血小板中NADPH氧化酶的研究進展

羅冬嬌 傅圓圓 黃靈芳

血小板中NADPH氧化酶的研究進展

羅冬嬌 傅圓圓 黃靈芳

血小板異?；罨瘜е碌牟±硇匝ㄐ纬珊退ㄈ切哪X血管疾病發(fā)生的主要原因。氧化應激是重要的活化機制之一，調控還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶，NOX）源性活性氧（ROS）的產生將是防治心血管疾病的新策略。本文對血小板NOX特點、ROS活化血小板的機制及與血小板NOX相關的臨床和藥物研究進展進行綜述。

血小板 NADPH氧化酶 活性氧 綜述

血小板由骨髓巨核細胞胞質脫落形成，當血管內皮損傷時，血小板活化和聚集形成止血血栓防止血液流失及保持血管壁完整性，但當其功能亢進或異?；罨瘯r，易致病理性血栓形成和栓塞發(fā)生，后者是心肌梗死和腦卒中等心腦血管疾病發(fā)生的主要原因[1]?；钚匝酰≧OS）引起的氧化應激是誘導血小板活化的重要機制，尤其是調控還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶，NOX）來源的ROS，如超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（-OH）和氫過氧化物（HOO-）等[2]。本文對血小板中NOX種類及特點、ROS活化血小板的機制及與血小板NOX相關的臨床疾病和藥物研究進展等作一綜述，現報道如下。

1 血小板中NOX的種類和功能

NOX最初在吞噬細胞中被發(fā)現，其激活產生的細胞外超氧化物是微生物感染時宿主防御反應的基礎[3]。NOX復合物的組成和活化需要胞膜催化亞基gp91phox（又名NOX2）與gp22phox亞基形成異二聚體，以及胞質亞基p47phox，p67phox，p40phox和小分子GTPases結合蛋白Rac易位至膜上才能完成，后續(xù)在非吞噬細胞中發(fā)現NOX2的多個同源物，包括NOX1、NOX3、NOX4、NOX5和雙氧化酶Duox（Duox1和Duox2），共同構成了NOX家族[3,4]。其中NOX2是血小板中最主要的亞型，在遺傳性慢性肉芽腫?。–GD）患者，血小板O2－產生幾乎被完全抑制，凝血酶、膠原和花生四烯酸誘導的血小板CD40配體（CD40L）表達和聚集顯著減少[5]。與此同時，血小板中相應鑒定出催化亞基gp91phox和p22phox及胞質亞基p47phox的存在，以及NOX2復合物的激活也需要p47phox、p67phox和Rac分子的作用。NOX2敲除小鼠血小板表現為膠原相關肽和凝血酶誘導的ROS產生均減少，體內激光誘導動脈血栓形成受損，但不影響生理性止血功能[6]。近來研究顯示血小板也表達NOX1和NOX4亞型，McCrann等[7]在小鼠骨髓和巨核細胞中發(fā)現Nox1 mRNA和蛋白的表達，而NOX1敲除小鼠則顯示凝血酶和血栓烷A2類似物（U46619）誘導的血小板ROS生成減少和活化受損，但不影響膠原誘導的ROS生成，表明NOX1在血小板激活和血栓形成中的作用不同于NOX2，對NOX4的功能研究目前還未深入。

2 ROS促進血小板活化的作用機制

ROS參與血小板的活化調節(jié)，一方面，血管壁ROS的釋放通過一氧化氮（NO）的清除，降低血管內皮細胞的抗血小板性能；另一方面，在常見的膠原或凝血酶等刺激下，血小板自身產生ROS，如O2－和H2O2等，作為第二信使通過鈣動員，減少NO的利用度或滅活NO，花生四烯酸非酶氧化途徑形成異前列腺素，以及促進氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）生成等途徑促進血小板聚集和血栓形成。

2.1 H2O2的形成和作用 O2－在超氧化物歧化酶（SOD）作用下轉化成化學性質穩(wěn)定的H2O2。膠原誘導的血小板聚集與H2O2的爆發(fā)相關，通過H2O2促進血小板膜上花生四烯酸釋放，血栓烷A2（TXA2）和磷脂酶C上調，胞內鈣離子動員增加，從而增強血小板活化。衰老相關小鼠血小板活化中，H2O2和整合素αIIbβ3活化增加相關，光化學損傷頸動脈后，穩(wěn)定血栓形成時間明顯縮短，而過表達谷胱甘肽過氧化物酶-1（Gpx1）小鼠則沒有上述表現。此外，老齡化小鼠血小板顯示p47phox和SOD表達增加，NOX抑制劑聚乙二醇或夾竹桃麻素（apocynin）能抑制αIIbβ3活化[8]。谷胱甘肽過氧化物酶-3（Gpx3）敲除小鼠則顯示出血時間縮短，二磷酸腺苷（ADP）刺激下血小板聚集反應增強，體內血小板活化增強和血栓形成。此外，Gpx3敲除小鼠更易發(fā)生腦梗死與腦卒中，這些發(fā)現與Gpx3缺陷患者易患動脈血栓和中風的研究結果相一致。

2.2 對NO的影響 血小板活化受內皮細胞和血小板來源的NO和前列環(huán)素（PGI2）嚴格調控[9]。NO能抑制血小板黏附、分泌和聚集，涉及的機制包括NO/環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶 G/蛋白激酶 A（NO/cGMP/PKG/PKA）途徑及蛋白質亞硝基化和硝化反應。O2-作為第二信使能干擾NO活性或生物合成，并和NO結合形成過氧化亞硝酸鹽，以及與氨基酸如酪氨酸產生酚環(huán)反應影響血小板功能。鳥苷酸環(huán)化酶（GC）基因敲除顯示NO-GC是血小板NO主要受體，表明NO對血小板功能的抑制作用[10]。CGD患者血小板O2-產生顯著受抑制與NO升高相關，也證實NOX2在降低NO活性中的作用。

2.3 花生四烯酸非酶氧化途徑形成異前列腺素 ROS能促進花生四烯酸非酶超氧化途徑產生F2-異前列腺素，尤其是8-異前列腺素F2a（8-iso-PGF2a）的形成，以及環(huán)氧酶（COX-1）活化產物TXA2的增多[11]。gp91phox基因缺陷患者血小板TXA2形成正常但8-iso-PGF2a顯著減少，血小板招募受損。使用NOX2特異性抑制劑 gp91ds-tat，F2-異前列腺素產生明顯受抑制，同時1 500s－1剪切力血流灌注條件下，血栓形成也明顯減少，表明NOX2在8-iso-PGF2a形成中起主要作用[12]。此外，CGD患者和攜帶者體內血小板活化標志物血漿sCD40L水平和可溶性P-選擇素減少，異前列腺素表達下調和NO生成增強，而肥胖患者則呈現高水平血漿sCD40L和P-選擇素，同時NOX2和異前列腺素表達上調，表明體內血小板NOX2調節(jié)程度、異前列腺素形成與活化之間關系緊密。

2.4 促進氧化型低密度脂蛋白的生成 NOX2來源的氧化應激促進ox-LDL生成，ox-LDL通過凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）增強血小板活化[13]。gp91phox缺陷患者血小板產生少量的ROS和LDL弱修飾，而高膽固醇血癥患者顯示ox-LDL和ROS生成增強，表明血小板通過NOX2介導的氧化應激修飾LDL。使用NOX2抑制劑gp91ds-tat或小鼠血小板NOX2敲除，ox-LDL誘導的血小板ROS產生和活化均被抑制。Magwenzi等[14]認為ox-LDL的作用機制涉及其與CD36分子結合，激活酪氨酸激酶和蛋白激酶C（PKC）依賴的NOX2活化途徑，從而削弱cGMP對血小板聚集的抑制作用。

3 與血小板NOX相關的臨床研究

NOX與血小板活化相互作用的體內研究比較少，臨床研究包括經皮冠狀動脈介入治療（PCI），動脈粥樣硬化高風險因素如2型糖尿病，肥胖癥，心房顫動（AF），非酒精性脂肪肝（NAFLD），人類免疫缺陷病毒（HIV-1）感染和肺炎等，這些疾病都與細胞及全身性氧化應激相關[11,15-17]。

3.1 經皮冠狀動脈介入治療 PCI以復雜的缺血/再灌注過程和ROS爆發(fā)為特征。盡管阿司匹林抗血小板治療，患者仍顯示血小板血栓烷B2（TXB2）產生增加，同時血清NOX2增高，表明NOX2表達和COX1過度活化之間存在潛在關系。靜脈輸注抗壞血酸抑制ROS活性，發(fā)現NOX2下調及TXB2生成減少，說明NOX2在PCI術后TXB2過度產生中發(fā)揮作用[18]。

3.2 2型糖尿病 2型糖尿病患者存在動脈粥樣硬化加速和血小板活化現象，血小板活化標記物可溶性CD40L和P-選擇素及TXB2尿排泄增加[19]?；颊唢@示血小板氧化應激增強和異前列腺素形成增加，并與NOX2活性調節(jié)有著顯著的相關性，提示NOX2在促進血小板異前列腺素過度產生和活化中的作用。阿司匹林治療時，氧化應激介導的血小板異前列腺素過度產生能削弱阿司匹林對TXA2的抑制作用，而增強血小板招募。如除阿司匹林外再給予他汀類藥物，如加服阿托伐他汀則能夠下調NOX2和異前列腺素形成，繼而降低血小板活化[20]。

3.3 肥胖和高膽固醇血癥 代謝綜合征患者存在血小板TXB2過度產生和氧化應激增強現象，如8-iso-PGF2α尿排泄增加。低熱量飲食減輕體重后，血小板TXB2和異前列腺素形成均減少，NOX2來源的氧化應激下調，血管內皮功能得以改善[21]。

3.4 AF和非酒精性脂肪肝 經歷過AF的患者NOX2和異前列腺素的基線值與未經歷者相比差異顯著，表明在AF發(fā)生過程中NOX2來源的ROS發(fā)揮重要作用，因此NOX2和異前列腺素水平可以預測AF患者心血管事件發(fā)生的風險。此外，從單純的脂肪肝到脂肪性肝炎的進展中，氧化應激的作用導致細胞死亡、炎癥和肝纖維化的發(fā)展，NAFLD患者NOX2血清水平與肝細胞損傷標志物血清細胞角蛋白-18密切相關[22]。

3.5 感染 血小板膜表面具有病毒和細菌特定的受體，通過與相應配體的作用導致血小板活化。對HIV-1感染和肺炎患者的研究表明NOX2和血小板活化相關。HIV-1感染者血清sCD40L水平升高，血小板sNOX2-dp和8-iso-PGF2α顯著增加，感染與血小板氧化應激增加及NOX2激活相關，阿巴卡韋（abacavir）治療能減少血小板sNOX2-dp和8-iso-PGF2α產生[23]。肺炎患者血清心肌肌鈣蛋白T升高，心肌損傷與NOX2上調之間存在顯著相關性，發(fā)生心肌梗死的肺炎患者血漿可溶性P-選擇素、sCD40L與TXB2基線水平明顯增高，表明NOX2來源的氧化應激參與了急性期肺炎的心肌損傷。

4 以血小板NOX為靶點的藥物研究

藥物抑制血小板NOX研究主要包括非特異性抑制劑如他汀類和多酚及特異性抑制劑如夾竹桃麻素等。

4.1 他汀類藥物 屬于3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，阿托伐他汀和瑞舒伐他汀體內外藥理研究表明其抗血小板與抗氧化應激作用機制涉及NOX2表達下調。高膽固醇患者服用阿托伐他汀2h后即顯示血小板NOX2和異前列腺素下調及血小板聚集受到抑制，體外研究顯示其抑制NOX2和PLA2的激活呈劑量依賴關系，異前列腺素和TXA2的形成及血小板招募均減少，同時NO生成增加，瑞舒伐他汀在體內外的作用結果與前者類似[24]。他汀類藥物抑制血小板NOX2來源的氧化應激以及增強NO生成等表現與其在內皮細胞中的作用相似。

4.2 多酚類 槲皮素和兒茶素在體外以協(xié)同方式抑制PKC依賴的NOX2活化和ROS生成，減少血管損傷處血小板的招募和αIIbβ3表達，同時增強NO作用[25]。富含多酚的營養(yǎng)物，如葡萄酒和可可的體內研究進一步證實這種作用，服用富含茶多酚的黑巧克力2h后，血小板活化即明顯受到抑制，同時NOX2來源的ROS生成減少，異前列腺素產生受到抑制及NO產生/利用度增加。因此，黑巧克力依賴其多酚含量可降低吸煙者的氧化應激反應。此外，服用較高多酚含量的紅葡萄酒后，多酚混合物能抑制LDL氧化和NOX2活化，8-iso-PGF2a也顯著下降。

4.3 夾竹桃麻素 又名羅布麻寧，為天然化合物，體外研究表明夾竹桃麻素能抑制p47phox易位，干擾NOX2活化從而抑制血小板活化[26]。尤其是夾竹桃麻素抑制刺激劑誘導的血小板ROS形成，降低異前列腺素產生，顯著減少血小板招募。這些作用也在動物模型中得到了進一步驗證，易患動脈粥樣硬化小鼠喂服夾竹桃麻素后，血小板活化受到抑制，P-選擇素表達和血小板黏附均減少。而另一抑制劑山奈酚（Kaempferol），則通過直接結合p47phox，抑制膠原誘導的p47phox絲氨酸磷酸化和NOX2 活化[27]。

5 小結和展望

迄今為止的研究表明,ROS在血小板活化功能中涉及多種機制，臨床研究與NOX抑制劑的作用研究證實血小板NOX2所起的關鍵作用。但是盡管NOX2缺陷，CGD患者仍有少量ROS產生，提示血小板可能表達NOX其他亞型的作用[5]。未來針對NOX降低氧化應激相關的血小板活化將是抗血栓形成的策略之一，但同時必須注意細胞吞噬細菌的能力是否受到影響。此外，尚有研究表明,NOX2缺陷的女性攜帶者表現全身氧化應激和動脈粥樣硬化均減少的同時，機會性感染也減少[28]。由此，我們推測NOX活性適當的抑制，將有可能使動脈粥樣硬化疾病高風險患者避免遭受嚴重并發(fā)癥的發(fā)生。此外，還需要進一步研究血小板其他NOX亞型的功能。

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10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2016-1798

浙江省自然科學基金項目（LY13H080006）

310036 杭州，杭州師范大學錢江學院基礎醫(yī)學教研室（羅冬嬌、傅圓圓）；溫嶺市大溪中心衛(wèi)生院（黃靈芳）

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2016-11-03）

沈昱平）