PCOS大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的表達變化及對卵泡發(fā)育的影響

史學(xué)燕 駱倩倩 王立桐 蔡 恒 張洪芹

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 煙臺 264003；2 東營市人民醫(yī)院血管外科；3濱州醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)管理中心形態(tài)學(xué)實驗室；4 濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

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PCOS大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的表達變化及對卵泡發(fā)育的影響

史學(xué)燕1,2駱倩倩3王立桐4蔡 恒1張洪芹1

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 煙臺 264003；2 東營市人民醫(yī)院血管外科；3濱州醫(yī)學(xué)院實驗教學(xué)管理中心形態(tài)學(xué)實驗室；4 濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

目的 對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的表達變化及對卵泡發(fā)育的影響進行研究。方法 采用腹腔注射來曲唑構(gòu)建PCOS大鼠模型，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清中性激素水平，蘇木精-伊紅(H-E)染色檢測卵巢的形態(tài)學(xué)改變，免疫組化檢測卵巢中kisspeptin/kiss1r、卵泡刺激素受體(FSHR)的蛋白水平變化。結(jié)果 從灌胃后第10天開始，PCOS組大鼠體重明顯增加，血清中睪酮(T)、黃體生成素(LH)的水平明顯升高，卵泡刺激素(FSH)水平無明顯改變；大鼠卵巢皮質(zhì)中含有較多的小卵泡及閉鎖卵泡，多數(shù)卵泡成囊性擴張，顆粒細胞層數(shù)明顯減少；卵巢中kisspeptin/kiss1r、FSHR均在細胞質(zhì)表達，kisspeptin/kiss1r主要在顆粒細胞、膜細胞和黃體中表達，而FSHR僅表達在顆粒細胞。PCOS組卵巢中kisspeptin/kiss1r、FSHR表達明顯減少。結(jié)論 在PCOS卵泡發(fā)育中，卵巢表達的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用，為PCOS的臨床治療和基礎(chǔ)研究提供新思路。

kisspeptins；多囊卵巢綜合征；卵泡發(fā)育

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)作為一種常見的生殖內(nèi)分泌疾病，好發(fā)于育齡期女性，其發(fā)病率約5%～10%，是無排卵性不孕癥的最主要的原因[1]。眾多學(xué)者已從基因、環(huán)境、遺傳等多個方面對PCOS的發(fā)病機制進行了探討，認(rèn)為這一疾病可能與下丘腦-垂體-性腺軸功能失調(diào)、肥胖、遺傳因素、環(huán)境因素等方面有關(guān)，但其發(fā)病機制尚不明確。1996年，kiss1基因[2]的發(fā)現(xiàn)，使人們對生殖生理領(lǐng)域的認(rèn)識徹底改觀，kiss1基因其編碼的產(chǎn)物是kisspeptin。 Gaytan F等人發(fā)現(xiàn)卵巢表達的kisspeptin/kiss1r能夠直接調(diào)節(jié)卵巢的功能，卵巢顆粒細胞表達的kisspeptin對卵泡的完整性至關(guān)重要[3]，但卵巢表達的kisspeptin/kiss1r在PCOS卵巢發(fā)育中的作用研究甚少，因此我們以來曲唑構(gòu)建的PCOS大鼠模型為研究對象進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 5周齡雌性Wistar大鼠購自山東大學(xué)實驗動物中心，ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物)，蘇木精(索來寶)，免疫組化試劑盒(中山金橋)，DAB試劑盒(康為世紀(jì))，anti-kisspeptin/kiss1r抗體(Bioss)，anti-FSHR抗體(博奧森)。

1.2 PCOS大鼠模型的構(gòu)建 5周齡雌性Wistar大鼠，適應(yīng)1周后，隨機分為正常組、對照組和PCOS組(n=15)。PCOS組：來曲唑按照1 mg·kg-1·d-1(溶于I%羧甲基纖維素)的劑量進行灌胃；對照組：等體積的羧甲基纖維素(carboxmethlycellulose，CMC)溶液灌胃，連續(xù)灌胃21 d；正常組：不予處理。灌胃結(jié)束時按照Manner? L的方法[4]，檢測三組大鼠的動情周期、卵巢的形態(tài)、體重變化及血清中與生殖相關(guān)的激素水平，確定PCOS大鼠模型是否構(gòu)建成功。

1.3 ELISA法測定血清中T、LH和FSH水平 將三組大鼠血樣靜置離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測T、LH和FSH水平。樣本孔按照樣品和樣品稀釋液比例為1∶4加入待測樣品，經(jīng)溫育洗滌后加入酶標(biāo)試劑50 μL、顯色劑A、B各50 μL和終止液，測量吸光度(OD值，450 nm波長)，計算各組大鼠血清中的激素水平。

2.1.1 對蘇丹草株高的影響 孕穗期蘇丹草的株高由高至低的處理依次為F2>F3>F1>F6>MR>CK>F4>F5>P，其中，F(xiàn)2和F3的株高較高，分別為320 cm和318 cm，而P處理蘇丹草株高最低，為291 cm。各處理蘇丹草的株高較P處理高6.38%～12.68%，各處理(除P，F(xiàn)4和F5)株高較CK提高了1.99%～5.39%，F(xiàn)2和F3的株高均顯著高于P(P<0.05)，其余各處理與CK相比差異不顯著(P>0.05)(圖1-A)。

2.1 三組大鼠體重及激素水平改變 與正常組相比，對照組大鼠體重和血清中T、LH、FSH水平無明顯改變。與對照組相比，PCOS組大鼠從灌胃后第10天開始體重明顯增加；PCOS組血清中T、LH水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FSH水平無明顯變化(圖1)。

1.5 免疫組織化學(xué) 將三組大鼠卵巢組織制備成片厚4 μm的石蠟切片，經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、血清封閉等步驟，加入一抗的濃度分別為兔抗大鼠多克隆抗體kisspeptin(1∶400)，kiss1r(1∶400)，F(xiàn)SHR(1∶150)，每組的陰性對照用PBS代替一抗。對其灰度值用Image-pro plus軟件進行比較分析。

2.3 卵巢中kisspeptin/kiss1r、FSHR的表達變化 免疫組化結(jié)果顯示kisspeptin/kiss1r、FSHR均在細胞質(zhì)表達，kisspeptin/kiss1r主要在顆粒細胞、膜細胞和黃體中表達，而FSHR僅在顆粒細胞表達。對IOD/area進行分析，與正常組相比，對照組大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r、FSHR無明顯變化。與對照組相比，PCOS組卵巢中kisspeptin/kiss1r、FSHR表達明顯減少(P<0.05)(圖3)。

2 結(jié)果

1.4 H-E染色 將三組大鼠的卵巢制備成片厚5 μm的石蠟切片，通過脫蠟至水、染色、封片，顯微鏡下觀察三組大鼠卵巢的形態(tài)學(xué)改變。

2.2 卵巢的形態(tài)學(xué)改變 H-E染色結(jié)果顯示正常組和對照組大鼠卵巢皮質(zhì)中包含處于不同發(fā)育階段的卵泡和多個黃體，部分卵泡中有放射冠；而PCOS組大鼠卵巢皮質(zhì)中含有較多的小卵泡及閉鎖卵泡，不同發(fā)育階段的卵泡少見，多數(shù)卵泡成囊性擴張，顆粒細胞層數(shù)明顯減少，排列疏松，黃體缺失(圖2)。

（3）美化了作業(yè)環(huán)境，保障了員工的職業(yè)衛(wèi)生健康。改進轉(zhuǎn)運方式以后，消除了物料轉(zhuǎn)運過程中灑落的現(xiàn)象；同時，自動化水平提高后，減少了人員和物料的接觸，保障了操作人員職業(yè)衛(wèi)生健康。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間用單因素方差分析進行比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

(2)內(nèi)外筒設(shè)計細化了污水在氣浮罐體內(nèi)的流動，形成不同的氣浮區(qū)域，避免出水夾帶油滴，降低氣浮效果，同時空間利用率更高，結(jié)構(gòu)更為緊湊。

3 討論

本研究在前期研究的基礎(chǔ)之上，以來曲唑構(gòu)建的PCOS大鼠模型為研究對象，進一步探討卵巢表達的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在PCOS卵泡發(fā)育中的作用。在臨床上，PCOS表現(xiàn)為排卵障礙、月經(jīng)失調(diào)，高雄激素血癥、多毛癥、痤瘡等的臨床特征，多囊卵巢。本研究對PCOS大鼠的體重、血清中激素水平及卵巢的形態(tài)學(xué)進行觀察，PCOS大鼠的體重明顯增加，血清中T水平增加顯著，卵巢的形態(tài)學(xué)改變呈多囊樣改變，其癥狀和體征與臨床上PCOS患者的表現(xiàn)一致。這說明來曲唑構(gòu)建的PCOS適用于對卵巢中卵泡發(fā)育的研究。來曲唑為芳香化酶抑制劑，其通過抑制芳香化酶的合成，減少雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，降低體內(nèi)雌激素的水平，使體內(nèi)雄激素水平明顯升高。2015年，Caldwell A S L等[5]的實驗結(jié)果顯示高雄激素血癥是導(dǎo)致PCOS卵泡發(fā)育障礙的重要因素。雄激素水平過高，增加卵泡的啟動募集，使卵巢中竇狀卵泡和竇前卵泡的數(shù)量異常增多，局部雄激素合成隨之進一步增加，形成惡性循環(huán)。本實驗通過H-E染色檢測大鼠卵巢的形態(tài)學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠卵巢中顆粒細胞的層數(shù)明顯減少并有較多的小卵泡。這說明卵巢的形態(tài)學(xué)改變與機體睪酮水平明顯升高關(guān)系密切。

本研究結(jié)果顯示，PCOS組大鼠血清中除T水平升高外，LH水平明顯升高。在來曲唑誘導(dǎo)的模型中，芳香化酶抑制劑通過減少雌激素的生成，負(fù)反饋引起下丘腦-垂體-卵巢軸LH分泌增多[6]，PCOS中LH異常升高，能夠促進卵泡內(nèi)膜細胞以及間質(zhì)細胞合成過多雄激素。這提示PCOS大鼠血清中LH、T水平在卵泡發(fā)育過程中發(fā)生協(xié)同作用。雄激素水平過高，促進卵泡顆粒細胞提前黃素化和凋亡，導(dǎo)致卵泡生長發(fā)育停滯并使卵巢呈多囊性改變[7]。這提示PCOS大鼠卵巢中的顆粒細胞可能發(fā)生過早的黃素化。2015年有研究報道外源性kisspeptin 處理黃素化的顆粒細胞后，顆粒細胞分泌的雌激素和孕激素水平升高，而外源性kisspeptin 處理顆粒細胞后，顆粒細胞分泌的雌激素和孕激素水平無明顯改變[8]。另外，免疫組化結(jié)果顯示大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r表達水平均下降，這說明外源性kisspeptin將有助于改善PCOS中黃素化顆粒細胞的功能，進而調(diào)節(jié)血清中雌、孕激素的水平。另外在卵泡的發(fā)育過程中，F(xiàn)SH在促進卵泡的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。FSH與FSHR的相互作用是卵泡發(fā)育的關(guān)鍵，在性腺對促性腺激素應(yīng)答過程中起著決定性作用[9]，F(xiàn)SHR僅表達在卵巢顆粒細胞上。我們的實驗結(jié)果顯示與正常組相比，PCOS組血清中FSH水平無明顯改變，卵巢中FSHR表達明顯減少。Abdel-Aziz A F等[10]的研究表明FSHR基因變異引起FSHR功能改變，能夠?qū)е侣殉舶l(fā)育不全等卵巢功能的改變。這提示卵巢表達的kisspeptin可能通過調(diào)節(jié)顆粒細胞的黃素化，作用于顆粒細胞表達的FSHR，調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。

通過地膜鋪設(shè)進行雨污分流的關(guān)鍵在于3個有效：應(yīng)確保膜覆蓋有效，全面覆蓋、焊接嚴(yán)密、壓固有效；確保非作業(yè)區(qū)與作業(yè)區(qū)的隔離有效，防止非作業(yè)區(qū)雨水進入作業(yè)區(qū)；確保膜上雨水導(dǎo)排系統(tǒng)有效，及時抽排至明溝。

另外，有研究[11]顯示，kisspeptin在臨床上短期應(yīng)用可誘導(dǎo)FSH、LH水平升高。因此kisspeptin可用于治療IHH、不孕及排卵障礙等，并且kisspeptin拮抗劑可能是PCOS中控制LH分泌過多的治療方法[12]。Cai J等[13]的研究結(jié)果顯示FSHR表達降低可引起卵巢對促性腺激素反應(yīng)性降低。這提示kisspeptin在PCOS疾病的治療過程中尤其是出現(xiàn)的卵巢過度刺激綜合征(OHSS)具有重要的潛在價值，并對其治療提供一定的實驗依據(jù)?？傊?，在PCOS中卵巢表達的kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，為PCOS的臨床治療和基礎(chǔ)研究提供新思路。

[1] Norman R J,Dewailly D,Legro R S,et al.Polycystic ovary syndrome[J].The Lancet,2007,370(9588):685-697.

[2] Lee J H,Miele M E,Hicks D J,et al.KiSS-1, a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene[J].Journal of the National Cancer Institute,1996,88(23):1731-1737.

[3] Gaytan F,Garcia-Galiano D,Dorfman M D,et al.Kisspeptin receptor haplo-insufficiency causes premature ovarian failure despite preserved gonadotropin secretion[J].Endocrinology,2014,155(8):3088-3097.

[4] Manneras L,Cajander S,Holmang A,et al.A new rat model exhibiting both ovarian and metabolic characteristics of polycystic ovary syndrome[J].Endocrinology,2007,148(8):3781-3791.

[5] Caldwell A S L,Eid S,Kay C R,et al.Haplosufficient genomic androgen receptor signaling is adequate to protect female mice from induction of polycystic ovary syndrome features by prenatal hyperandrogenization[J].Endocrinology,2015,156(4):1441-1452.

[6] Blank S K,McCartney C R,Marshall J C.The origins and sequelae of abnormal neuroendocrine function in polycystic ovary syndrome[J].Human Reproduction Update,2006,12(4):351-361.

[7] 廖彩韻, 梁曉燕. 多囊卵巢綜合征的病理生理[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(1):9-11.

[8] 郭威.Kisspeptin參與多嚢卵巢綜合征患者顆粒細胞孕激素分泌的調(diào)節(jié)[D].鄭州:鄭州大學(xué),2015.

[9] 朱倩,崔毓桂.SET 蛋白及其對雄激素合成的調(diào)節(jié)作用[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2014,33(6):423-427.

[10] Abdel-Aziz A F,El-Sokkary A M A,El-Refaeey A A,et al. Association between follicle stimulating hormone receptor (FSHR) polymorphism and polycystic ovary syndrome among Egyptian women[J].International Journal of Biochemistry Research & Review,2015,5(3):198.

[11] 翟君鈺. Kisspeptin 與卵巢功能及排卵的關(guān)聯(lián)性研究[D].濟南:山東大學(xué),2014.

[12] Cortés M E,Carrera B,Rioseco H,et al.The Role of Kisspeptin in the Onset of Puberty and in the Ovulatory Mechanism:A Mini-review[J].Journal of Pediatric and Adolescent Gynecology,2015,28(5):286-291.

[13] Cai J,Lou H,Dong M,et al.Poor ovarian response to gonadotropin stimulation is associated with low expression of follicle-stimulating hormone receptor in granulosa cells[J].Fertility and Sterility,2007,87(6):1350-1356.

The role of kisspeptin/kiss1r system on follicular development disorder in the ovaries of polycystic ovary syndrome rats

SHI Xueyan1,2LUO Qianqian3WANG Litong4CAI Heng1ZHANG Hongqin1

1 Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China；2 Department of Vascular Surgery, Dongying People 's Hospital;3 Morphology Laboratory,Experimental Teaching Management Center, Binzhou Medical University; 4 School of Clinical Medicine, Binzhou Medical University

Objective To explore the role of kisspeptin/kiss1r system on follicular developmental disorder in the ovaries of polycystic ovary syndrome (PCOS) rats.Methods The PCOS rat models were constructed by Letrozole with intraperitoneal injection.Serum hormone levels and morphological changes of ovary were examined by ELISA and H-E staining, respectively.The expression of kisspeptin/kiss1r system and FSHR in experimental rat ovaries was detected through immunohistochemistry.Results Compared with the normal group,body weight of the PCOS group increased significantly from the beginning of the tenth day after filling the stomach.Simultaneously,LH/FSH ratio was considerably increased,which lead to hyperandrogenism.Small follicles and atresia follicles were occupied the ovarian cortex of PCOS and most of the follicles showed cystic dilatation whose cell layers were significantly reduced.FSHR and kisspeptin/kiss1r were expressed in the cytoplasm of ovaries,and kisspeptin/kiss1r was mainly expressed in granulosa cells, membrane cells and corpora luteum,whereas FSHR was expressed only in granulosa cells.The expression of kisspeptin/kiss1r and FSHR in the PCOS group was significantly decreased.Conclusion Kisspeptin/kiss1r system expressed in the ovaries may play an important role in the process of follicular developmental disorder, which provides a novel idea for clinical treatment and basic research of PCOS.

kisspeptins,polycystic ovary syndrome,follicular development

張洪芹，E-mail:byzhhq@163.com

R711.75

A

1001-9510(2016)06-0404-05

2016-09-09)