維生素C熒光光譜的機(jī)理研究

陳亞斌,何建國,馬天蘭,丁佳興,吳龍國,賀曉光,王松磊,劉貴珊

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

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維生素C熒光光譜的機(jī)理研究

陳亞斌,何建國*,馬天蘭,丁佳興,吳龍國,賀曉光,王松磊,劉貴珊

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

以VC標(biāo)品為研究對象,利用熒光分光光度計(jì)分別采集了280～350 nm激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜,結(jié)果表明:VC溶液的最大熒光峰位于EX310 nm/EM400 nm,VC光譜的二階導(dǎo)數(shù)有4個極值點(diǎn)和3個拐點(diǎn),分別為:328、345、355、372、395、425、525 nm。通過理論分析,證實(shí)395 nm是-OH發(fā)生的n→σ*電子躍遷,二烯醇結(jié)構(gòu)π→π*電子躍遷產(chǎn)生的熒光峰由于共軛體系的作用發(fā)生紅移而位于425、525 nm。分子中的各個熒光團(tuán)相互疊加且彼此制約,在分子團(tuán)簇作用和水分子的H鍵的共同作用下,最終使得VC溶液在400 nm有最大熒光峰。

維生素C,熒光光譜,熒光峰

隨著人們生活水平的提高,人們更加提倡合理的膳食結(jié)構(gòu)。VC是一種水溶性維生素易從體內(nèi)流失,但由于人體不能合成VC,因此合理的補(bǔ)充VC對人體健康至關(guān)重要。VC是一個具有5元環(huán)平面剛性的多-OH化合物,其分子的雙烯醇式-OH極易解離,釋放出H+而被氧化成脫氫VC,是供電子體可清除自由基[1]。當(dāng)VC缺乏時膠原蛋白的合成受阻,結(jié)締組織改變[2]。同時VC可改善鐵、鈣和葉酸的利用,預(yù)防動脈硬化,還與膝骨關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)[3]。但同樣VC也有危害,如果一次性攝入VC2.5～5.0 g以上的藥劑,可能致使紅細(xì)胞大量破裂而出現(xiàn)溶血等現(xiàn)象[4]?？梢娙绾螠?zhǔn)確的檢測出VC的含量對消費(fèi)者至關(guān)重要。

果蔬中VC常用的測量方法有2,6-二氯靛酚滴定法、2,4-二硝基苯肼分光光度法、紙色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法、熒光分光光度法等[5]。針對不同的方法許多學(xué)者進(jìn)行了研究,李天華等[6]用2,6-二氯靛酚滴定法結(jié)合近紅外實(shí)現(xiàn)了對番茄VC含量的預(yù)測。朱娜[7]采用HPLC法對果汁中VC的含量進(jìn)行測定。傅維等[8]采用熒光分光光度法測定了幾種市售水果中VC的含量,建立了回歸方程。龔時瓊等[9]用分子熒光光譜儀測定了西紅柿、青椒的VC含量,檢出限為0.03 μg/mL。一般的研究僅僅是針對其含量進(jìn)行定量分析建模,即使測定其熒光也僅僅考慮溶劑、pH、離子等熒光促滅效應(yīng),針對光譜的發(fā)射機(jī)理和熒光特性的研究卻很少。

本文以VC標(biāo)品為研究對象,利用日立F-7000熒光分光光度計(jì)測定不同激發(fā)波長下的VC的熒光光譜,并結(jié)合VC的化學(xué)結(jié)構(gòu)從理論上對VC熒光光譜的發(fā)射機(jī)理和熒光特性進(jìn)行研究,旨在解釋VC的熒光光譜機(jī)理,為VC的熒光檢測與評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VC標(biāo)品 純度為100%,中國食品藥品檢定研究院。

日立F-7000熒光分光光度計(jì) 日立高新技術(shù)公司;石英比色皿(12.4 mm×12.4 mm×45 mm) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 待測溶液 用超純水將VC稀釋成濃度為1 mg·mL-1的溶液。

1.2.2 熒光光譜的采集 使用日立F-7000熒光分光光度計(jì),用沒有熒光的石英比色皿裝待測溶液,并將其放在熒光池中心點(diǎn)上。激發(fā)狹縫(EX Slit)10.0 nm,發(fā)射狹縫(EM Slit)10.0 nm,光電倍增管負(fù)高壓(PMT Voltage)400 V,掃描速度(Scan speed)2400 nm/min。采用波長掃描方式,發(fā)射波長的采集范圍下限比原激發(fā)波長大20 nm,分別采集280～350 nm的不同激發(fā)波長(激發(fā)波長每隔5 nm測量一次)下VC水溶液和蒸餾水的熒光發(fā)射光譜,得到相應(yīng)的熒光譜圖。所有樣本測量均在常溫下完成(20～25 ℃)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光發(fā)射圖譜分析

熒光光譜是受激發(fā)電子從激發(fā)態(tài)以輻射的形式回到不同振動能級的基態(tài)時所發(fā)出的光[10]。激發(fā)光譜則是分子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的各個不同振動能級所吸收的光能量。由于熒光光譜中存在的一個普遍現(xiàn)象—斯托克斯位移[11],斯托克斯位移是指熒光光譜與相應(yīng)的吸收光譜相比出現(xiàn)的紅移現(xiàn)象,所以導(dǎo)致物質(zhì)的發(fā)射波長大于原激發(fā)波長。實(shí)驗(yàn)利用F-7000熒光分光光度計(jì)分別采集了280～350 nm的不同激發(fā)波長下的VC溶液和蒸餾水水的熒光發(fā)射光譜,結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 VC溶液的熒光發(fā)射光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of vitamin C solution

從圖1、圖2得到的數(shù)據(jù)來看,在熒光發(fā)射光譜中550 nm之后的峰值是原激發(fā)波2次衍射造成的，不是VC的熒光,所以550 nm之后的峰不在考慮的范圍之內(nèi)。圖1可以看出VC的熒光隨著激發(fā)波長的增加而發(fā)生不規(guī)則變化。激發(fā)波長從280～330 nm時,最大熒光峰出現(xiàn)在400 nm處一直不變。但當(dāng)激發(fā)波長為335 nm時熒光峰變?yōu)?70 nm處。在激發(fā)波長大于335 nm以后,最大熒光峰從370 nm向400 nm移動。激發(fā)波長為330～335 nm之間最大熒光峰有較大的位移。為了了解溶劑對溶質(zhì)熒光光譜的影響,測量了蒸餾水在不同激發(fā)波長下的熒光光譜。從圖2可以看出蒸餾水在280～350 nm不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜隨著激發(fā)波長的變化與VC溶液變化趨勢相同,在280～310 nm激發(fā)波長下最大熒光峰在335 nm處。當(dāng)激發(fā)波長為315～330 nm時,最大熒光峰從355 nm移動到370 nm,蒸餾水激發(fā)波長為310～315 nm之間最大熒光峰有較大的位移。

圖2 蒸餾水的熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of distilled water

VC水溶液發(fā)射光譜在激發(fā)波長330～335 nm之間最大熒光峰有較大的位移,而蒸餾水發(fā)射光譜在激發(fā)波長為310～315 nm之間最大熒光峰也有較大的位移,兩者峰位置不一致的原因在于VC水溶液中VC的-OH躍遷以及水分子團(tuán)簇和H鍵的作用下使得熒光出現(xiàn)了較大的紅移現(xiàn)象。VC水溶液的熒光在激發(fā)波長大于330 nm時最大熒光峰有較大的位移，這是由于激發(fā)波長大于330 nm時激發(fā)波的光子能量不足以使得VC結(jié)構(gòu)中的電子發(fā)生躍遷,溶液中的躍遷主要表現(xiàn)為水的熒光,所以最大熒光峰出現(xiàn)了較大的位移。

2.2 有機(jī)物分子中電子的存在形式

有機(jī)物電子以三種形式存在:形成單鍵的σ電子、形成雙鍵的π電子、未成鍵的n電子。基態(tài)時電子都處在各自最低能及軌道上,即σ成鍵軌道、π成鍵軌道上和n非成鍵軌道上。當(dāng)激發(fā)的光子能量適合、碰撞方式正確時,處于基態(tài)的電子吸收合適的能量后,就會躍遷到任意一個較高能級的反鍵軌道上。一個允許的躍遷不僅要考慮能量的因素,還需符合動量守恒、自旋動量守恒以及受軌道對稱性的制約。即使是允許的躍遷,它們的躍遷概率也是不相同的。躍遷的情況如圖3所示,躍遷時吸收能量的大小順序?yàn)?n→π*<π→π*

圖3 能級圖Fig.3 Energy level diagram

2.3 VC結(jié)構(gòu)與熒光的分析

VC的結(jié)構(gòu)式如圖所示,可以看出維生素C是由一個五元環(huán)構(gòu)成封閉的大的平面共軛體系結(jié)構(gòu),含有多個手性C原子,且平面結(jié)構(gòu)可以增大分子的吸光截面,增大摩爾吸光系數(shù),增強(qiáng)熒光強(qiáng)度,所以有利于熒光的產(chǎn)生[12]。同時VC具有給電子取代基-OH,由于-OH 上的n電子云幾乎與雙烯醇的π電子軌道平行,因此它們共享了共軛π電子軌道,形成了p-π共軛,擴(kuò)大了共軛體系,增強(qiáng)了VC的熒光特性[13]。VC的結(jié)構(gòu)由于-OH中的n電子吸收激發(fā)光光子,結(jié)構(gòu)容易發(fā)生n→σ*躍遷,其吸收峰值位置在近紫外區(qū)。熒光峰值在395 nm 處經(jīng)理論分析表明該熒光是由基團(tuán)C-OH 中的孤對電子產(chǎn)生的。VC中的二烯醇具有很強(qiáng)的還原性,容易發(fā)生n→σ*峰躍遷和π→π*的躍遷,再考慮到分子中的共軛結(jié)構(gòu)以及助色團(tuán),使得VC溶液的吸收峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象。

圖4 VC結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Structure of vitamin C

2.4 溶質(zhì)與溶劑之間的關(guān)系

為了探究溶質(zhì)與溶劑之間的關(guān)系,分別在同一激發(fā)波長下同時激發(fā)獲得VC溶液和蒸餾水的熒光光譜。從圖1、圖2可以看出,隨著激發(fā)波長的增加發(fā)射波長的熒光先增加后減小。VC水溶液的熒光在310 nm激發(fā)波長下出現(xiàn)最大熒光峰。溶液中分子的團(tuán)簇現(xiàn)象使得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜,因此推測VC分子和水分子混合發(fā)生團(tuán)簇形成新的結(jié)構(gòu)類型。由于VC中富含-OH結(jié)構(gòu),O原子與H原子共用一對電子,所以使得VC分子結(jié)構(gòu)容易吸引水分子與其形成團(tuán)簇分子結(jié)構(gòu),并且水中的分子會形成H鍵,H鍵與VC分子之間作用,從而增大了VC的平面鋼性結(jié)構(gòu)提高了VC水溶液的熒光量子效率。當(dāng)水溶液的濃度較低時,H鍵結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)結(jié)構(gòu),且共軛體系中π電子共軛度越大熒光強(qiáng)度越大,同時也伴隨著熒光峰紅移。如圖5為310 nm激勵波長下的蒸餾水的和VC的熒光光譜圖,水的熒光峰位置為370 nm,在VC中-OH電子的躍遷在395 nm處,分子團(tuán)簇作用和水分子的H鍵的共同作用下,使得VC水溶液在400 nm處有最大吸收峰[14]。

圖5 激發(fā)波長310 nm下VC水溶液與蒸餾水的熒光發(fā)射圖Fig.5 Fluorescence spectra of vitamin c solution and distilled water were measured with the excitation wavelength at 310 nm注:1為VC水溶液,2為蒸餾水。

2.5 VC溶液熒光光譜的二階導(dǎo)數(shù)

VC水溶液在310 nm激發(fā)波長下熒光強(qiáng)度最強(qiáng),經(jīng)過光譜理論分析,將最佳激發(fā)波長得到的熒光發(fā)射光譜求二階導(dǎo)數(shù)。二階導(dǎo)數(shù)函數(shù)中的極值點(diǎn)、拐點(diǎn)波長處可能與VC不同熒光團(tuán)發(fā)射的熒光相對應(yīng)[15]。本文采用在Origin 7.5軟件對熒光發(fā)射光譜求二階導(dǎo)數(shù),熒光的二階導(dǎo)數(shù)圖如圖6所示。

圖6 VC溶液的二階導(dǎo)數(shù)熒光光譜Fig.6 Second order derivation of fluorescence spectra of vitamin c

VC溶液的二階導(dǎo)數(shù)熒光光譜存在四個極小值點(diǎn),分別為345、355、372、425 nm,三個零點(diǎn)分別對應(yīng)原光譜的拐點(diǎn),分別為328、395、525 nm,因此這7個波段可能對應(yīng)與7種不同的熒光團(tuán)。雖然從圖5可以看出,VC溶液只有一個明顯的熒光峰,但這個熒光峰可能是這7個波段所對應(yīng)的熒光團(tuán)的共同作用相互影響的結(jié)果。由于熒光物質(zhì)具有加和性,345、372 nm處是水的熒光峰。物質(zhì)中的C=C、C=O等結(jié)構(gòu)上的π電子吸收光子產(chǎn)生π→π*的躍遷,通常單獨(dú)的雙鍵結(jié)構(gòu)如乙烯,其π→π*的躍遷發(fā)射光譜在170～200 nm,然而VC具有大的共軛結(jié)構(gòu),使得π→π*的躍遷的波長都發(fā)生了紅移。萘環(huán)的π電子發(fā)生π→π*躍遷的熒光峰為530、687、635 nm[16],所以推測425、525 nm的波長處是由于VC中的雙鍵上的躍遷引起的。由于不同的熒光團(tuán)對熒光發(fā)射光譜的作用程度各不相同,在生成熒光的過程中,各個熒光團(tuán)相互疊加且彼此制約,最終使得VC溶液的熒光發(fā)射光譜中只出現(xiàn)了一個明顯的熒光峰。

3 結(jié)論

系統(tǒng)研究了VC的熒光光譜,分別采集了280～350 nm的激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜,VC溶液的最大熒光峰位于EX310 nm/EM400 nm。為了研究水對VC溶液熒光的影響,同時采集了蒸餾水的熒光發(fā)射光譜。蒸餾水的最大熒光峰位于EX295 nm/EM370 nm。對VC溶液的熒光光譜求二階導(dǎo)數(shù),發(fā)現(xiàn)熒光光譜有4個極值點(diǎn)和3個拐點(diǎn),分別為328、345、355、372、395、425、525 nm。通過對熒光光譜的理論分析,認(rèn)為395 nm是由-OH發(fā)生的n→σ*的電子躍遷引起的、二烯醇結(jié)構(gòu)發(fā)生π→π*電子躍遷的熒光位于425、525 nm。由于不同的熒光團(tuán)對熒光發(fā)射光譜的作用程度各不相同,VC結(jié)構(gòu)中n→σ*躍遷和π→π*的躍遷在分子團(tuán)簇作用和水分子的H鍵的共同作用下,使得VC水溶液在400 nm處有最大熒光峰。

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Study on fluorescence spectra mechanism of vitamin C

CHEN Ya-bin,HE Jian-guo*,MA Tian-lan,DING Jia-xing,WU Long-guo, HE Xiao-guang,WANG Song-lei,LIU Gui-shan

(Ningxia University School of Agriculture,Yinchuan 750021,China)

Taken standard vitamin C for research objects,fluorescence emission spectra were measured with fluorescence spectrophotometer and the excitation wavelength were 280～350 nm. The results showed that the fluorescence excitation and emission wavelengths of the vitamin C solution were 310 nm and 400 nm. The second order derivation of fluorescence spectrum had four extreme points and three inflection points which were 328,345,355,372,395,425,525 nm.Based on the theory analysis,we come to the conclusion that the fluorescence peak at 395 nm was formed by-OH n→σ*-electron jumps. The dienes alcohols structure emitted a π→π*-electron jumps of maximum peak that were a little red shift at 425 nm and 525 nm. The reason was strong affected by conjugated system. Each of molecule fluorescent group were restricted and superimposed. The molecular clusters and H bond of water molecule made maximum fluorescence peak of vitamin C solution at 400 nm.

vitamin C;fluorescence spectrum;fluorescence peak

2016-05-27

陳亞斌(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品無損檢測，E-mail：shenyang12536@126.com。

*通訊作者:何建國(1960-)，男，教授，研究方向：農(nóng)業(yè)工程裝備及機(jī)電一體化技術(shù)、農(nóng)產(chǎn)品無損檢測，E-mail：hejg@nxu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560481)。

TS201

A

1002-0306(2016)22-0112-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.014