受到人們的關(guān)注。棘皮動物微管相關(guān)蛋白-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein-like 4 gene and the anaplastic lymphoma kinase gene, EML4-ALK）等分子亞型的出現(xiàn)，使得人們對NSCLC的發(fā)生、發(fā)展的分子機制進一步明確，而針對EML4-ALK致癌靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）-克唑替尼（crizotinib）等，因其具備良好的療效和安全性，已被批準應用于ALK陽性晚期NSCLC患者的治療。對于ALK陽性早期NSCLC患者，ALK-TKIs應用必要性尚不明確，本文主要介紹ALK陽性NSCLC患者的檢測進展，ALK陽性早期NSCLC患者的臨床病理特征、預后，評價ALK-TKIs在ALK陽性早期NSCLC患者中的地位和意義。

1 EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)

EML4-ALK是在2007年由Soda等[4]通過應用酪氨酸激酶蛋白組學技術(shù)從一個肺腺癌患者腫瘤組織中篩選致癌基因時首次發(fā)現(xiàn)的。EML4屬于棘皮動物微管蛋白相關(guān)類蛋白家族，由N端Basic區(qū)、HELP域和WD重復區(qū)構(gòu)成；ALK屬于胰島素受體超家族，由細胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)組成。ALK蛋白通過活化下游的STAT3和MARK信號傳導通路及激活RAS/ERK、PI3K/AKT等多條其他的信號通路來調(diào)控細胞的增殖和凋亡。正是由于2號染色體短臂的微小倒置導致EML4 N端Basic區(qū)、HELP域和部分WD重復區(qū)在ALK胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)發(fā)生融合，形成EML4-ALK融合基因。融合基因的EML4部分均具有致癌活性，其中以Basic區(qū)致癌活性最高，這種致癌活性依賴于融合伴侶EML4和ALK的二聚作用對酪氨酸激酶的激活。EML4-ALK在體內(nèi)及體外均擁有強大的致癌活性[4,5]，這種致癌活性可以被針對ALK靶點的小分子TKIs有效阻斷[5,6]，這為EML4-ALK作為肺癌發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動因子提供了證據(jù)。EML4-ALK存在十余種融合基因亞型，最常見的融合亞型為E13:A20和E6a/b:A20，發(fā)生率分別為33%和29%[7,8]。當然，在NSCLC中，除了EML4作為ALK的常見融合伴侶外，研究還相繼發(fā)現(xiàn)了其他的ALK融合伴侶，包括TFG[9]、KIF5B[10]、KLC1[11]、HIP1[12]、TPR[13]、SEC31A[14]等。

2 ALK融合基因檢測技術(shù)的發(fā)展

現(xiàn)在有3種不同的方式來檢測ALK融合基因的表達情況，分別是免疫組化（immunohistochemistry, IHC）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）。在臨床上，F(xiàn)ISH和RT-PCR技術(shù)檢測ALK融合基因已有相應試劑盒通過美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）及國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration,CFDA）的認證。2013年美國國家綜合癌癥網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南也明確表示FISH可作為ALK融合基因檢測的金標準。然而，F(xiàn)ISH熒光信號消減迅速，難以測定腫瘤整體形態(tài)學及腫瘤異質(zhì)性，且價格昂貴[15]；RT-PCR對引物要求較高，需要較多RNA及石蠟組織樣本易降解[16]等因素，使得FISH和RT-PCR技術(shù)不易普及。相比而言，IHC便宜、高效、快速，因而被廣泛應用于常規(guī)的病理學實驗室。然而，IHC的實驗操作和結(jié)果評價存在一定的主觀性，且IHC檢測質(zhì)量很大程度上取決于抗體的質(zhì)量，但目前已開發(fā)的商業(yè)化EML4-ALK抗體的特異性及敏感性不夠高，低表達的EML4-ALK融合蛋白往往被漏檢[17]。所以開發(fā)高特異性及高敏感性的抗體至關(guān)重要。Pyo等[18]在IHC篩查ALK重排的系統(tǒng)回顧和meta分析中指出：IHC的敏感性和特異性分別為92%和91%。劉暢等[19]在免疫組化法檢測EML4-ALK融合突變價值的meta分析中得出特異性抗體IHC法檢測EML4-ALK融合基因的方法可行，具有高特異度和敏感度，可作為一種簡單快速的篩查方法，具有臨床應用價值。而針對4種不同的ALK抗體D5F3（ventana）、D5F3（CST）、1A4/1H7（OriGene Tech）和5A4（Abcam）其敏感性分別為93.8%、84.4%、93.8%和56.3%，其特異性和陽性預測值均為100%[20]。尤其是新研發(fā)的單克隆抗體D5F3（ventana）大大提高了檢測的特異性和敏感性[20,21]，甚至有研究[22]認為其可以作為有明確染色模式下的ALK融合基因的獨立檢測手段。最近，羅氏公司推出的用于識別肺癌患者EML4-ALK融合蛋白表達的首款全自動VENTANA ALK（D5F3）IHC檢測試劑盒獲得FDA及CFDA認證，研究表明，該方法檢測EML4-ALK融合蛋白的特異性和敏感性分別為98%和100%[23]，金貽鐸等[24]研究指出相較于RT-PCR，手工IHC檢測EML4-ALK融合蛋白的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為82.4%、95.1%、73.7%和97%，二者的總體符合率為93.3%，VENTANA IHC檢測EML4-ALK融合蛋白的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為93.3%、100%、100%和99.1%，二者的總體符合率為99.1%。VENTANA IHC相較于手工IHC具備更高的特異性和敏感性，且該方法已被批準用于篩選適合服用輝瑞制藥有限公司的克唑替尼的患者，這極大肯定了IHC在ALK檢測中的地位和作用。

3 ALK融合基因陽性患者的臨床病理特征

因檢測方法、檢測人群不同，A LK融合基因在NSCLC患者中的陽性率為1.4%-13%[25-28]，且在IV期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中，ALK融合基因的陽性率比較高。有研究指出晚期NSCLC患者ALK融合基因的陽性率為8.7%-9.0%[29,30]，而在早期NSCLC患者中的陽性率僅為2.4%-8.6%[31-35]，明顯低于晚期患者。這點和Zhao等[36]在關(guān)于ALK融合基因臨床特征的meta分析中得出的結(jié)論是一致的，他指出ALK融合基因在III期-IV期的NSCLC患者中的檢出率高于I期-II期患者，即ALK融合基因在晚期NSCLC患者的陽性率高于早期NSCLC患者。關(guān)于早期和晚期ALK融合基因陽性患者的臨床病理特征普遍達成共識，即：年輕、不吸煙或少量吸煙、富含印戒細胞或?qū)嶓w成分的腺癌、EGFR或KRAS突變野生型的NSCLC[25-35]。有研究指出ALK融合基因在EGFR或KRAS突變陰性的NSCLC患者中的陽性率高達25.7%-34%[25,32,37]。

4 ALK融合基因?qū)υ缙贜SCLC患者預后的影響

一直以來，關(guān)于ALK融合基因表達情況是否影響早期NSCLC患者的預后尚存有一些爭議。韓國Paik等[31]回顧性研究了接受根治性手術(shù)治療的早期NSCLC中ALK陽性患者的臨床病理特征和預后情況，研究指出，運用FISH技術(shù)對735例患者手術(shù)標本進行ALK融合基因檢測，其中ALK陽性患者28例（3.8%），ALK陽性率在腺癌、女性、不吸煙患者中明顯升高，分別為6.8%、7.6%和8.9%；ALK陽性患者中位年齡55歲，明顯低于ALK陰性患者（P＜0.001）；中位隨訪時間41.6個月時，ALK陽性患者與ALK陰性患者的總生存（overall survival, OS）分別為97.7個月 vs 78.9個月（P=0.10），無病生存期（disease-free survival, DFS）分別為76.4個月 vs 71.3個月（P=0.66），ALK陽性患者與ALK陰性患者的DFS及OS無統(tǒng)計學差異，ALK融合基因并非是影響患者DFS和OS的預后因素。研究還發(fā)現(xiàn)ALK陽性患者T分期級別較陰性患者低，且主要集中在T1期（P=0.02），但在腺癌患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移級別較陰性患者高，這說明了ALK陽性患者具備原發(fā)腫瘤雖小但易出現(xiàn)早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨特的生物學特征，也進一步解釋了晚期NSCLC患者ALK陽性率較早期患者高的原因。而來自韓國的另外一項研究[32]同樣指出，ALK陽性患者的T分期級別較陰性者低，但未指出兩組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的不同。該研究還發(fā)現(xiàn)，在納入研究的162例接受根治性手術(shù)治療的早期不吸煙肺腺癌患者中，ALK陽性患者14例（8.6%）；中位隨訪時間40.8個月，ALK陽性患者與ALK陰性患者的OS無統(tǒng)計學差異，但ALK陽性患者DFS更短（P=0.022），提示ALK陽性患者更易出現(xiàn)術(shù)后疾病的復發(fā)。泰國Tantraworasin等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在267例接受根治性手術(shù)的NSCLC患者中，ALK陽性更易出現(xiàn)在年齡小于55歲、存在臟胸膜受侵犯、有肺癌家族史的NSCLC患者中，且ALK陽性患者更易出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)；該研究指出ALK融合基因并非是影響DFS和OS的預后因素，這一點和Paik等[31]的研究結(jié)果是一致的。然而韓國Kim等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在119例接受根治性手術(shù)治療的早期NSCLC患者中，ALK陽性患者和ALK陰性患者的RFS無統(tǒng)計學差異，即ALK陽性和腫瘤復發(fā)無關(guān)；另外該研究還指出ALK陽性患者OS更短，說明ALK陽性可能是早期NSCLC患者的預后不良的因素。張夢雪等[38]研究指出：在95例早期NSCLC患者中，ALK陽性患者OS更長，預后更好。Blackhall等[33]的關(guān)于歐洲人群的研究顯示，在1,281例接受根治性手術(shù)切除的肺腺癌患者中，ALK陽性患者較ALK陰性患者OS更長，即ALK陽性患者較ALK陰性患者預后好。

為了進一步分析造成不同結(jié)論的原因，有研究者將早期NSCLC按照病理或臨床分期分成不同的亞組來研究。Ohba等[35]指出，在256例病理分期為I期的日本肺腺癌患者中，ALK融合基因并非是影響肺腺癌患者DFS和OS的預后因素。Zhou等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，在488例中國NSCLC患者中，165例為IIIa期，僅在IIIa期NSCLC患者中，ALK陽性者較ALK陰性者DFS更短，其他分期組ALK陽性和陰性者的DFS無統(tǒng)計學差異。

分析以上資料，我們發(fā)現(xiàn)：ALK陽性對亞裔人群預后的影響各不相同。這種差異很可能是受回顧性研究的限制、隨訪時間短、樣本量較小、檢測技術(shù)等混雜因素的影響，而比較歐美和亞裔人群的研究結(jié)果提示我們ALK陽性對不同種族人群預后的影響可能不同。

ALK融合基因?qū)ν砥贜SCLC患者預后的影響現(xiàn)已比較明確。研究指出ALK陽性患者和ALK陰性患者對含鉑化療方案的敏感性無統(tǒng)計學差異，ALK陽性患者和ALK陰性患者DFS和OS無統(tǒng)計學差異[25,30,39]。而Yang等[39]的研究進一步指出，ALK陽性者較ALK陰性者有著更短的DFS，但OS無統(tǒng)計學差異；ALK陽性肺腺癌患者在被確診后的5年內(nèi)，疾病的進展和復發(fā)率是ALK陰性患者的2倍。對晚期NSCLC患者而言，ALK融合基因并非影響預后的因素，ALK陽性患者更易出現(xiàn)疾病的進展。

5 ALK抑制劑

克唑替尼（crizotinib）是2005年合成的一種ATP競爭性TKI，具有抗ALK活性的脫靶效應，可作為小分子ATP模擬化合物與ATP靶位結(jié)合，從而阻滯了ALK下游信號通路的激活，進一步阻滯腫瘤細胞生長及侵襲[40]。III期臨床試驗PROFILE1014[41]結(jié)果顯示：克唑替尼作為一線用藥對于延長ALK陽性晚期NSCLC患者的無進展生存期的療效要優(yōu)于標準化療。盡管ALK陽性晚期NSCLC患者可以從克唑替尼中獲益，但與EGFR-TKIs一樣，大多數(shù)患者在獲得8個月-10個月的腫瘤控制后，最終會發(fā)展成獲得性耐藥。耐藥機制主要包括ALK激酶區(qū)二次突變、ALK融合基因擴增、旁路激活途徑等。多項研究對解決克唑替尼耐藥問題進行了探索，Ou等[42]研究表明：服用克唑替尼患者出現(xiàn)疾病進展后繼續(xù)用藥比停止服藥獲益明顯。第2代ALK抑制劑由于其在結(jié)構(gòu)上與克唑替尼差異明顯，不僅對克唑替尼敏感的ALK陽性晚期NSCLC患者有效，而且對克唑替尼耐藥患者更是表現(xiàn)出強大的療效。目前經(jīng)FDA批準上市的有Ceritinib，正在進行臨床研究的藥物有Alectinib、AP26113。Ceritinib能抑制ALK自身磷酸化和ALK介導下游信號蛋白（STAT3）的磷酸化，F(xiàn)riboulet等[43]研究指出：Ceritinib對L1196M、G1269A、S1206Y、I1171T等ALK激酶區(qū)突變引起的耐藥具有顯著活性；Alectinib在體外化合物篩選時具有很強的ALK抑制活性，Kodama等[44]研究發(fā)現(xiàn)：Alectinib可以對已知的大多數(shù)ALK耐藥類型有效；AP26113是ALK、EGFR雙重抑制劑，對絕大部分ALK耐藥療效顯著，Viala等[45]發(fā)現(xiàn)AP26113等可有效解決L1196M突變引起的耐藥問題。另外，HSP90抑制劑可以下調(diào)ALK融合蛋白的表達水平，對ALK陽性的未經(jīng)克唑替尼處理或?qū)诉蛱婺崮退幍募毎哂辛己玫幕钚裕嚓P(guān)研究已進入臨床試驗階段[46]。

6 小結(jié)

EML4-ALK融合基因是肺癌的重要分子亞型，由于2號染色體短臂的微小倒置導致EML4N端Basic區(qū)、HELP域和部分WD重復區(qū)在ALK胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)發(fā)生融合，EML4-ALK存在十余種融合基因亞型，除了EML4作為ALK的常見融合伴侶外，研究還相繼發(fā)現(xiàn)了其他至少6種ALK融合伴侶。綜合IHC、FISH和RT-PCR檢測技術(shù)，IHC的應用更為重要和普及，尤其是全自動VENTANA ALK（D5F3）IHC檢測試劑盒的獲批，極大肯定了IHC在ALK檢測中的地位和作用。EML4-ALK融合基因多見于年輕、不吸煙或少量吸煙、富含印戒細胞或?qū)嵭孕拖侔?、EGFR或KRAS突變野生型的NSCLC患者，且早期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因的檢出率低于晚期患者?？诉蛱婺岬華LK-TKIs在晚期ALK陽性NSCLC患者中的治療作用已得到廣泛認可，但目前缺乏資料證明ALK-TKIs可使早期ALK陽性NSCLC患者受益，這或許是因為ALK融合基因?qū)υ缙贜SCLC患者預后的影響尚不明確。本文對有限的早期資料進行了總結(jié)，多數(shù)研究證明ALK融合基因和NSCLC患者的預后無關(guān)，僅Kim等[26]的研究指出ALK陽性早期NSCLC患者預后不良，為了進一步明確這一問題，我們收集了1,108例多中心的早期NSCLC患者的標本和臨床資料進行分析，目前尚在進行中，期待能得出有臨床指導意義的結(jié)果。