免疫避孕疫苗的研究進(jìn)展

樊姝彤 尤新國 滿 怡 綜述 潘智芳 馮衛(wèi)國 審校

濰坊醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室（山東濰坊 261053）

免疫避孕疫苗的研究進(jìn)展

樊姝彤 尤新國 滿 怡 綜述 潘智芳 馮衛(wèi)國 審校

濰坊醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室（山東濰坊 261053）

世界人口的高增長率和非意愿妊娠的高發(fā)生率一直影響著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類身體健康。傳統(tǒng)的避孕方法（輸精管結(jié)扎、激素類避孕藥以及避孕套等）都存在一定的局限性[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，輸精管結(jié)扎術(shù)后中遠(yuǎn)期會出現(xiàn)附睪淤積增厚的超聲表現(xiàn)[2]。因此，尋找一種安全、方便、有效、可逆的避孕措施對控制人口增長和避免非意愿性妊娠具有十分重要的意義。免疫性避孕的基本原理是選擇與生殖過程相關(guān)的關(guān)鍵抗原，刪除其抑制性表位、自身抗原交叉反應(yīng)表位等一些非優(yōu)勢抗原表位，添加促使機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答的T細(xì)胞表位，再與相應(yīng)的載體相偶聯(lián)，最終制成避孕疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的體液免疫或細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而達(dá)到阻止受孕的目的[3]。本文對抗精子疫苗、抗卵透明帶疫苗和抗生殖激素疫苗作一綜述。

一、抗精子抗原避孕疫苗

現(xiàn)已證明，精子膜表面攜帶大量的自身和同族抗原，為了避免與其他組織發(fā)生交叉反應(yīng)，抗精子疫苗的研究重點(diǎn)不僅是要尋找精子膜表面的特異性表達(dá)蛋白，而且還要避免交叉反應(yīng)產(chǎn)生的自身免疫病。目前已經(jīng)鑒定了幾種抗原，并且已經(jīng)克隆并測序了編碼這些抗原的互補(bǔ)DNA（c DNA）。其中值得注意的有：受精抗原FA-1（fertilization antigen-1），一種精子特異性糖蛋白,與男性和女性的免疫性不孕均相關(guān)；PH-20（yaluronidase），一種透明質(zhì)酸酶誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體和識別透明帶的受體[4]；PH-30（fertilin），普遍認(rèn)為PH-30和頂體反應(yīng)過程中卵子卵透明帶密切相關(guān)以及精子蛋白（SP-10），SP-17（sperm protein 17），睪丸特異性抗原-1，蛋白A激酶錨定蛋白（AKAP）和乳酸脫氫酶C4同工酶LDH-C4（LDH-C4）等。其中LDH-C 4是第1個被推薦進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)的精子抗原。有研究發(fā)現(xiàn)，雌性動物與其中一些抗原（FA-1，PH-20和SP-17）的主動免疫已顯示降低體內(nèi)生育力。最近，在一項(xiàng)研究中，用附睪蛋白（Eppin）免疫雄性猴，78%的猴子對Eppin產(chǎn)生高抗體滴度，導(dǎo)致不育，隨著抗體滴度的降低，其中有71%的雄性猴在免疫后恢復(fù)生育力[5]。基于以上實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)，有學(xué)者推測，即使篩選出最佳精子抗原，是否一定可以被自然產(chǎn)生的精子凝集抗體所識別，目前還難以做出結(jié)論。

二、抗卵透明帶（ZP）疫苗

卵透明帶（zona pellucida，ZP）是圍繞哺乳動物卵母細(xì)胞及著床前受精卵外的一層半透明的酸性糖蛋白膜，具有一種特異的精子受體，其作用為調(diào)節(jié)特異的精卵結(jié)合、誘導(dǎo)獲能精子發(fā)生頂體反應(yīng)并阻止多精受精。人類的ZP含有4種主要糖蛋白：ZP1、ZP2、ZP3和ZP4[6]，其中ZP3是精子的第一級受體，有精子受體活性, 起始精卵結(jié)合和頂體反應(yīng)，在免疫研究中較重要[7]。ZP疫苗的作用機(jī)制是抑制受精過程，以ZP為抗原免疫多種實(shí)驗(yàn)動物都可以達(dá)到免疫避孕的效果[8]。實(shí)驗(yàn)表明[9]，抗ZP3抗體與ZP3結(jié)合后，一方面，抗體占據(jù)了ZP3上的精子結(jié)合位點(diǎn)，使精子不能與ZP3結(jié)合而發(fā)生頂體反應(yīng),從而導(dǎo)致受精失敗。另一方面，抗原（ZP3）-抗體復(fù)合物還阻斷了卵母細(xì)胞與其周圍顆粒細(xì)胞之間的信號聯(lián)系,導(dǎo)致初級卵泡的閉鎖、退化。當(dāng)用同源或異源ZP3蛋白免疫動物后，可以激起被免疫動物高滴度的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的血清抗體IgG可以與自身ZP3結(jié)合。當(dāng)抗ZP3抗體水平增多時，動物不孕；若抗體水平下降到正常水平，動物的生育力得到恢復(fù)。抗ZP疫苗可分為以下幾類：

（一）天然來源的ZP3免疫不孕疫苗

早期ZP3免疫避孕的研究中，人們用天然ZP蛋白直接免疫動物。由于天然來源的豬 ZP糖蛋白3（pZP3）很容易得到，且與多種物種的 ZP 糖蛋白具有交叉免疫反應(yīng)，故將pZP3作為首選的天然 ZP 糖蛋白，直接免疫動物觀察其避孕效果。用pZP3主動免疫猴，其體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的抗pZP抗體與猴自身ZP結(jié)合，被免疫猴在一段時間內(nèi)可以保持不孕。在用天然ZP蛋白直接免疫達(dá)到避孕目的的同時，被免疫動物出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的卵巢炎，表現(xiàn)為卵巢功能紊亂，原始卵泡衰竭，排卵周期、激素水平和卵泡發(fā)育均發(fā)生了短暫的變化。產(chǎn)生這種副作用的機(jī)制尚不明確，推測的可能原因是當(dāng)用同源性較大的ZP3免疫時，在免疫原上存在著一些表位，被抗原提呈細(xì)胞提呈后，引起的 T細(xì)胞免疫從而發(fā)生自身免疫反應(yīng)造成卵巢炎[10]。鑒于pZP有50%～70% 的避孕效果，迄今為止，pZP已成功抑制了80種野生哺乳動物的生育力[11]。由于pZP會誘發(fā)嚴(yán)重的卵巢炎，因此其并不適用于人類臨床實(shí)際。

（二） 重組ZP蛋白免疫不孕疫苗

ZP在免疫中存在的問題是：ZP疫苗在避孕的同時往往會引起卵巢自體免疫性損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞引起卵巢炎和卵巢功能障礙[12]，是由于完整ZP抗原既有T細(xì)胞抗原決定簇，又有B細(xì)胞抗原決定簇。為避免這種損傷，免疫原應(yīng)僅具有選擇性B細(xì)胞抗原決定簇而缺乏T細(xì)胞抗原決定簇。但是，為了激起抗體反應(yīng)，T細(xì)胞表位又是必需的。通過基因工程獲取重組ZP蛋白成為時下必然的發(fā)展趨勢，研究者們將篩選出來的含有B細(xì)胞表位的ZP3多肽與其他親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的含T細(xì)胞表位的蛋白相連，構(gòu)建成嵌合多肽用于免疫動物，達(dá)到了降低生育力和減少副作用的目的。應(yīng)用能與B細(xì)胞抗原決定簇發(fā)生特異反應(yīng)的單克隆抗體（單抗）來選擇ZP蛋白的合成肽片段。Lou[13]將ZP3中第336位密碼子TTC（苯丙氨酸）替換為GCT（丙氨酸），可使B6AF1小鼠不再發(fā)生自身免疫卵巢炎。陳享等[14]用此ZP3作為抗原，與外源輔助性T細(xì)胞表位牛核糖核酸酶T細(xì)胞抗原（BRNT94-104）相偶聯(lián)，誘導(dǎo)了B細(xì)胞免疫應(yīng)答，避孕率達(dá)到了60% 。以中國倉鼠卵巢（CHO：Chinese Hamster Ovarian）細(xì)胞中表達(dá)的重組人ZP1、ZP2 和 ZP3 蛋白免疫獼猴和狒狒，均達(dá)到了很好的免疫不育效果且不引起卵巢病變[15]。近年，有研究發(fā)現(xiàn)[16]，用大腸桿菌表達(dá)的無標(biāo)記重組融合蛋白（TT-KK-ZP3）， 在近交系FVB/J雌性小鼠中產(chǎn)生高抗體滴度，與空白對照組相比，免疫的小鼠顯示出顯著的低生育力。以上都說明重組的 ZP 糖蛋白具有很好的免疫原性，但同種ZP抗原免疫，有可能導(dǎo)致嚴(yán)重的卵巢炎。目前雖然重組ZP疫苗已有大量的動物實(shí)驗(yàn)研究, 但尚無人體實(shí)驗(yàn)的報道。

（三） ZP合成肽免疫不孕疫苗

研究證明存在于zona蛋白質(zhì)中的“致卵成分”的T細(xì)胞表位可能是ZP抗原免疫后觀察到的卵巢功能障礙的原因[17]。近年來，為了避免ZP3蛋白作為免疫原時引起自身免疫疾病，研究者們推測，通過尋找和保留免疫原（ZP3）上的B細(xì)胞表位，除去引起不良反應(yīng)的T細(xì)胞表位，就可以避免副作用的發(fā)生。但是，為了激起抗體反應(yīng)，T細(xì)胞表位又是必需的。因此，人們將“混雜”T細(xì)胞表位組成的嵌合肽免疫的牛RNase與小鼠ZP3（335-342aa；被Ala取代的Phe 336）的最小B細(xì)胞表位共線性合成，從而導(dǎo)致生殖力的削減而沒有卵巢功能障礙[18]。用白尾鹿ZP1肽（79-130aa）[19]和野生小鼠ZP3肽（328-342aa）[20]免疫也導(dǎo)致生育力的顯著降低。有研究發(fā)現(xiàn)以ZP3（334 -343aa）和ZP4（251-273aa） 單獨(dú)的合成肽或兩者融和的合成肽分別免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可識別天然 ZP，免疫血清可明顯抑制熒光標(biāo)記的 ZP3與獲能精子的結(jié)合[21]。這些研究證實(shí), 基于 ZP的合成肽疫苗能激發(fā)具有生物活性的抗體。然而，能用于人群切實(shí)可行的避孕疫苗還需要進(jìn)一步研究。

（四）病毒載體ZP蛋白

近年來，有研究者用含T細(xì)胞表位的外源病毒載體來免疫動物，以產(chǎn)生抗卵ZP的免疫反應(yīng)。Choudhury等[22]以單獨(dú)表達(dá) ZP3 和精子特異性抗原 YLP12 的，或表達(dá)兩者融合蛋白的花葉病毒（mosaicvirus）來免疫雌鼠，均誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體，并導(dǎo)致其生育率下降。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[23]，mstZP3[301～320aa]與破傷風(fēng)毒素蛋白嵌合多肽可以抑制人類精卵結(jié)合，抑制率可達(dá)60%，卵巢功能未見異常。Smith等[24]將含鼠 ZP3 的鼠源巨細(xì)胞重組病毒（MCMV-m ZP3）接種兔子，誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的mZP3 特異性抗體，但該特異性抗體與兔 ZP3 無交叉免疫反應(yīng)。以上均說明用病毒載體制備免疫避孕疫苗有著廣闊的應(yīng)用前景。

如上所述，抗卵透明帶疫苗的共同問題是卵透明帶抗原免疫引起的卵巢功能紊亂。有研究者普遍認(rèn)為黏膜免疫是克服卵透明帶抗原免疫引起卵巢功能紊亂的一種有效方法。董志煒等[25]成功制備pVAX1-pZP3α殼聚糖納米微粒，小鼠口服此類疫苗能誘發(fā)生殖道黏膜免疫,產(chǎn)生抗生育效應(yīng),對卵巢組織結(jié)構(gòu)沒有影響。有研究組[26]發(fā)現(xiàn)人B細(xì)胞表位的最小模體可以避免 ZP3 特異的卵巢源性 T 細(xì)胞抗原表位。因此，設(shè)計抗 ZP 疫苗的靶抗原時，將ZP上T細(xì)胞和 B細(xì)胞的抗原表位分開, 用含B細(xì)胞抗原表位為免疫原,可以有效提高疫苗的安全性, 避免引發(fā)卵巢炎。

三、抗生殖激素疫苗

避孕疫苗的生殖激素抗原主要有：GnRH、LH及hCG 等，以此為靶抗原研制成的疫苗顯示了不同程度的避孕效果。

（一）抗LHRH /GnRH疫苗

十肽黃體生成素釋放激素（LHRH）具有一些獨(dú)特的特征，它存在于男性以及女性中，因此針對LHRH的疫苗可用于兩性。雄性動物中，LH結(jié)合LHR作用于睪丸的間質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)其分泌雄性激素[27]，對睪酮的分泌和精子的形成具有重要的調(diào)控作用。Dunshea等[28]發(fā)現(xiàn)，青春期和青春期后期的公羊和公豬在其脂肪組織中積累雄激素、雄激素衍生物和代謝廢物，這給肉類帶來不愉快的氣味。用抗LHRH疫苗進(jìn)行免疫可以減少睪丸激素，消除污點(diǎn)，從而提高肉質(zhì)。而被免疫的動物也比對照組生長得更快[29]。Suresh等[30]用羊LH疫苗免疫冠毛獼猴，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的抗體能有效結(jié)合LH，睪酮濃度降低，精子細(xì)胞的生成受抑制，細(xì)胞數(shù)減少，最終導(dǎo)致無精子癥的結(jié)果，提示LH疫苗也有一定的精子抑制作用。而近期有研究者發(fā)現(xiàn)LH免疫后與其他垂體激素發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生了抗體滴度低、生殖器官萎縮和性功能下降或喪失等副作用，所以沒有再進(jìn)一步研究[31]。

GnRH是一種由下丘腦合成及分泌的10肽，刺激垂體分泌促卵泡激素（FSH）和黃體生成素（LH），起著調(diào)節(jié)促性腺激素釋放的功能。普遍認(rèn)為，GnRH疫苗具有相對更廣泛的抗生育能力。目前GnRH疫苗主要應(yīng)用于動物模型，而人類GnRH疫苗則主要應(yīng)用于性激素依賴性疾病[32]，例如在前列腺癌的治療中。研究發(fā)現(xiàn)，用GnRH疫苗免疫成年雌、雄性白尾鹿均能產(chǎn)生長期（2年）的避孕效果，雄鹿喪失性欲，雌鹿的妊娠率降低了88%[33]。雖然抗GnRH 疫苗的避孕效果可靠，但其靶器官較多，如卵巢、睪丸、胎盤、前列腺等其作用復(fù)雜，最終可能導(dǎo)致不育[34]。但是由于抗體中和GnRH而導(dǎo)致其生物活性無法表達(dá)，性激素水平降低，導(dǎo)致性無能和生殖器官功能受到傷害等，使GnRH疫苗無法適應(yīng)于人類。

（二）人絨毛膜促性腺激素（hCG）疫苗

hCG疫苗是第一個也是唯一一個成功通過Ⅱ期臨床試驗(yàn)的避孕疫苗，已證明可以保護(hù)性活躍婦女不會懷孕[35]。這種疫苗的獨(dú)特之處在于它是針對hCG制成的分子，只有在健康女性懷孕期間才能發(fā)揮作用。目前h CG主要以全β亞基和以羧基末端肽（hCGβ-CTP）為免疫原來研制避孕疫苗。

1. 以β-hCG亞單位為抗原的避孕疫苗：Charrel-Dennis等[36]使用完整的 β-hCG為抗原肽研制出基因水平表達(dá)的 hCG 突變型 GA68 疫苗（即谷氨酸替換第68位的精氨酸），避免了與hLH的交叉。為了增強(qiáng)β-h CG的免疫原性，研究者們將其與破傷風(fēng)類毒素（TT）相偶聯(lián)，對以β-hCG-TT為免疫原的避孕疫苗進(jìn)行了研究，肯定了此類疫苗的抗生育能力且無明顯的毒副作用。最新成果是構(gòu)建了β-hCG-LTB重組融合蛋白, 該蛋白有效地提高了各種屬鼠的抗體滴度, 克服了抗體應(yīng)答的個體差異[37]。

2. 以β-hCG羧基端37肽為抗原的避孕疫苗：β-hCG-CTP 疫苗去除了 hCG 分子中與 TSH 、FSH及LH有高度同源性的 α 亞單位，在 hCG 的 β 亞單位上去除了與 LH 的 β 亞單位相似的結(jié)構(gòu)部分，成為 hCG 所獨(dú)有的特異抗原肽。有研究者采用β-hCGCTP作為hCG的特異性抗原，選擇白喉類毒素（DT）作載體，MDP-1作佐劑，制成hCGβ-CTP-DT避孕疫苗進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗(yàn)，能產(chǎn)生很高的抗體滴度，但是沒能表明此疫苗具有避孕效果。在世界衛(wèi)生組織人類生殖研究發(fā)展和培訓(xùn)規(guī)劃署利用β-h CG-CTP為免疫原的實(shí)驗(yàn)中[38]，因在受試者身體出現(xiàn)極強(qiáng)的組織反應(yīng)而宣告終止。

3. β-hCG的異種二聚體（HSD）避孕疫苗：prhCGβ-TT和hCGβ-CTP-DT疫苗免疫原性比較弱，體內(nèi)產(chǎn)生的抗體滴度低，持續(xù)時間較短，個體間免疫效果差異大，少數(shù)婦女出現(xiàn)卵巢功能損傷等現(xiàn)象[39]。Talwar實(shí)驗(yàn)室為了改進(jìn)hCG疫苗，將hCGβ與羊LH的α亞單位（α-o LH）結(jié)合形成異種二聚體制成HSDTT/DT疫苗，其免疫原性強(qiáng)于pr-hCGβ-TT和hCG β-CTP-DT/TT[40]。在完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)后，Talwar在1994年進(jìn)行了Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，抗hCG抗體滴度大于50 ng/m L時則避孕，小于35 ng/mL時則受孕，但這種避孕疫苗需連續(xù)接種3次才能達(dá)到預(yù)期半年的避孕效果[41]。

（三） FSH和FSH受體（FSHR）疫苗

卵泡刺激素（FSH）是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的分子量約為33000kD的一種糖蛋白激素。在男性FSH與FSH受體（FSHR）結(jié)合后與雄激素的共同作用，促使睪丸支持細(xì)胞合成和分泌雄激素結(jié)合蛋白等物質(zhì)，促進(jìn)精子形成[42]?？笷SH特異性抗體是通過消除內(nèi)源性FSH的生物學(xué)活性而影響精子發(fā)生，不影響LH的合成與分泌，因此睪酮合成不受影響。FSH與促甲狀腺激素（TSH）和黃體生成素（LH）具有相同的α亞基，僅β亞基表現(xiàn)出各自的特異性。向延芳等[27]應(yīng)用部分重疊PCR技術(shù)將FSH-β和Occludin相偶聯(lián)，通過特異性靶向干擾睪丸內(nèi)Sertoli細(xì)胞間緊密連接（TJs）蛋白的生物活性,特異性抑制或干擾精子發(fā)生和射精，達(dá)到可逆性避孕目的。然而有研究發(fā)現(xiàn)，在雄性動物實(shí)驗(yàn)中，用FSH或FSHR疫苗免疫非人靈長類動物，僅僅能導(dǎo)致精子減少，不能完全阻斷精子產(chǎn)生[43]。

四 、展望

理想的避孕疫苗具有強(qiáng)免疫原性，可以不使用任何有潛在毒性的佐劑（如弗氏佐劑）就可以產(chǎn)生高抗體滴度，而且單次免疫就可以達(dá)到較好的避孕效果，維持時間長，具有可逆性。目前仍然沒有一種適應(yīng)于人類的免疫避孕疫苗。隨著免疫學(xué)和DNA重組技術(shù)的快速發(fā)展，以及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展和基因敲除技術(shù)的普及，免疫避孕疫苗的研究難點(diǎn)必將會被逐一解決，為避孕疫苗帶來更廣闊的發(fā)展空間。

致謝：本課題受山東省科技發(fā)展計劃（2015GSF 118178）；山東省衛(wèi)計委科技項(xiàng)目（201411）資助

疫苗, 避孕 ; 生殖系統(tǒng)

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（2016-12-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.016

R 169.41