Fe3O4/Au磁性納米復(fù)合材料的制備和性能

吳燕平，穆 肖，沈欣怡，毛 艷，吳 賓，宮培軍*

（浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

Fe3O4/Au磁性納米復(fù)合材料的制備和性能

吳燕平，穆 肖，沈欣怡，毛 艷，吳 賓，宮培軍*

（浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

以聚乙烯亞胺修飾的納米Fe3O4（Fe3O4/PEI）為磁性組分，采用化學(xué)還原法制備得到Fe3O4/Au磁性納米復(fù)合材料（Fe3O4/Au），對其形貌和尺寸、磁學(xué)性質(zhì)和分散穩(wěn)定性進(jìn)行表征，并研究了借助3-巰基丙酸在磁粒表面偶聯(lián)模型靶分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（RGD）的效果。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4/Au由納米Au粒和Fe3O4/PEI構(gòu)成，當(dāng)進(jìn)行二次還原反應(yīng)后，產(chǎn)物中Au粒的數(shù)量和尺寸均增大，F(xiàn)e3O4/Au的平均水力學(xué)粒徑增大、飽和磁化強度則減小，但磁響應(yīng)性和分散穩(wěn)定性保持良好。偶聯(lián)反應(yīng)顯示1 mg Fe3O4/Au可以固定約61.9 μg RGD，所得磁粒的粒徑分布仍較窄。這些特征和性能顯示Fe3O4/Au有望應(yīng)用于生物分離與檢測、靶向藥物輸運等領(lǐng)域。

Fe3O4/Au；磁性粒子；分散穩(wěn)定性；共價偶聯(lián)；生物應(yīng)用

近年來，不斷發(fā)展的生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)在實現(xiàn)惡性疾病的早期篩查和高致病性傳染病的快速檢測等方面發(fā)揮重要作用，其中基于磁性納米材料發(fā)展的生物分離、基因雜交檢測和腫瘤成像等檢測技術(shù)呈現(xiàn)出優(yōu)異的應(yīng)用性能[1-2]。因此，適合生物應(yīng)用的磁性納米材料的制備和性能研究備受關(guān)注。

金修飾的磁性粒子是近些年來發(fā)展的一類新型磁性材料。相比傳統(tǒng)的高分子或氧化硅修飾的磁性粒子，金的光學(xué)、電化學(xué)性質(zhì)使得金修飾的磁性粒子在生物分離與檢測等應(yīng)用中擁有更多可選的分析檢測手段[3-4]，金的生物相容性和光熱性質(zhì)則賦予該類材料作為成像劑或納米藥物應(yīng)用于體內(nèi)腫瘤成像與治療的性能[5-7]。在生物修飾方法上，金的表面化學(xué)性質(zhì)既能使巰基或胺基功能化的靶向分子（如抗體、核酸等）直接組裝在磁性材料表面[1]，也能采用先連接偶聯(lián)劑或間隔臂、再共價偶聯(lián)靶向分子的修飾路線[5]，多樣化的表面修飾路線更有利于磁粒在多種生物體系的應(yīng)用。

金修飾的磁性粒子的合成方法包括化學(xué)還原法、組裝法、光化學(xué)法、聲化學(xué)法等[3-9]，其中化學(xué)還原法的合成工藝簡便，通過調(diào)節(jié)還原反應(yīng)中物料配比或還原反應(yīng)的次數(shù)可以方便地調(diào)控復(fù)合材料中金殼層的厚度或金顆粒的大小，進(jìn)而調(diào)控材料的光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)等性質(zhì)參數(shù)，因此受到廣泛的研究。本文以聚乙烯亞胺（PEI）修飾的Fe3O4納米粒子為磁性組分，采用化學(xué)還原法制備了Fe3O4/Au納米復(fù)合材料（Fe3O4/Au）。以對多種腫瘤細(xì)胞新生血管表面高表達(dá)的整合素αvβ3受體具有靶向作用的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（RGD）為模型靶分子，研究了Fe3O4/Au的生物修飾性能，結(jié)合Fe3O4/Au的形貌和尺寸、磁學(xué)性能和分散穩(wěn)定性等特征和性質(zhì)，分析了Fe3O4/Au作為磁性載體用于生物分離與檢測、藥物輸運等領(lǐng)域的可行性。

1 實驗

1.1 試劑和儀器

PEI（Mw100 kD）購自百靈威化學(xué)試劑公司，RGD（序列為c(RGDyK)）購置吉爾生化（上海）公司，Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購置碧云天生物技術(shù)公司；其他試劑購自國藥集團化學(xué)試劑公司，均為分析純級。氮氣（99.9%）作為磁性材料制備過程的保護(hù)氣。

PW3040/60型X-射線衍射儀（荷蘭Philps公司），JEM2010型透射電子顯微鏡（日本JEOE公司），Zetasizer nano ZS90型納米粒度和Zeta電位儀（英國Malvern公司），7404型振動樣品磁強計（美國Lakeshare公司，25℃測試），Nexus 670型傅立葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司，KBr壓片），UV-2100型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）。

1.2 Fe3O4/Au的制備

將1.62 g FeCl3·6H2O、1.39 g FeSO4·7H2O和0.30 g PEI溶解在30 mL蒸餾水中，在N2氣氛下滴入20 mL 2.5% NaOH，攪拌15 min后轉(zhuǎn)移反應(yīng)液至100 mL反應(yīng)釜，200℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫，用磁鐵分離固體產(chǎn)物并水洗至中性，得到PEI修飾的Fe3O4納米粒子（Fe3O4/PEI）。

將50 mg Fe3O4/PEI超聲分散于20 mL水中，加入1.6 mL 1% HAuCl4，滴加1.2 mL 0.1 mol/L鹽酸羥胺，室溫攪拌反應(yīng)1 h。用磁鐵分離磁性產(chǎn)物并洗滌數(shù)次，得到Fe3O4/Au納米復(fù)合材料，記為Fe3O4/Au1。向Fe3O4/Au1分散液再次加入HAuCl4和鹽酸羥胺，進(jìn)行二次還原反應(yīng)，制備條件同上，得到的Fe3O4/Au復(fù)合材料標(biāo)記為Fe3O4/Au2。

1.3 RGD在Fe3O4/Au表面的修飾

將2.5 mg Fe3O4/Au2與5 mL 0.05 mol/L 3-巰基丙酸（MPA）在室溫下振蕩反應(yīng)2 h，得到MPA修飾的Fe3O4/Au磁粒（Fe3O4/Au2-MPA）。將洗凈的Fe3O4/Au2-MPA分散在5 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 5.7），加入1 mg 1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和0.5 mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS），攪拌均勻后室溫振蕩反應(yīng)0.5 h，加入0.5 mg RGD，用NaOH調(diào)節(jié)溶液至pH 8.0，在4℃下振蕩反應(yīng)10 h，得到RGD偶聯(lián)的Fe3O4/Au磁粒子（Fe3O4/Au2-MPA-RGD）。磁分離，用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 8.0）洗磁性產(chǎn)物3次，合并反應(yīng)清液和洗滌液，使用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒測定游離RGD的濃度[10]，依據(jù)反應(yīng)前RGD的投料量求算單位質(zhì)量磁粒偶聯(lián)RGD的質(zhì)量。

圖1 Fe3O4/Au的制備（a）和表面修飾RGD過程（b）的示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1Fe3O4/Au的制備和結(jié)構(gòu)表征

Fe3O4/Au的制備過程如圖1a所示。具有正ζ電位的Fe3O4/PEI[8]可以吸附陰離子AuCl4-，后者在鹽酸羥胺的還原下轉(zhuǎn)變?yōu)锳u0，在PEI鏈的穩(wěn)定作用下生長為Au納米粒子，形成Fe3O4/Au。在圖2（a）所示的吸收光譜中，相比Fe3O4/PEI，F(xiàn)e3O4/Au1在550 nm附近出現(xiàn)Au膠體特征的吸收帶，證實Au與Fe3O4/PEI成功復(fù)合；二次還原產(chǎn)物Fe3O4/Au2的Au吸收帶紅移至約584 nm且明顯展寬，意味著復(fù)合材料中Au粒的尺寸變大且尺寸分布變寬[4]。

圖2b給出樣品的X-射線衍射（XRD）圖。制備的Fe3O4/PEI的衍射峰與面心立方結(jié)構(gòu)Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡片（JCPDS No.89-3854）一致，證實所含晶相為Fe3O4。在復(fù)合Au后，F(xiàn)e3O4的各衍射峰位置和相對強度未變化，產(chǎn)物在38.2、44.3、64.6和 77.6o處出現(xiàn)的衍射峰對應(yīng)于面心立方結(jié)構(gòu)Au（JCPDS No. 89-3697）的（111）、（200）、（220）和（311）晶面的衍射信號，證明復(fù)合材料含有Au和Fe3O4。相比Fe3O4/Au1，F(xiàn)e3O4/Au2的Au與Fe3O4衍射峰強度的比值較大，表明Fe3O4/Au2中Au的相對含量較大。

圖2 樣品的吸收光譜（a）和XRD圖（b）

2.2 形貌和尺寸

由圖3的TEM圖可見，F(xiàn)e3O4/PEI呈現(xiàn)尺寸較均勻的小顆粒，平均尺寸約24 nm；Fe3O4/Au1是由少數(shù)尺寸介于35～90 nm的深色Au粒子與Fe3O4/PEI粒子構(gòu)成，其形貌與Pradhan等超聲法制備的Fe3O4/Au相近[9]；Fe3O4/Au2中Au粒的數(shù)目明顯增多，尺寸增大至40～115 nm。由于樣品在銅網(wǎng)上嚴(yán)重團聚，難以確定Fe3O4/Au的尺寸范圍。

為此，借助動態(tài)光散射獲得的水力學(xué)粒徑分布圖確定了分散在水中的三種磁粒的平均水力學(xué)粒徑（MHD）和多分散系數(shù)（PDI）。圖3（d）顯示Fe3O4/PEI的MHD為59.4 nm，PDI為0.289。由于處于干態(tài)的PEI鏈傾向于收縮在Fe3O4表面，而在水溶液中PEI鏈因良好的親水性易于溶脹或向溶液中伸展；同時，動態(tài)光散射測定的水力學(xué)粒徑包含粒子的真實尺寸及其周圍的雙電層厚度，因此，MHD數(shù)值大于TEM統(tǒng)計的尺寸數(shù)值。Fe3O4/Au1和Fe3O4/Au2的水力學(xué)粒徑也呈現(xiàn)單峰分布，較小的PDI（0.278和0.184）表明其粒徑分布較窄；MHD值（94.8 nm和128.6 nm）較Fe3O4/PEI明顯增大，表明Fe3O4/Au中包含一定數(shù)量的Fe3O4/PEI和Au粒子，PEI與Au之間Au-N作用不僅使Fe3O4/PEI和Au粒復(fù)合，同時在一定程度上可以限制了PEI鏈在溶液中的伸展。

圖3 樣品的TEM圖（a. Fe3O4/PEI；b. Fe3O4/Au1；c. Fe3O4/Au2）和水力學(xué)粒徑分布圖（d）

2.3 磁學(xué)性質(zhì)

由圖4可知，F(xiàn)e3O4/PEI、Fe3O4/Au1和Fe3O4/Au2的磁滯回線均無明顯的磁滯現(xiàn)象，剩余磁化強度（Mr）和矯頑力（Hc）均很小，表明三個樣品均呈現(xiàn)準(zhǔn)超順磁性[11]，這是因為樣品中Fe3O4粒子的平均尺寸介于Fe3O4由鐵磁性向超順磁性轉(zhuǎn)變的尺寸區(qū)間。Fe3O4/PEI的飽和磁化強度（Ms）為69.8 emu/g，由于非磁性組分Au的存在降低了Fe3O4在復(fù)合材料中的含量，F(xiàn)e3O4/Au1和Fe3O4/Au2的Ms分別降低至44.9和26.9emu/g。較大的Ms值賦予了Fe3O4/Au良好的磁響應(yīng)性能，兩種樣品均可以在8 min內(nèi)從水溶液中完全磁回收，這足以確保Fe3O4/Au作為磁性載體用于生物分離與檢測、靶向藥物輸運等應(yīng)用。

圖4 樣品的室溫磁滯回線

圖5 Fe3O4/Au的平均水力學(xué)粒徑和多分散系數(shù)隨時間的變化

2.4 分散穩(wěn)定性

進(jìn)一步考察了Fe3O4/Au1和Fe3O4/Au2在水中的分散穩(wěn)定性，圖5顯示在12 h內(nèi)兩種Fe3O4/Au的MHD的變化幅度均很小，PDI也無明顯增大，表明Fe3O4/Au具有較好的分散穩(wěn)定性?？紤]到較大的Au粒數(shù)目有助于提高Fe3O4/Au偶聯(lián)生物靶分子的數(shù)量，本文選擇Fe3O4/Au2進(jìn)一步研究其生物修飾性能。

2.5 生物修飾性能

模型靶分子RGD在Fe3O4/Au2表面的修飾路線如圖1(b)所示，借助紅外光譜和蛋白濃度測定驗證了該偶聯(lián)反應(yīng)。圖6 中Fe3O4/Au2的1628、3120 和3423 cm-1吸收帶分別對應(yīng) PEI 中亞胺基（胺基）的N-H變形振動、對稱和反對稱伸縮振動；由于N的電子對Fe和Au的貢獻(xiàn)導(dǎo)致PEI的C-N鍵偶極性增加，C- N振動出現(xiàn)在892 cm-1處；584 cm-1吸收帶歸屬Fe-O鍵伸縮振動[12]。Fe3O4/Au2-MPA在1412和1566 cm-1處的吸收帶對應(yīng)于MPA中羧酸根COO-的對稱和反對稱伸縮振動，MPA的脫質(zhì)子是由PEI中亞胺基（胺基）的堿性所致。由于RGD的1640和1554 cm-1處酰胺I帶和II帶分別與N-H變形振動和COO-的反對稱伸縮帶的位置臨近和重疊，F(xiàn)e3O4/Au2-MPA-RGD與Fe3O4/Au2-MPA的FTIR譜在上述區(qū)域非常相近，但Fe3O4/Au-MPA-RGD的1566 cm-1附近吸收帶與Fe-O吸收帶的強度之比大于Fe3O4/Au2-MPA，證明RGD已偶聯(lián)在磁粒表面。同時，蛋白濃度測定實驗得到1 mg Fe3O4/Au2表面的RGD偶聯(lián)量約為61.5 μg，考慮到RGD的分子量（619.2）遠(yuǎn)小于常見抗體（M～104數(shù)量級），該偶聯(lián)量意味著RGD在Fe3O4/Au表面的數(shù)量非常大，這有助于使用少量的磁粒實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞等特定目標(biāo)分子的結(jié)合或捕獲。

圖6 生物修飾前后Fe3O4/Au的紅外光譜

圖7 MPA修飾和RGD偶聯(lián)的Fe3O4/Au2的水力學(xué)粒徑分布圖

動態(tài)光散射的結(jié)果也間接證實了Fe3O4/Au表面偶聯(lián)RGD的成功。圖7顯示，當(dāng)Fe3O4/Au表面組裝MPA和偶聯(lián)RGD后，F(xiàn)e3O4/Au2-MPA和Fe3O4/Au-MPA-RGD的水力學(xué)粒徑仍呈現(xiàn)單峰分布，MHD分別增大至151.3 和180.1 nm，表明MPA和RGD依次連接在磁粒表面[2]；樣品較小的PDI值（0.308和0.208）反映出上述偶聯(lián)方法基本不會導(dǎo)致磁粒尺寸分布的寬化。因此，上述修飾策略有望用于在Fe3O4/Au磁粒表面共價偶聯(lián)核酸、抗體等生物靶分子或阿霉素、紫杉醇等藥物分子，以進(jìn)一步利用主動靶向或磁靶向作用實現(xiàn)對特定組織的藥物輸運。

3 結(jié)論

本文采用化學(xué)還原法制備了準(zhǔn)超順磁性Fe3O4/Au納米復(fù)合材料。增加還原反應(yīng)的次數(shù)可以獲得平均水力學(xué)粒徑較大的復(fù)合材料，其所含Au粒子的尺寸增大、數(shù)目增多，同時Fe3O4/Au的飽和磁化強度有所減小。借助3-巰基丙酸在Fe3O4/Au表面的組裝和共價偶聯(lián)的修飾路線可以方便地在Fe3O4/Au表面修飾靶分子RGD。良好的磁響應(yīng)性能和分散穩(wěn)定性、高的靶分子偶聯(lián)量以及所得功能化磁粒較窄的尺寸分布等特征和性能使得Fe3O4/Au有望應(yīng)用于生物分離與檢測、靶向藥物輸運等領(lǐng)域。

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Preparation and Properties of Fe3O4/Au Magnetic Nanocomposites

WU Yan-ping, MU Xiao, SHEN Xin-yi, MAO Yan, WU Bing, GONG Pei-jun*
（College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China）

Fe3O4/Au magnetic nanocomposites (Fe3O4/Au) were prepared by a chemical reduction method, using polyethyleneimine-modified Fe3O4nanoparticles (Fe3O4/PEI) as the magnetic component. The morphology, size, magnetic property and dispersion stability of the obtained products were then characterized. Besides, A coupling reaction between Fe3O4/Au and arginine-glycine-aspartate peptide (RGD), a model targeting molecule, was investigated by using 3-mercaptopropionic acid as the spacer. The results showed that Fe3O4/Au was composed of Fe3O4/PEI and Au nanoparticles. As the second reduction reaction was done, both the number and size of Au nanoparticles in the obtained nanocomposite increased, which contributed to an increase in the mean hydrodynamic diameter and a decrease in the saturation magnetization of the nanocomposite. But the magnetic responsiveness and dispersion stability of Fe3O4/Au were good and independent of the successive reduction process. About 61.9 μg of RGD was conjugated to 1 mg of Fe3O4/Au and the diameter distribution of RGD-functionalized magnetic nanocomposite remained narrow. Therefore, these features and properties demonstrated that the magnetic nanocomposite are perspective materials for bioseparation, biodetection and targeted drug delivery.

Fe3O4/Au; magnetic nanoparticle; dispersion stability; covalent coupling; bioapplication

TB333

A

1009-220X(2016)06-0012-06

10.16560/j.cnki.gzhx.20160604

2016-08-06

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項目（2016C31014）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201510345020）；浙江師范大學(xué)“化學(xué)”重中之重學(xué)科學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目。

吳燕平（1995～），女，本科生；主要從事磁性納米材料制備研究。

* 通訊作者：宮培軍（1978～），男，博士，副教授；主要從事磁性納米材料制備和應(yīng)用研究。skygpj@zjnu.cn