生姜糖蛋白提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

趙文竹,張瑞雪,于志鵬,*,陳月皎,張宏玲,王欣珂,劉靜波,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

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生姜糖蛋白提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

趙文竹1,張瑞雪1,于志鵬1,*,陳月皎1,張宏玲1,王欣珂1,劉靜波2,勵建榮1,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013; 2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

以生姜為原料,在單因素實驗基礎上采用三元二次回歸正交組合設計優(yōu)化生姜糖蛋白的提取工藝,采用紅外光譜初步分析了生姜糖蛋白的結構特征。同時,考察了生姜糖蛋白的抗氧化活性和凝集素芯片的熒光強度。結果表明,生姜糖蛋白的最優(yōu)提取條件:提取溫度為90 ℃,液固比為35.5∶1,pH為7.5,在此條件下提取3 h,蛋白質得率為2.437 mg/g,糖得率為117.126 mg/g；經(jīng)分離純化獲得的生姜糖蛋白,采用紅外光譜分析表明其存在多糖和蛋白質的特征吸收峰?？寡趸瘜嶒炁c凝集素芯片實驗結果表明,生姜糖蛋白在蛋白表面具有糖鏈結構,且可以螯和金屬離子,具備一定的還原能力與重要的生理功能。

生姜,糖蛋白,正交組合設計,紅外光譜,抗氧化活性,凝集素芯片

糖蛋白是一類由糖類與多肽或蛋白質以共價鍵連接而成的結合蛋白,具有驅寒、止嘔、健胃解毒、延緩衰老、降低膽固醇、抗癌、抑菌及抗阿爾茲海默癥等多種功能[1-3]。糖蛋白廣泛存在于動物、植物和微生物中,是生物體內重要的一類大分子,是構成細胞膜、血漿、黏液和激素的重要成分,也是生物體內的重要活性物質[4]。目前,研究者廣泛從海帶[5]、甘薯[6]、山藥[7]及油茶籽中提取制備糖蛋白。生姜(RhizomaZingiberisRecens)作為香辛調味料及中醫(yī)藥材,主要以保鮮姜等初加工產(chǎn)品為主。目前針對生姜的研究主要側重姜酚、姜油萜、姜多糖和姜酮等多種成分的提取、純化及活性的研究[8],但在國內對生姜糖蛋白的研究卻僅僅局限在生姜蛋白酶。

糖蛋白作為一種結合蛋白,兼具多糖和蛋白質的某些性質,大多數(shù)可溶于水及稀鹽、稀酸和稀堿等溶液中。因此,天然糖蛋白的提取方法主要有水提法[9]、稀鹽溶液或緩沖溶液提取法[10]、酸堿溶液提取法[11]、酶解法[12]、超聲與微波輔助法[13]等方法。其中水提法操作工藝簡單,但受脂質和游離蛋白質的影響大;稀鹽溶液或緩沖鹽溶液中的鹽離子可以與蛋白質部分結合保護蛋白質使其不易變性,進而最大限度地保護糖蛋白的完整性和生物活性,但后續(xù)需進行透析等脫鹽處理;酸堿溶液提取法專一性強,但要注意防止過酸或過堿導致蛋白質構象的不可逆變化;酶解法提取糖蛋白不僅可以縮短提取時間和增大提取效率,而且因酶具有高度專一性和選擇性可以選擇性地去除雜質,對各種成分起到很好的濃縮富集作用。但酶制劑的種類和酶解條件需要進一步探索;超聲與微波輔助提取法,具有溶劑用量少、熱效率高、提取時間短等優(yōu)點,但工業(yè)化提取時,受設備限制。由此,本實驗選取稀鹽和緩沖溶液提取法,同時采用三元二次回歸正交組合設計優(yōu)化生姜糖蛋白的提取工藝參數(shù)[14],從最優(yōu)條件下的提取液中經(jīng)醇沉、透析后得到生姜糖蛋白,并分析其紅外光譜特性和抗氧化活性,旨在為生姜及其糖蛋白的基礎研究和高值化利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜 購于興隆大家庭購物中心(錦州);磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、苯酚、濃硫酸、三氯乙酸、考馬斯亮藍G250 均為分析純;凝集素GNA、ECA、Jacalin、LotusA、WGA、SNA、PNA、MAL、LCA、VVA、ConA、STL及LEL等 購于 Sigma 公司;Cy3 熒光染料 購自于 GE 公司;Ferrozine(菲洛嗪)及DPPH 購于Sigma 公司。

FA1204B數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫實驗儀器廠;KF20002電子天平 凱豐集團有限公司;SHE-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;KQ-100DB臺式數(shù)控超聲波清洗器 成都一科儀器設備有限公司;UV-5100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;DHG-9070A鼓風干燥箱 上海-恒科學儀器有限公司;Lambda 750紫外/可見/近紅外分光光度計 珀金埃爾默公司;TG16KR臺式離心機 東旺儀器廠;IRPrestige-21紅外光譜儀 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜的預處理 為了保證實驗原料在實驗過程中的穩(wěn)定均一性,本實驗將生姜洗凈后切片,于60 ℃烘箱中干燥24 h,取出后磨成細粉過100目篩,獲得的生姜粉密封后保存待用。

1.2.2 生姜糖蛋白的提取工藝 取2 g生姜粉置于提取燒瓶中,按照已設定好的提取條件,加入磷酸鉀緩沖溶液,根據(jù)所加入緩沖液的體積加入NaCl固體粉末使NaCl的濃度為0.1 mol/L,待水浴溫度達到設定溫度時開始浸提,同時開啟冷凝裝置,提取一定時間后,經(jīng)布氏漏斗抽濾,獲得提取液。

1.2.3 生姜糖蛋白提取的單因素實驗 經(jīng)單因素實驗初步考察提取溫度、提取時間、液固比和pH四個因素對生姜糖蛋白提取效果的影響。

1.2.3.1 提取溫度對生姜糖蛋白提取效果的影響 設定生姜糖蛋白的提取溫度分別為40、50、60、70、80和90 ℃,并在液固比20∶1、NaCl的濃度為0.1 mol/L條件下提取3 h,研究溫度對生姜糖蛋白提取效果的影響。

1.2.3.2 提取時間對生姜糖蛋白提取效果的影響 將生姜糖蛋白的提取時間分別設定為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 h,并在溫度為70 ℃、液固比20∶1和NaCl的濃度為0.1 mol/L條件下提取,研究提取時間對生姜糖蛋白提取效果的影響。

1.2.3.3 液固比對生姜糖蛋白提取效果的影響 將磷酸鉀緩沖溶液:生姜粉的液固比分別設定為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1,并在溫度為70 ℃、NaCl的濃度為0.1 mol/L條件下提取3 h,研究液固比對生姜糖蛋白提取效果的影響。

1.2.3.4 pH對生姜糖蛋白提取效果的影響 將設定磷酸鉀緩沖溶液的pH分別為5.8、6.3、6.8、7.3、7.8、8.3,并在溫度為70 ℃、液固比20∶1、NaCl的濃度為0.1 mol/L條件下提取3 h,研究pH對生姜糖蛋白提取效果的影響。

1.2.4 生姜糖蛋白提取回歸模型的建立 經(jīng)單因素實驗研究發(fā)現(xiàn),提取時間為3 h時,對糖蛋白提取效果影響最大,綜合考慮固定提取時間為3 h,選取提取溫度、液固比和pH,采用三元二次回歸正交組合設計,確立生姜蛋白的二次回歸模型,三元二次回歸正交設計因素編碼表見表1。

表1 因素水平編碼表

1.2.5 測定方法 由于糖蛋白中的蛋白質與多糖通過糖肽共價鍵相連,不同類型的糖蛋白中蛋白質和糖的含量不同,因此糖蛋白的測定相對比較復雜,李婷婷[15]等人采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍法分別測定糖蛋白提取液中的糖和蛋白質的含量,以全面反映糖蛋白的提取率。本文采用李婷婷等人建立的糖蛋白的測定方法進行生姜糖蛋白的測定,采用凝集素芯片法測定生姜糖蛋白中糖鏈組成。

1.2.6 生姜糖蛋白的分離純化和紅外光譜分析 將最優(yōu)條件下提取出的生姜糖蛋白提取液,濃縮。濃縮液用4倍體積的無水乙醇于4 ℃冰箱進行沉淀,去除雜蛋白、雜多糖,以提高生姜糖蛋白純度。靜置過夜后于4000 r/min下離心得到沉淀物。沉淀物用適量水溶液,并于4 ℃進行透析,然后經(jīng)冷凍干燥得到糖蛋白粗品。采用KBr壓片法在波數(shù)為400～4000 cm-1,測定糖蛋白的紅外光譜圖。

1.2.7 生姜糖蛋白抗氧化活性

1.2.7.1 清除DPPH·能力 取不同濃度(0.2～1.2 mg/mL)的樣品液(冷凍干燥得到的糖蛋白粗品)2 mL,依次加入2 mL、2×10-4mol/mL DPPH溶液,室溫下避光反應30 min,測定波長517 nm的吸光度A,同時以無水乙醇為空白對照測定A0,以VC為陽性對照[16]。每組實驗平行三次,生姜糖蛋白對DPPH·的清除率計算公式為:

1.2.7.2 還原能力測定 取不同濃度(3～8 mg/mL)的樣品液(冷凍干燥得到的糖蛋白粗品)1 mL,依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)、2.5 mL的K3Fe(CN)6(1%,w/v)溶液,在50 ℃水浴下反應20 min,加入0.5 mL的三氯乙酸(10%,w/v)搖勻,終止反應。反應終止后,取出2.5 mL加入2.5 mL水,再加入0.5 mL的FeCl3(0.1%,w/v)溶液,反應后于700 nm測定吸光度A[17]。每組實驗平行三次,本實驗以VC為陽性對照。

1.2.7.3 金屬離子螯合活性測定 取不同濃度(0.1～1.0 mg/mL)的樣品液(冷凍干燥得到的糖蛋白粗品)2 mL與0.05 mL FeCl2(2×10-3mol/L)混合后加入0.2 mL ferrozine(5×10-3mol/L),振蕩搖勻,在室溫下反應10 min,在562 nm處測吸光度A,同時以水為空白對照測定A0,陽性對照為EDTA[18]。每組實驗平行三次,生姜糖蛋白對Fe2+的清除率計算公式為:

1.2.8 凝集素芯片技術檢測生姜糖蛋白 將生姜糖蛋白樣品經(jīng)過cy3熒光標記,純化后與凝集素芯片孵育,得到糖蛋白中糖鏈組成[19]。

1.2.9 統(tǒng)計分析 采用Excel和SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理,實驗結果以均值±標準偏差(Mean±SD)表示。采用組間t檢驗,p<0.05具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 溫度對提取效果的影響 提取溫度對生姜糖蛋白的蛋白質及糖得率的影響如圖1所示,由圖1可知,提取溫度在40～70 ℃范圍內隨著溫度升高,蛋白質和糖的得率均在逐步升高。當溫度繼續(xù)升高時,蛋白質因變性得率降低,糖的得率基本處于穩(wěn)定水平。由此,生姜糖蛋白的提取在70 ℃的溫度下進行后續(xù)的單因素實驗。

圖1 溫度對提取效果的影響Fig.1 Effect of temperature on the yeild of protein and saccharide

2.1.2 時間對提取效果的影響 由圖2可以看出,提取時間在1.5～3 h增長過程中,蛋白質和糖的得率均在逐漸升高。當時間繼續(xù)增加時,蛋白質和糖得率的增加幅度降低,并對提取3、3.5和4 h得到的生姜糖蛋白中蛋白質和糖的得率進行分析發(fā)現(xiàn),蛋白質的得率于3 h達到最高,3.5 h后其得率均趨向于平穩(wěn),糖的得率于3.5 h達到最高并趨向于平穩(wěn)。相比糖而言,蛋白質對提取條件顯出更大的敏感性,由此應該最大可能的保證蛋白質的得率最大,同時考慮到經(jīng)濟因素,故確定提取時間為3 h。由此,生姜糖蛋白的提取在70 ℃,3 h條件下進行后續(xù)的單因素實驗。

圖2 時間對提取效果的影響Fig.2 Effect of time on the yeild of protein and saccharide

2.1.3 液固比對提取效果的影響 由圖3可以看出液固比在10∶1～30∶1增加時,由于溶劑量不同可以形成不同的濃度梯度,濃度梯度愈大,胞內物擴散動力也愈大,浸出物相應增多使蛋白質和糖的得率均在逐步升高。當液固比繼續(xù)增加時,蛋白質和糖的得率均趨于平緩,可能由于隨著液固比的增加,雜質擴散增多,從資源節(jié)約和后續(xù)樣品處理角度考慮,液固比不宜太大,故得出30∶1為最佳提取液固比。由此,生姜糖蛋白的提取在70 ℃,3 h和液固比為30∶1條件下進行后續(xù)的單因素實驗。

圖3 液固比對提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yeild of protein and saccharide

2.1.4 pH對提取效果的影響 pH的變化可以使蛋白質的帶電情況發(fā)生改變,直接影響到蛋白質之間,以及蛋白質與水之間的相互作用。圖4表明在不同pH條件下生姜糖蛋白的提取效果,結果表明在pH6.8之后蛋白質和糖的得率開始趨于平緩,并且pH在6.8、7.3、7.8、8.3四個條件下得到的蛋白質和糖的得率在α=0.05水平上差異不顯著,由此初步確定pH6.8為最佳提取參數(shù)。

圖4 pH對提取效果的影響Fig.4 Effect of pH on the yeild of protein and saccharide

2.2 提取回歸模型的建立

在單因素實驗基礎上進行了三元二次回歸正交組合設計及回歸系數(shù)的顯著性檢驗、回歸方程檢驗和失擬檢驗。

2.2.1 三元二次回歸正交組合設計 三元二次回歸正交組合設計的結果見表2。

表2 三元二次回歸正交組合實驗結果

2.2.2 生姜糖蛋白中蛋白質得率回歸模型 根據(jù)相關系數(shù)得到回歸方程:Y1=1.897+0.133X1+0.092X2+0.123X3+0.079X1X3-0.052X12-0.064X22-0.186X32

F0.01(5,11)=5.32,表明方程在0.01水平下顯著,即置信度為99%。Flf=(Slf/flf)/(Se/fe)=1.876

D1=-0.104<0;D2=0.013>0;D3=-0.005<0

由于D1<0,D2>0,D3<0,可以判定方程有極大值,利用求駐點方法求得當?shù)鞍踪|得率取得極值時,X1=1.82,X2=0.72,X3=0.72。通過回歸系數(shù)檢驗、回歸方程檢驗和失擬檢驗,可以認為該方程為最優(yōu)回歸方程。將中心化處理公式和因素編碼表代入方程中,通過計算當?shù)鞍踪|的得率取得最大值時對應各因素水平值分別為Z1=90、Z2=35.5,、Z3=7.5。即在提取溫度為90 ℃,液固比為35.5∶1,pH為7.5條件下提取3 h,蛋白質得率的理論值為2.096 mg/g。

2.2.3 生姜糖蛋白中糖得率回歸模型 根據(jù)相關系數(shù)得到回歸方程:Y2=73.522+3.211X1-3.610X2+7.02X3+3.595X2X3-1.095X12-3.330X22-5.574X32

在蛋白質得率的最優(yōu)條件下,即X1=1.82,X2=0.72,X3=0.72,糖得率的理論值為75.442 mg/g。

2.2.4 回歸模型的驗證實驗 按照模型所得到的最優(yōu)工藝條件進行驗證實驗,重復9次,得蛋白質得率為2.437 mg/g,糖得率為117.126 mg/g,可見所得的回歸方程預測的蛋白得率最優(yōu)值均略低于實際數(shù)值,回歸方程模型可提供生姜糖蛋白提取得率的變化趨勢,由此可作為生姜糖蛋白提取情況的參考。

2.3 生姜糖蛋白紅外光譜分析

生姜糖蛋白的紅外光譜分析見表3和圖5。由生姜糖蛋白紅外圖譜得知:生姜糖蛋白分別在3300、3100、1650、1300 cm-1附近有吸收峰,這些區(qū)域的吸收峰都是多糖和蛋白質的特征吸收峰。

表3 生姜糖蛋白的紅外光譜分析結果

其中,在3300 cm-1左右的吸收峰是O-H的伸縮振動,由于分子內羥基形成氫鍵而使吸收峰變寬;在3100 cm-1左右的吸收峰是糖的C-H伸縮振動引起的;在1650 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是C=O伸縮振動和N-H變角振動引起的;在1000～1022 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰表明糖蛋白分子中含吡喃環(huán);在890 cm-1處有特征吸收峰,表明其糖鏈與β-糖苷鏈相連[21]。

圖7 生姜糖蛋白的凝集素熒光強度Fig.7 Lectin fluorescence intensity of ginger glycoprotein

圖5 生姜糖蛋白紅外光譜掃描結果Fig.5 IR spectroscopy scanning of the ginger glycoprotein

2.4 生姜糖蛋白抗氧化活性

采用3種抗氧化活性評價方法(DPPH·自由基的清除能力、還原能力和金屬離子螯合能力)考察了生姜糖蛋白的體外抗氧化活性。其具體活力見圖6。由圖6可知,生姜糖蛋白對DPPH·自由基的清除能力較弱,且無明顯的劑量效應關系,其清除作用遠遠小于VC(其IC50值為5 μg/mL)。生姜糖蛋白具有螯合金屬離子的能力,其IC50值為1 mg/mL,而陽性對照EDTA的IC50值為4.8 μg/mL。根據(jù)以上實驗結果,表明生姜糖蛋白具有一定的抗氧化活性,進一步的純化可以提高其抗氧化活性。另外,本文對生姜糖蛋白還原能力進行了測定,8.0 mg/mL的生姜糖蛋白其吸光度值可達到0.63,而0.08 mg/mL的VC其吸光度值便可達到0.63。

圖6 生姜糖蛋白的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activities of ginger glycoprotein

2.5 凝集素芯片技術檢測生姜糖蛋白結果

經(jīng)凝集素芯片分析發(fā)現(xiàn)凝集素VVA、ConA、STL、LCA及LEL 有陽性結果,凝集素微陣列獲得的生姜糖蛋白的凝集素熒光強度見圖7,且熒光值 VVA>ConA>STL>LCA>LEL,表明生姜中的糖蛋白表面可能存在GlaNAc、mannose、GlcNAc、mannose和LacNAC這些糖鏈結構。

3 結論

本文以生姜為原料提取糖蛋白,得到在提取溫度為90 ℃,液固比為35.5∶1,pH為7.5條件下提取3 h,提取效果最好,所得的蛋白質得率為2.437 mg/g,糖得率為117.126 mg/g。經(jīng)紅外光譜分析可知,所提取的生姜糖蛋白為一種含有吡喃環(huán)的糖蛋白,其糖鏈是與β-糖苷鏈相連。DPPH·自由基的清除能力、還原能力和金屬離子螯合能力結果表明,生姜糖蛋白具有一定的抗氧化活性,其中金屬螯合能力IC50值為1 mg/mL。生姜中的糖蛋白表面可能存在GlaNAc、mannose、GlcNAc、mannose和LacNAC這些糖鏈結構。本文的研究對生姜和糖蛋白基礎性理論研究具有指導意義。

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Study the extraction and antioxidant activity of ginger glycoprotein

ZHAO Wen-zhu1,ZHANG Rui-xue1,YU Zhi-peng1,*,CHEN Yue-jiao1, ZHANG Hong-ling1,WANG Xin-ke1,LIU Jing-bo2,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Bohai University;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China; (2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

On the base of single factor experiment,the optimum extraction technology of ginger glycoprotein was performed by the quadratic regression orthogonal combination design,and the antioxidant activity of ginger glycoprotein was examined. The optimized condition of ginger glycoprotein was as follows:extraction temperature 90 ℃,liquid-solid ratio 35.5∶1 and extraction pH value 7.5. At the optimum conditions,the yield of protein reached 2.437 mg/g,and the yield of saccharide reached 117.126 mg/g. The typical characteristic absorption peaks of polysaccharide and protein were analyzed by the IR spectrum. The results of antioxidant tests and lectin microarray experiment demonstrated that the ginger glycoprotein has important physiological activities.

ginger;glycoprotein;orthogonal combination design;infrared spectrum;antioxidant activity;lectin

2016-05-24

趙文竹(1986-)，女，博士，講師，研究方向：植物活性成分研究，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。

*通訊作者:于志鵬(1984-)，男，博士，講師，研究方向：蛋白質及活性肽，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。 勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

國家自然科學基金項目(31601479)；渤海大學博士啟動項目(0515bs020)。

TS201

B

1002-0306(2016)22-0309-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.052