離子交換色譜法測定10種熱帶水果中的葡萄糖、蔗糖和果糖

于 璐,周光明,沈 潔,余艷麗

(發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室,西南大學化學化工學院,重慶 400715)

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離子交換色譜法測定10種熱帶水果中的葡萄糖、蔗糖和果糖

于 璐,周光明*,沈 潔,余艷麗

(發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室,西南大學化學化工學院,重慶 400715)

建立了高效陰離子交換-脈沖安培檢測(High performance anion exchange-pulsed amperometric detection,HPAE-PAD)測定火龍果、蓮霧、牛油果等10種熱帶水果中葡萄糖、蔗糖和果糖的檢測方法。熱帶水果中的多糖經(jīng)超聲萃取后,用METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)色譜柱進行分離,以30.0 mmol/L NaOH為流動相,等度洗脫,用安培檢測器檢測,18 min可完成對樣品多糖的分離和定量分析。經(jīng)測定,葡萄糖和蔗糖的檢出限分別為0.1209 μg/mL和0.2827 μg/mL,線性范圍為1.0～70.0 μg/mL;果糖的檢出限為0.5501 μg/mL,線性范圍為5.0～80.0 μg/mL。樣品溶液連續(xù)5次進樣,3種糖的相對標準偏差為0.67%～7.04%,平均回收率為78.70%～117.75%。該方法前處理簡單、選擇性好、靈敏度高,可用于熱帶水果中可溶性糖的測定。

離子交換色譜,脈沖安培檢測,熱帶水果,葡萄糖,蔗糖,果糖

近年來,我國熱帶水果進口逐年增加,消費需求日益加強[1],因此其營養(yǎng)成分也引起了人們的關注。熱帶水果營養(yǎng)豐富,富含糖類、有機酸、膳食纖維以及各種維生素[2-6]。其中糖類是熱帶水果中一類重要的有機化合物,主要是由葡萄糖、蔗糖和果糖組成。大量實驗表明,葡萄糖是生物體內(nèi)新陳代謝不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)和主要的熱量來源之一;蔗糖熱量高,攝取過量易導致蛀牙,引起人體肥胖和糖尿病;果糖的升糖指數(shù)(GI)低,故食用后引起蛀牙和糖尿病的幾率比葡萄糖或蔗糖等天然糖小,且易被機體吸收利用,適用于葡萄糖代謝及肝功能不全的患者補充能量[7]。因此,有必要建立測定熱帶水果中葡萄糖、蔗糖和果糖含量的方法。

有關于糖類的測定方法主要有比色法[8]、氣相色譜法[9]、高效毛細管電泳色譜法[10]以及高效液相色譜法[11-12]等。其中,比色法是一種傳統(tǒng)測糖的方法,它只能測定糖類總量,不能完成糖的分離,不具備選擇性[13]。氣相色譜法要求樣品易揮發(fā)且分析物熱穩(wěn)定性良好,高效毛細管電泳色譜法中所常用的紫外檢測器要求分析物對紫外光有較好的吸收,但大部分糖類沒有紫外吸收且不易揮發(fā),所以它們測定糖類事先均需衍生化處理,其操作繁瑣,給實際分析工作帶來較大的不便和誤差[14]。對于高效液相色譜法其常規(guī)的檢測器為紫外檢測器和示差折光檢測器,若采用示差折光檢測器雖無需衍生,但其靈敏度較低,易受溫度和流動相的影響,僅適用于常量樣品的分析。近年來,離子交換色譜-脈沖安培檢測法已普遍用于糖類化合物的測定[15-18],該方法可直接對糖類進行檢測,無需進行柱前衍生,且靈敏度高、檢測速度快、檢測結(jié)果準確[19-20],可用于熱帶水果中葡萄糖、蔗糖和果糖含量的測定。

目前對于北方常見水果中糖含量的測定已有很多報道,如王忠民[21]用比色法分析了葡萄中多糖的組成;呂明霞[22]等人用氣相色譜法對山楂、梨、蘋果、杏等水果中的單糖進行了分析測定,而用離子色譜法對熱帶水果中糖的分析測定尚未見報道。所以,本文采用離子交換色譜-脈沖安培檢測法同時完成了熱帶水果中葡萄糖、蔗糖和果糖的分離和含量分析,為熱帶水果經(jīng)濟價值的評價和指導消費者提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

NaOH、葡萄糖和蔗糖 分析純,重慶川東化學有限公司;D-果糖 生化試劑,成都市科龍化工試劑廠;超純水 電導率≥18.2 MΩ·cm;菠蘿、菠蘿蜜、火龍果、蓮霧、木瓜、芒果、牛油果、山竹、西番蓮和楊桃 均購買于當?shù)爻小?/p>

861 Advanced Compact IC型離子色譜儀、817型脈沖安培檢測器、METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱、化學抑制器、低脈沖串聯(lián)式雙活塞往復泵、雙通道蠕動泵、Metrohm IC-Net 2.3色譜工作站 瑞士萬通公司(Metrohm);FA2004A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司;CQ50超聲波清洗器 上海必能信超聲波有限公司;GM-0.33Ⅱ隔膜真空泵 天津市騰達過濾器件廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 分離柱:METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱;檢測器:四電位脈沖安培檢測器;再生液:200 mmol/L NaOH再生液;淋洗液:30 mmol/L NaOH溶液;流速:1.0 mL/min;柱溫:32 ℃;進樣量:20 μL。

1.2.2 色譜條件的選擇 分別配制5.0、10.0、20.0、30.0、50.0 mmol/L的NaOH溶液作為淋洗液,選擇最佳濃度。分別使用20、25、32、35 ℃的柱溫檢測樣品,選擇最佳柱溫。分別考察了流速為1.5、1.2、1.0、0.8 mL/min時對實驗的靈敏度、標準樣品的分離度以及出峰時間的影響,選擇最佳流速。

1.2.3 標準溶液的配制 精確稱取葡萄糖、蔗糖和D-果糖的標準樣品各0.1000 g,加入超純水溶解于燒杯中,再分別轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中并定容至刻度,得到質(zhì)量濃度為1000 μg/mL的標準溶液。最后用移液管從1000 μg/mL葡萄糖,蔗糖和果糖的標準溶液中分別吸取一定量的溶液至100 mL的容量瓶中,配制得到葡萄糖和蔗糖濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、70.0 μg/mL,果糖濃度為5.0、10.0、20.0、30.0、50.0、70.0、80.0 μg/mL的混合標準溶液,搖勻后用0.45 μm水系過濾膜過濾、待測。

1.2.4 樣品前處理 芒果洗凈去核,切碎,用陶瓷研缽研磨成均勻的漿糊狀。精確稱取0.1000 g,加入10.0 mL室溫下的超純水超聲(功率為100 W)萃取30 min。用布氏漏斗過濾,將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,搖勻后用0.45 μm水系過濾膜過濾、待測。

菠蘿、菠蘿蜜、火龍果、蓮霧、木瓜、牛油果、山竹、西番蓮和楊桃的前處理方法同芒果,由于牛油果中含糖量極少,所以其中牛油果的稱取量為2.0000 g。

1.2.5 樣品中多糖提取單因素實驗 稱取0.1000 g漿糊狀的芒果,加入一定量室溫下的超純水超聲萃取一定時間,按照1.2.3的方法處理,1.2.1中的條件測定,計算各單糖的提取率。各因素水平為:加水量0.1∶10、0.1∶20、0.1∶30、0.1∶40、0.1∶50和0.1∶60 g∶mL;萃取時間10、20、30、40、50和60 min。

提取率(%)=單糖的實驗測定值/樣品稱取量×100

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本實驗采用外標法對其峰面積定量,通過Excel作出峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)的線性回歸方程,根據(jù)方程計算出其測定值。每種樣品重復進樣5次,計算出各種單糖的平均測定值,相對標準偏差和平均含量。采用加標定性法對3種糖進行定性分析,并計算其加標回收率。

單糖的平均含量(%)=單糖的平均測定值/樣品稱取量×100

單糖的加標回收率(%)=(加標試樣測定值-平均測定值)/加標量×100

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中多糖提取單因素實驗

2.1.1 提取料液比的選擇 由圖1可知,料液比對葡萄糖、蔗糖和果糖的提取率的影響都很小,所以依據(jù)節(jié)約用料的原則選擇料液比為0.1∶10 g/mL。

圖1 料液比對3種糖提取率的影響Fig.1 Effect of liquid ratio on three kinds of sugar extraction rate

2.1.2 萃取時間的選擇 從圖2中可以看出,葡萄糖和蔗糖隨著萃取時間的增加,提取率變化不明顯,說明萃取時間對葡萄糖和蔗糖的影響較小。而果糖在不同萃取時間的提取率差異較大,當萃取時間大于30 min時,果糖的提取率稍有下降。實驗發(fā)現(xiàn)超聲時間越長,溶液中的雜質(zhì)越多,過濾的時間越長,故最終考慮選取30 min為萃取時間。

圖2 萃取時間對3種糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction timeon three kinds of sugar extraction rate

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 淋洗液的選擇 本實驗使用氫氧化鈉溶液作為流動相洗脫樣品(結(jié)果見圖3),其出峰順序為葡萄糖、蔗糖、果糖。實驗發(fā)現(xiàn)NaOH溶液濃度與保留時間呈反比,濃度越高,保留時間越短;濃度越低,保留時間越長。當NaOH溶液濃度高于10.0 mmol/L,低于30.0 mmol/L時,葡萄糖和蔗糖無法實現(xiàn)分離;而濃度高于30.0 mmol/L時,發(fā)現(xiàn)果糖峰與蔗糖峰嚴重重疊,無法分離。當NaOH溶液濃度為5.0 mmol/L和30.0 mmol/L時,三種糖的分離效果理想,但在NaOH溶液濃度為5.0 mmol/L時總分析時間需要35min,而當NaOH溶液濃度為30.0 mmol/L時,三種糖可在18 min以內(nèi)完成分離,所以本實驗最終確定淋洗液的濃度為30.0 mmol/L。

圖3 淋洗液濃度對實驗的影響Fig.3 Effect of the eluent concentration on experiment注:a. 5.0 mmol/L;b. 10.0 mmol/L;c. 20.0 mmol/L;d. 30.0 mmol/L;e. 50.0 mmol/L。

圖4 柱溫對實驗的影響Fig.4 Effect of the column temprature on experiment注:a. 35 ℃;b. 32 ℃;c. 25 ℃;d. 20 ℃。

2.2.2 色譜柱溫度和淋洗液流速的選擇 改變色譜柱溫度,觀察標準樣品的色譜峰發(fā)現(xiàn)(圖4):色譜柱的溫度對色譜峰的分離度的影響很大,當溫度降低,峰底隨之變寬,柱壓逐漸升高,而溫度的升高又使得色譜峰的分離度變差,故綜合考慮選擇柱溫為32 ℃。

流速的改變對實驗的靈敏度以及糖的分離度、出峰時間均有一定的影響(結(jié)果見圖5)。當流速增大,分析時間縮短,但柱壓增大,造成靈敏度下降及分離度降低;當流速減小,保留時間卻增加。因此最終選擇洗脫流速為1.0 mL/min最為適宜。

圖5 淋洗液流速對實驗的影響Fig.5 Effect of the eluent flow rate on experiment注:a. 0.8 mL/min;b. 1.0 mL/min;c. 1.2 mL/min;d. 1.5 mL/min。

2.3 標準曲線的繪制和檢出限的測定

分別測定1.2.2項條件下配制的混合標準溶液,繪制標準曲線。50 μg/mL葡萄糖、50 μg/mL蔗糖和70 μg/mL果糖混合標準溶液譜圖如圖6所示。本實驗采用外標法對峰面積定量,以3種糖的峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸,根據(jù)S/N=3計算儀器檢出限。結(jié)果如表1所示。

圖6 標準樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of three kinds of standard samples注:1.葡萄糖;2.蔗糖;3.果糖。

表1 線性方程,線性范圍與儀器檢出限

表2 重現(xiàn)性實驗和加標回收率結(jié)果

注:-表示未檢出。2.4 重現(xiàn)性實驗和加標回收率

按照1.2.3項中樣品處理方法處理樣品,在1.2項中優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)對樣品進行5次測定做重復性實驗,計算平均值和樣品測定值的相對標準偏差,測定結(jié)果如表2所示。

為了減小誤差,本實驗采用加標定性法對其進行定性分析。在測出本底值后,準確稱取0.1000 g菠蘿、菠蘿蜜、火龍果、蓮霧、木瓜、牛油果、山竹、西番蓮和楊桃,2.0000 g牛油果,分別向其中加入定量的標準物質(zhì),采用1.2.3項中樣品處理方法處理樣品,進樣測定,計算回收率如表2所示。

由表2可知,10種樣品測定值的相對標準偏差為0.67%～7.04%(n=5),平均回收率為78.70%～117.75%。其中火龍果、蓮霧和木瓜中均未檢測出蔗糖,查閱文獻[23-25]得知,火龍果與木瓜中幾乎不含蔗糖,而蓮霧中尚未檢測到蔗糖可能是由于它本身蔗糖含量較低,在經(jīng)過前處理后其樣品含量低于檢出限。

2.5 樣品測定結(jié)果及色譜圖

將處理好的樣品按照1.2項中的色譜條件進行色譜分析,其中火龍果和西番蓮的色譜圖見圖7～圖8。從譜圖中可以發(fā)現(xiàn),三種糖的分離效果好。

圖7 火龍果色譜圖Fig.7 Chromatogram of pitaya注:1.葡萄糖;3.果糖。

圖8 西番蓮色譜圖Fig.8 Chromatogram of passionflower注:1.葡萄糖;2.蔗糖;3.果糖。

表3 樣品測定結(jié)果

10種熱帶水果的測定結(jié)果如表3所示。由表3數(shù)據(jù)可知,幾種水果中牛油果總的含糖量(0.3183%)最低,菠蘿蜜總的含糖量(20.6337%)最高,山竹(14.2825%)、火龍果(10.3192%)以及芒果(13.3141%)的含糖量相對較多,其他幾種水果總糖含量差異不大,在3.2178%～7.2358%之間。其中葡萄糖含量最高的是火龍果(6.1115%),其次是菠蘿蜜(5.7832%),含量較低的是芒果(0.4993%)和牛油果(0.0752%),其含量低于1%,其他幾種水果中葡萄糖的含量在1.0676%～2.4664%之間;蔗糖含量較高的是山竹(8.2565%),菠蘿蜜(6.4321%)和芒果(5.9926%),而楊桃(0.5162%)和牛油果(0.0715%)的含量低于1%,火龍果、蓮霧和木瓜中的蔗糖含量由于低于儀器檢出限而未被檢測出;在10種熱帶水果中,除山竹和火龍果之外,果糖的含量在多糖總含量中所占的比例最高,尤其是菠蘿蜜(8.4184%)和芒果(6.8222%),其中菠蘿、蓮霧、木瓜、西番蓮以及楊桃的果糖含量在2.5336%～3.8465%之間,而果糖含量最低的是牛油果(0.1671%),但也遠高于牛油果中葡萄糖和蔗糖的含量,說明果糖是熱帶水果中可溶性多糖最重要的組成部分。

由此可見,患有肥胖癥和糖尿病等的特殊人群可以選擇牛油果、火龍果、蓮霧和木瓜等蔗糖含量少的水果食用,葡萄糖代謝和肝功能不全的患者可以選擇葡萄糖含量少,但勿選擇果糖含量較多的芒果食用,這樣人們不僅可以享受水果的風味,還不用擔心由于攝入過多而引起身體不適。

3 結(jié)論

本文采用超聲萃取10種熱帶水果中的葡萄糖、蔗糖和果糖,采用離子交換色譜-脈沖安培檢測法對葡萄糖、蔗糖和果糖的含量進行了分離和定量分析。該方法檢測成本低、靈敏度高、準確性好,為熱帶水果中葡萄糖、蔗糖和果糖的含量測定提供了一個快速、簡便的方法。經(jīng)測定,葡萄糖和蔗糖的檢出限分別為0.1209 μg/mL和0.2827 μg/mL,果糖的檢出限為0.5501 μg/mL;3種糖的相對標準偏差為0.67%～7.04%,平均回收率為78.70%～117.75%。實驗表明,在所測定的10種熱帶水果中葡萄糖(0.0752%～6.1115%)、蔗糖(0.0715%～8.2565%)和果糖(0.1671%～8.4184%)的含量豐富,且不同水果主要含糖量有所差異,為熱帶水果經(jīng)濟價值的評價和指導消費者提供了一定的參考。

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Determination of glucose,sucrose and fructose in 10 kinds of tropical fruits by ion chromatography

YU Lu,ZHOU Guang-ming*,SHEN Jie,YU Yan-li

(Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis,Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

A high performance anion exchange-pulsed amperometric detection chromatographic method was applied to determine glucose,sucrose and fructose in pitaya,wax apple,avocado and other 7 kinds of tropical fruits. After ultrasonic extraction,the polysaccharide in tropical fruits was separated by METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)anion exchange column and detected by pulsed amperometric detector. 30.0 mmol/L NaOH was used for isocratic elution. Analysis of the samples could be finished within 18 min. Detection limit of glucose and sucrose were 0.1209 μg/mL and 0.2827 μg/mL respectively. The linearity ranged from 1.0 μg/mL to 70.0 μg/mL. Detection limit of the fructose was 0.5501 μg/mL. The linearity range was 5.0～80.0 μg/mL. The RSDs of 3 polysaccharide contents for 5 consecutive determinations were between 0.67% and 7.04%,and the spike recoveries were between 78.70% and 117.75%. The method had the characteristics of simple pretreatment,good selectivity and high sensitivity,and it could be applied in the determination of soluble sugars in tropical fruits.

anion exchange chromatography;pulsed amperometric detection;tropical fruits;glucose;sucrose;fructose

2016-06-13

于璐(1993-)，女，碩士研究生，研究方向:離子色譜,E-mail:yulu444595301@qq.com。

*通訊作者:周光明(1964-)，男，博士，教授，研究方向：色譜及其聯(lián)用技術，E-mail:gmzhou@swu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(2127710)。

TS207.7

A

1002-0306(2016)22-0094-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.010