溶瘤病毒的腫瘤免疫治療研究進(jìn)展

涂艷陽，李 倩，張永生，成迎端，王 欣，楊宏偉

（第四軍醫(yī)大學(xué):1唐都醫(yī)院實驗外科，2唐都醫(yī)院，陜西西安710038；3賽福地，美國新澤西08902；4哈佛醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，美國波士頓02115）

溶瘤病毒的腫瘤免疫治療研究進(jìn)展

涂艷陽1，李 倩1，張永生2，成迎端3，王 欣4，楊宏偉4

（第四軍醫(yī)大學(xué):1唐都醫(yī)院實驗外科，2唐都醫(yī)院，陜西西安710038；3賽福地，美國新澤西08902；4哈佛醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，美國波士頓02115）

溶瘤病毒作為一種新的腫瘤治療制劑，通過病毒對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和誘導(dǎo)全身性抗腫瘤免疫反應(yīng)兩種作用機制引發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng).其具體的分子機制尚不明確，但可能由病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制增殖而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、與腫瘤細(xì)胞抗病毒元件的相互作用、促進(jìn)內(nèi)在自發(fā)的或適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)等多種作用因素參與.本文綜述了溶瘤病毒作為抗腫瘤治療劑的免疫治療原理、基因編輯提高溶瘤病毒的治療效力及其臨床應(yīng)用.

溶瘤病毒；腫瘤細(xì)胞；免疫治療

0 引言

溶瘤病毒是基于天然或基因工程改造的病毒，能夠特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞.溶瘤病毒的這一腫瘤選擇性復(fù)制特性距首次發(fā)現(xiàn)已有一個多世紀(jì).近年來溶瘤病毒在臨床試驗中顯示出良好的治療療效，使其再次成為一個研究熱點［1］.近期，一種經(jīng)工程改造的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）的1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）在晚期黑素瘤患者中完成了Ⅲ期臨床試驗并顯示出較好的持久反應(yīng)率［1］.該病毒由安進(jìn)公司（Amgen）命名為T-Vec，是首個獲美國FDA批準(zhǔn)用于腫瘤治療的溶瘤病毒免疫治療制劑.

病毒感染結(jié)果具有多樣性，這取決于病毒編碼基因的致病性、病毒與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用以及病毒復(fù)制或誘導(dǎo)潛伏感染的能力差異.與常規(guī)病毒疫苗不同的是，溶瘤病毒能夠在瘤灶原位直接感染，溶解腫瘤細(xì)胞.此外，溶瘤病毒不需借助腫瘤細(xì)胞死亡裂解釋放的特定腫瘤相關(guān)抗原而發(fā)揮作用，而且病毒能提供額外的“危險信號”促進(jìn)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng).溶瘤病毒通過兩種不同的途徑發(fā)揮抗腫瘤活性.其一，在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞直接溶解；其二，誘導(dǎo)全身性抗腫瘤免疫.這兩種抗腫瘤機制的比重與腫瘤細(xì)胞的類型、病毒的特性以及病毒與腫瘤微環(huán)境、宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用密切相關(guān).

溶瘤病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是一把雙刃劍.一方面，在病毒感染活躍期通過腫瘤抗原的呈遞病毒能夠促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)；另一方面，抗病毒中和效應(yīng)則會抑制病毒復(fù)制和感染腫瘤細(xì)胞，而最終的治療效果則是由這兩種反向作用來共同決定的.

許多病毒被納入溶瘤病毒免疫治療載體之列，已有大量研究旨在優(yōu)化這些病毒載體，例如減弱病毒致病性、增強免疫原性等［2］.迄今已有腺病毒（adenoviruses）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus）、脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus）、痘病毒（poxviruses）、柯薩奇病毒（coxsackie virus）、新城疫病毒（newcastle disease virus）、麻疹病毒（measles virus）、呼腸孤病毒（reovirus）等用于臨床試驗.目前兩種溶瘤病毒藥物T-Vec和H101已獲批上市.其中，H101是一種經(jīng)基因改造的溶瘤腺病毒，是中國首個批準(zhǔn)上市的腫瘤病毒治療制劑，其聯(lián)合化療用于鼻咽癌的治療［3］.

1 溶瘤病毒的免疫治療原理

溶瘤病毒介導(dǎo)腫瘤消退的具體機制尚未完全闡明，但大多數(shù)溶瘤病毒則是憑借其直接殺傷宿主腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)的.殺傷效力依賴于細(xì)胞靶向受體、病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)元件的效率［4］.溶瘤病毒的溶瘤能力也依賴于病毒的種類、劑量、病毒趨向性以及腫瘤細(xì)胞對不同細(xì)胞死亡方式（包括細(xì)胞凋亡、壞死、程序性細(xì)胞死亡、自噬）的易感性差異.

正常細(xì)胞中存在多種用于檢測、清除病毒顆粒的信號通路［5］.這些信號通路可被局部釋放的干擾素（IFN）、胞內(nèi)Toll樣受體（TLRs）刺激，后者可被病毒元件所激活［6］.TLRs是細(xì)胞表面和胞內(nèi)的識別受體，可與病原體相關(guān)分子（PAMPs）反應(yīng)激活，PAMPs在病原細(xì)菌、病毒中十分常見，包括病毒衣殼、DNA、RNA、病毒蛋白產(chǎn)物.TLR信號可以激活宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)和全身性天然免疫反應(yīng).一些參與溶瘤病毒清除的下游宿主細(xì)胞因子和受體主要包括TNF相關(guān)因子（TRAF）［7］、IFN調(diào)節(jié)因子（IRF）［8］和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I（retinoin acid inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）［9］.這些抗病毒機制加強了IFN的局部釋放，從而激活PKR活性.PKR可由病毒元件激活，激活后會終止細(xì)胞蛋白的合成、促進(jìn)細(xì)胞迅速死亡和病毒的清除.腫瘤細(xì)胞中上述信號通路則存在異常，因此病毒清除受阻［10］.不同種類的病毒會利用自身不同的異常信號通路來阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而為病毒爭取更多時間來完成病毒的生命周期.病毒在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制后，大部分溶瘤病毒會誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的發(fā)生，可以直接消除活的腫瘤細(xì)胞，也能啟動全身性免疫應(yīng)答.宿主免疫應(yīng)答由細(xì)胞死亡類型和病毒感染細(xì)胞所釋放的危險信號共同誘導(dǎo).

1.1 適應(yīng)性免疫應(yīng)答病毒的擴(kuò)增復(fù)制和病原性是機體免疫系統(tǒng)進(jìn)化的主要驅(qū)動因素，且病毒疫苗還能夠引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答.溶瘤病毒介導(dǎo)的免疫治療作用主要是通過激活或改變天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)以達(dá)到抗腫瘤的治療療效.病毒感染宿主后天然免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞、信號因子（細(xì)胞因子和炎癥趨化因子）均參與其中，二者之間的相互作用在抗腫瘤免疫治療的有效性上發(fā)揮著重要作用.溶瘤病毒感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致適應(yīng)性免疫應(yīng)答，反過來又會抵抗病毒的擴(kuò)散.因此，最初機體的免疫系統(tǒng)被視作溶瘤病毒治療中的一種負(fù)向作用，其原因包括:①原有的或治療誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)抑制病毒的感染和傳遞；②抗病毒天然免疫反應(yīng)抑制病毒的復(fù)制擴(kuò)增；③天然免疫細(xì)胞的浸潤限制了病毒的擴(kuò)散傳遞［11］.早期的研究利用缺乏適應(yīng)性免疫應(yīng)答的免疫缺陷小鼠的人類異種移植腫瘤模型，而目前應(yīng)用免疫功能正常小鼠的同源腫瘤模型進(jìn)行的研究表明，借助引發(fā)免疫反應(yīng)來實現(xiàn)抗腫瘤的治療效應(yīng)具有可行性和有效性［11］.多種溶瘤病毒可充當(dāng)病毒疫苗，在腫瘤灶局部引發(fā)強烈、持久性、特異性的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng).

溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞進(jìn)而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)和免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD），使得溶瘤病毒成為啟動抗腫瘤免疫應(yīng)答的一種有力誘導(dǎo)物［12-13］.其中一些細(xì)胞死亡方式具有免疫原性并釋放出諸如鈣網(wǎng)蛋白、ATP等危險相關(guān)分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMP）和腫瘤相關(guān)抗原（TAA）.研究［14］報道腫瘤細(xì)胞感染多種溶瘤病毒后均會發(fā)生ICD，而且應(yīng)用溶瘤腺病毒聯(lián)合替莫唑胺化療藥物治療的患者同樣有ICD發(fā)生，該病毒的治療特性使其與其他免疫治療方法可協(xié)同作用.但溶瘤病毒介導(dǎo)細(xì)胞死亡的機制和應(yīng)用該特性增強免疫原性仍有待于進(jìn)一步研究.慢性炎癥反應(yīng)也會促進(jìn)腫瘤形成、抑制T細(xì)胞的抗腫瘤活性［15］.因此，抑制抗病毒免疫反應(yīng)和促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答處于一種復(fù)雜的平衡關(guān)系中，其共同決定溶瘤病毒治療的最終療效.例如，在一些小鼠腫瘤模型中，溶瘤病毒呈低量級的復(fù)制或不擴(kuò)增，抗腫瘤效應(yīng)則主要依賴于溶瘤病毒所引發(fā)的免疫反應(yīng)［16］.

1.2 天然免疫反應(yīng)盡管適應(yīng)性免疫應(yīng)答是溶瘤病毒發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的主要方式，但在病毒注入機體的最初階段，宿主的固有免疫反應(yīng)能夠清除病毒、殺傷已感染病毒的細(xì)胞，使后續(xù)的由于病毒大量復(fù)制增殖、介導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)而引發(fā)的免疫反應(yīng)無法發(fā)生.溶瘤病毒注射給藥的部位也是宿主抗病毒反應(yīng)的一個重要決定因素.例如經(jīng)靜脈、動脈內(nèi)注射給藥途徑，溶瘤病毒會被體液防御系統(tǒng)中的循環(huán)補體、抗體快速識別、清除，并已被大量研究報道證實［17-19］.此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)和微環(huán)境中的防御性抗病毒反應(yīng)也會顯著抑制病毒復(fù)制數(shù)量級［20-24］.天然免疫細(xì)胞會對注入的溶瘤病毒做出迅速反應(yīng)，清除病毒和受病毒感染的腫瘤細(xì)胞［25-26］.利用組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物、抗病毒反應(yīng)抑制基因等均能夠抑制天然免疫反應(yīng)，從而增加溶瘤病毒的復(fù)制擴(kuò)增和細(xì)胞毒性效應(yīng)［27］.這種藥物在溶瘤病毒進(jìn)入機體的瞬間能夠暫時性地干擾機體的抗病毒反應(yīng)，確保溶瘤病毒大量復(fù)制增殖，發(fā)揮高效的溶瘤作用.當(dāng)藥物抵抗宿主天然免疫反應(yīng)的效力減弱時，已有大量病毒和腫瘤相關(guān)抗原得到釋放，可被機體抗病毒反應(yīng)所識別，引發(fā)繼發(fā)的長效性免疫效應(yīng)啟動腫瘤免疫.目前這種由溶瘤病毒引發(fā)的天然免疫調(diào)節(jié)的應(yīng)用仍需大量實驗證實.

1.3 腫瘤免疫逃逸的阻斷腫瘤細(xì)胞自身進(jìn)化出多種復(fù)雜的免疫逃逸機制.例如，腫瘤細(xì)胞和其腫瘤微環(huán)境表達(dá)具有免疫抑制功能的表面受體，能夠失活效應(yīng)性免疫細(xì)胞，并且分泌IL-10、TGFβ等細(xì)胞因子來募集免疫抑制細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位［28-31］.溶瘤病毒則能夠借助改變細(xì)胞因子環(huán)境和免疫細(xì)胞的種類等多種機制來逆轉(zhuǎn)這種免疫抑制微環(huán)境［32］.這些改變促進(jìn)了免疫介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的識別和清除、引發(fā)腫瘤相關(guān)抗原的擴(kuò)散［33-34］.腫瘤細(xì)胞的殺傷死亡導(dǎo)致新的腫瘤抗原的釋放，而這些抗原原先由于呈遞受阻而掩蔽于免疫系統(tǒng)中.

2 提高溶瘤病毒免疫療效

利用基因工程改造將外源治療性轉(zhuǎn)基因插入溶瘤病毒基因組中，使其兼具治療基因局部高表達(dá)和溶瘤活性的功能.基因表達(dá)于腫瘤部位可避免由全身用藥所引起的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)毒性.GM-CSF是目前臨床上應(yīng)用最多的細(xì)胞因子，已被整合入多種溶瘤病毒的基因組中，在臨床前研究中顯示了一定程度的治療效力［33，35-36］.此外，其他細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、可溶性CD80、CCL3等也已被用于腫瘤病毒治療研究中［37］.腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子和趨化因子能夠打破免疫細(xì)胞的抑制狀態(tài)產(chǎn)生治療性免疫反應(yīng).IL-12是一種有效的抗腫瘤細(xì)胞因子，具有抗血管生成活性.在具免疫功能的腫瘤干細(xì)胞模型中，HSV表達(dá)IL-12減少了新生血管的形成和腫瘤調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），引發(fā)了T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［38］.表達(dá)CXCR4拮抗物的牛痘病毒（vaccinia virus，VV）減少了腫瘤脈管系統(tǒng)的數(shù)量以及骨髓來源上皮和髓樣細(xì)胞的累積，誘導(dǎo)發(fā)生抗腫瘤體液免疫應(yīng)答［39］.

多種免疫調(diào)節(jié)劑用于抵抗抗病毒反應(yīng)和促進(jìn)溶瘤病毒的擴(kuò)增、傳播.環(huán)磷酰胺能夠通過抑制天然免疫細(xì)胞、抗體反應(yīng)、減少Treg細(xì)胞和增強CTL的抗腫瘤活性來增加溶瘤病毒的復(fù)制和抑制腫瘤生長［26，40］.另外，溶瘤病毒治療還可與化療聯(lián)合應(yīng)用，能誘導(dǎo)ICD、增強腫瘤細(xì)胞抗原性或?qū)γ庖呒?xì)胞的易感性、抑制具有負(fù)調(diào)控的Treg細(xì)胞和髓樣來源的抑制細(xì)胞（MDSC）［41］.

3 臨床治療應(yīng)用

許多溶瘤病毒免疫治療已應(yīng)用于臨床試驗中，但絕大部分仍處于Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗階段.目前有報道表達(dá)GM-CSF的HSV-1（T-Vec）已進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗，其適應(yīng)癥是黑素瘤［1］.受試者隨機分組接受T-Vec或GM-CSF的瘤內(nèi)注射治療.初步報告顯示，T-Vec治療組的持久反應(yīng)率達(dá)到16%，而GM-CSF治療組的持久反應(yīng)率僅為2%；在總反應(yīng)率上，T-Vec治療組為26%，也明顯高于GM-CSF治療組的6%.兩組的中期分析同樣顯示T-Vec治療組具有更好的總生存率.

表達(dá)GM-CSF的牛痘病毒（JX-594）在肝癌患者中已完成Ⅱ期臨床試驗［42］.低劑量和高劑量的JX-594均采用血管內(nèi)給藥途徑注入肝腫瘤中，發(fā)現(xiàn)病毒注射部位和遠(yuǎn)端腫瘤部位在這兩種病毒劑量下均呈現(xiàn)出相同的反應(yīng)率和肝病控制程度，表明其抗腫瘤效應(yīng)歸功于免疫反應(yīng).研究發(fā)現(xiàn)JX-594抗腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)生于JX-594病毒復(fù)制和GM-CSF表達(dá)之后.

溶瘤呼腸孤病毒也完成了Ⅱ期臨床試驗，用于轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的治療，給藥方式是靜脈注射［43］.盡管在21例患者中均未見客觀性治療反應(yīng)，但在具有評估價值的13例患者的活檢組織中，發(fā)現(xiàn)2例患者的免疫組化結(jié)果顯示病毒在腫瘤中進(jìn)行了有效的大量復(fù)制，并且這些患者體內(nèi)的中和抗體滴度也明顯升高.研究人員推測，該治療無效的原因可能與抗病毒的中和抗體滴度迅速增高有關(guān).

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R730.5

A

2095-6894（2017）01-20-04

2016-12-09；接受日期：2016-12-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（81572983，81272419）

涂艷陽.副主任醫(yī)師，副教授.Tel:029-84777469 E-mail: tufmmu＠188.com

張永生.教授，主任醫(yī)師，院長.Tel:029-84777001 E-mail: zhangys_td＠163.com