內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型研究進(jìn)展

丁玉靜 劉俊秀 馬芙蓉

北京大學(xué)第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100191）

·綜 述·

內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型研究進(jìn)展

丁玉靜 劉俊秀 馬芙蓉

北京大學(xué)第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100191）

梅尼埃病是一種內(nèi)耳疾病，臨床表現(xiàn)以反復(fù)發(fā)作的旋轉(zhuǎn)性眩暈，波動(dòng)性感音神經(jīng)性聽力損失，耳鳴和/或耳脹滿感為特征。梅尼埃病的病因尚不明確。眾所周知，其病理特征為內(nèi)淋巴積水，但內(nèi)淋巴積水的具體作用機(jī)制尚未完全明確。已有研究證實(shí)，內(nèi)淋巴囊在內(nèi)淋巴體積調(diào)節(jié)、與慢性內(nèi)淋巴積水相關(guān)的組織病理及電生理級(jí)聯(lián)變化中具有重要作用。通過(guò)內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型研究積水產(chǎn)生過(guò)程、積水與病理及電生理變化的關(guān)系，以及這些變化是如何影響內(nèi)耳功能的，可以幫助有效治療梅尼埃病。梅尼埃病的周期性發(fā)作提示或許可以通過(guò)控制內(nèi)淋巴積水使內(nèi)耳維持穩(wěn)定狀態(tài)，避免進(jìn)展性損傷及二次損傷。

梅尼埃??；內(nèi)淋巴積水；動(dòng)物模型

Fund project:Natural science foundation of China(21272018);National major research program(91213305);Capital health development and scientific research project(2016-2-4094).

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

梅尼埃病（Meniere’s Disease,MD）根據(jù)法國(guó)醫(yī)師Prosper Meniere的名字命名，因其于1861年首先報(bào)道該病。MD的臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的旋轉(zhuǎn)性眩暈，波動(dòng)性感音神經(jīng)性聽力損失，耳鳴和/或耳脹滿感，病理特征為內(nèi)淋巴積水（endolymphatic hy?drops,ELH）。MD的病因迄今不明，1938年，Hall?pike和Cairns[1]首次描述了MD患者迷路的典型組織病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)ELH與MD有關(guān)，通過(guò)兩例病理切片資料證實(shí)球囊和蝸管擴(kuò)大，前庭和前庭階的外淋巴間隙消失。此后關(guān)于ELH在MD中的重要性逐漸被眾多研究者所證實(shí)，Arenberg等[2,3]發(fā)現(xiàn)了前庭膜腫脹并移向前庭階是ELH的典型表現(xiàn)，前庭膜破裂可能與MD發(fā)作及其功能改變有關(guān)。前庭膜順應(yīng)性變化可以解釋同一患者不同時(shí)期積水程度的變化[4]?；铙w無(wú)法進(jìn)行內(nèi)耳組織病理學(xué)研究，因此內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型在MD基礎(chǔ)研究中至關(guān)重要，本文將目前存在的內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型建立方法進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步研究MD發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

內(nèi)淋巴液由血管紋邊緣細(xì)胞和前庭暗細(xì)胞分泌產(chǎn)生，此外，內(nèi)淋巴空間的各種上皮細(xì)胞都有可能參與其生成。內(nèi)淋巴液位于兩端均為盲端的膜蝸管中，成分與細(xì)胞內(nèi)液相似，以存在高濃度鉀離子和低濃度鈉離子為特點(diǎn)。內(nèi)淋巴生成過(guò)多和/或吸收減少都會(huì)引起ELH，由此所導(dǎo)致的功能性結(jié)果取決于積水產(chǎn)生的時(shí)間。內(nèi)淋巴界膜腫脹或移位產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)可導(dǎo)致急性內(nèi)淋巴積水，反之，慢性內(nèi)淋巴積水會(huì)發(fā)生生化和形態(tài)學(xué)改變。本文將分別對(duì)二者進(jìn)行總結(jié)。

1 急性內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型

1.1人工內(nèi)淋巴液注射法

通過(guò)向豚鼠內(nèi)淋巴系統(tǒng)注射人工內(nèi)淋巴液引起壓力變化誘導(dǎo)ELH，是最直接最快速的內(nèi)淋巴積水模型制備方法，通常行耳蝸內(nèi)注射，積水程度取決于注射速度和體積。Kakigi[5]通過(guò)測(cè)量耳蝸內(nèi)靜息電位（endocochlear potential,EP）和-EP研究急性內(nèi)淋巴積水。向蝸管內(nèi)注射人工內(nèi)淋巴液時(shí)測(cè)量EP，注射后測(cè)量-EP。研究發(fā)現(xiàn)，注射人工內(nèi)淋巴液可引起短暫的EP輕微升高，-EP顯著降低。慢速注射時(shí)，由于Corti器向鼓階移位，電流減少，EP增加；內(nèi)淋巴壓力增高可直接導(dǎo)致-EP降低。耳蝸內(nèi)電位變化隨注射速度的快慢呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)性，有助于解釋MD患者的波動(dòng)性聽力損失。向豚鼠耳蝸中階注入淋巴液體積大于3uL時(shí)（500nL/min，10min），可觀察到前庭階和鼓階K+濃度升高，前庭階升高更明顯，并且認(rèn)為K+濃度升高可能與MD發(fā)作時(shí)的眩暈和聽力下降有關(guān)。Takeuchi[6]發(fā)現(xiàn)，快速注射時(shí)化學(xué)和機(jī)械創(chuàng)傷導(dǎo)致EP降低，EP降低可導(dǎo)致內(nèi)耳慢性改變。Sirjani等[7]發(fā)現(xiàn)，注射速度達(dá)到200-400 nL/min時(shí)，在2.8K Hz和8K Hz，EP升高，和電位（summating potential,SP）升高。這些改變是在注射過(guò)程中短暫出現(xiàn)的，注射時(shí)壓力增加，注射后很快恢復(fù)，注射時(shí)和注射后的壓力變化時(shí)程與內(nèi)淋巴液流動(dòng)一致。此法誘導(dǎo)的急性內(nèi)淋巴積水是由于注射過(guò)程中內(nèi)淋巴壓力改變引起內(nèi)淋巴液生理變化所致，不同于內(nèi)淋巴容積增加引起的慢性內(nèi)淋巴積水。

1.2環(huán)磷酸腺苷調(diào)節(jié)法

最早的內(nèi)淋巴積水模型建立方法之一是向內(nèi)淋巴內(nèi)注射霍亂毒素。Roheim[8]通過(guò)向豚鼠耳蝸中階注射純化的霍亂毒素成功誘導(dǎo)ELH。后來(lái)Lohuis[9]證明內(nèi)淋巴穩(wěn)態(tài)受中階周圍細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)環(huán) 磷 酸 腺 苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）水平調(diào)控，向外淋巴中注射霍亂毒素可誘導(dǎo)ELH，推測(cè)由于毒素激活中階上皮細(xì)胞中腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase,AC）活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，誘導(dǎo)內(nèi)淋巴液大量分泌所致。具體方法：暴露豚鼠耳蝸，在耳蝸上鉆兩小孔，一個(gè)通向鼓階，一個(gè)通向底轉(zhuǎn)前庭階，先通過(guò)鼓階的孔向外淋巴液中灌注人工外淋巴液15min，然后灌注含有牛血清蛋白和霍亂毒素的人工外淋巴液。灌注后4小時(shí)通過(guò)耳蝸組織切片觀察ELH程度。有學(xué)者證實(shí)抗利尿激素、催產(chǎn)素等可以通過(guò)激活A(yù)C，使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，導(dǎo)致ELH[10,11]。此方法建立內(nèi)淋巴積水模型所需時(shí)間短，成功率高，但未進(jìn)一步闡述積水持續(xù)時(shí)間和轉(zhuǎn)歸。

1.3透明質(zhì)酸鹽凝膠蝸?lái)斪⑸浞?/p>

發(fā)生ELH時(shí)，Corti器會(huì)向鼓階移位。Salt[12]通過(guò)向豚鼠耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)緩慢注射透明質(zhì)酸鹽凝膠，建立了內(nèi)淋巴積水模型。注射后可觀察到傳感位點(diǎn)持續(xù)性變化、Corti器向鼓階移動(dòng)。注射時(shí)為了抵抗凝膠從鼓階向耳蝸導(dǎo)水管移動(dòng)，前庭階和內(nèi)淋巴壓力增高，同時(shí)EP升高，這種變化開始于注射時(shí)并持續(xù)40min，注射結(jié)束后立即恢復(fù)。手術(shù)誘導(dǎo)的內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物對(duì)次聲呈現(xiàn)高敏感性，推測(cè)可能由于積水導(dǎo)致耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)前庭階和鼓階的外淋巴通路阻塞所致。此法誘導(dǎo)的內(nèi)淋巴積水模型可以模擬Corti器向鼓階移位，耳蝸內(nèi)部電位變化有助于解釋MD患者對(duì)低頻壓力改變的敏感性。

1.4 腦脊液壓力調(diào)節(jié)法

Walsted A等[13,14]研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)聽神經(jīng)瘤術(shù)后患者術(shù)后2周內(nèi)對(duì)側(cè)聽力在多個(gè)頻率下降大于20dB。術(shù)中腦脊液（cerebrospinal fluid,CSF）丟失，CSF壓力降低，通過(guò)耳蝸導(dǎo)水管傳至外淋巴，導(dǎo)致外淋巴張力減低，繼而內(nèi)淋巴壓力增高，內(nèi)淋巴積水，最終導(dǎo)致聽力敏感性下降。據(jù)此，建立豚鼠模型，于枕骨下切開硬腦膜致CSF流失，CSF壓力降低，內(nèi)淋巴壓力升高，建立內(nèi)淋巴積水模型。Kurz?buch[15]證實(shí)MD合并正常顱壓腦積水（normal pres?sure hydrocephalus,NPH）患者行CSF分流術(shù)后對(duì)CSF壓力降低敏感，可能由此引起聽力下降，因此可以通過(guò)及時(shí)補(bǔ)充丟失的CSF，升高CSF壓力，預(yù)防MD合并NPH患者聽力持續(xù)下降。CSF壓力調(diào)節(jié)法創(chuàng)傷大，不能確保產(chǎn)生前庭癥狀，且為繼發(fā)性內(nèi)淋巴積水，與MD患者表現(xiàn)不吻合。

1.5低頻噪聲暴露法

Hirsh[16]研究發(fā)現(xiàn)暴露于低頻噪聲后，聽閾提高，并且在再次升高前很快恢復(fù)正常。此后Kemp[17,18]證實(shí)，某些情況下低頻噪聲可以導(dǎo)致耳聲發(fā)射及心理物理閾值敏感性增加，并維持在一個(gè)閾值不再提高的響度水平。Kirk DL[19]和Salt[20]在低頻噪聲暴露下建立豚鼠內(nèi)淋巴積水模型，將豚鼠暴露于200Hz、115dB SPL的低頻噪聲環(huán)境中，3min后觀察到膜迷路體積增加大于30%，并在暴露結(jié)束后數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)，ELH時(shí)耳蝸敏感性未受損害。置于低頻噪聲暴露中時(shí)，觀察到EP快速升高，可能由于滲透壓不平衡，Corti器移向鼓階，導(dǎo)致耳蝸敏感性增加。低頻噪聲暴露法可以快速建立內(nèi)淋巴積水模型，缺點(diǎn)是產(chǎn)生的積水不穩(wěn)定。

2 慢性內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型

2.1手術(shù)阻塞內(nèi)淋巴囊法

內(nèi)淋巴囊在內(nèi)淋巴體積調(diào)節(jié)、病理生理學(xué)和電生理學(xué)級(jí)聯(lián)變化中具有重要作用。Portmann G首先提出打開內(nèi)淋巴囊治療MD的方法，1926年他嘗試了第一次手術(shù)，經(jīng)乳突路徑打開內(nèi)淋巴囊，治療伴有極重度眩暈的MD患者，術(shù)后患者報(bào)告眩暈癥狀得到了徹底控制[21]。據(jù)此，1965年，Kimura等[22]采用頂枕入路首次通過(guò)手術(shù)阻塞內(nèi)淋巴囊建立內(nèi)淋巴積水豚鼠模型。具體方法：豚鼠麻醉后作頭皮正中切口，切除枕骨大孔背側(cè)緣至人字縫的枕骨。在小腦處切開硬腦膜，巖骨近橫竇處小龕即內(nèi)淋巴囊中部標(biāo)記，用鉆頭鉆穿前庭導(dǎo)水管，破壞內(nèi)淋巴囊后沿導(dǎo)管方向繼續(xù)追進(jìn)，最后在鉆孔內(nèi)置入骨蠟阻塞內(nèi)淋巴囊和內(nèi)淋巴管，枕骨缺損處填塞明膠海綿，縫合皮膚。術(shù)后數(shù)天到數(shù)周出現(xiàn)前庭膜腫脹、移向前庭階，術(shù)后1月組織切片結(jié)果顯示67%的術(shù)耳出現(xiàn)中、重度ELH。此模型在無(wú)大量毛細(xì)胞死亡和前庭血管紋損害的情況下，誘導(dǎo)出明顯的ELH。隨后的功能學(xué)研究顯示，低頻刺激時(shí)耳蝸微音電位降低，可能與內(nèi)淋巴液中Ca2+增加有關(guān)[23,24]。后經(jīng)學(xué)者證實(shí)，此模型可用于研究與人類MD有關(guān)的ELH[25-27]。在此基礎(chǔ)上，Konishi[28]創(chuàng)立了后顱窩硬膜外入路內(nèi)淋巴囊阻塞術(shù)。豚鼠麻醉后行顱頂正中切口，磨去術(shù)側(cè)枕骨，暴露硬腦膜及乙狀竇，剝離硬腦膜至乙狀竇前緣，在前庭導(dǎo)水管顱內(nèi)開口處切斷內(nèi)淋巴囊，再用微電鉆沿前庭導(dǎo)水管方向鉆入，破壞內(nèi)淋巴囊骨內(nèi)部和部分內(nèi)淋巴管，最后填充骨蠟、明膠海綿，縫合切口。術(shù)后觀察到耳蝸微音電位和球囊電位降低，這與上面提到的cAMP調(diào)節(jié)法不同，說(shuō)明ELH的電化學(xué)效應(yīng)可隨誘導(dǎo)因素不同而升高或降低。后來(lái)，Dunnebier[29]通過(guò)手術(shù)分離乙狀竇和內(nèi)淋巴囊骨外部，其間填充明膠海綿，使得內(nèi)淋巴囊末端中度纖維化，阻礙靜脈血回流至乙狀竇，導(dǎo)致ELH。

組織病理學(xué)變化首先表現(xiàn)為外毛細(xì)胞的靜纖毛減少，從頂轉(zhuǎn)開始，隨后出現(xiàn)內(nèi)毛細(xì)胞減少，頂轉(zhuǎn)為著[30,31]。外側(cè)壁首先出現(xiàn)螺旋韌帶纖維細(xì)胞的改變，隨后可觀察到邊緣細(xì)胞間水腫，邊緣細(xì)胞和中間細(xì)胞萎縮，囊泡增加[32]。擴(kuò)張的前庭膜間皮細(xì)胞消失、上皮細(xì)胞增加，與人類ELH類似[33]。ELH晚期表現(xiàn)為螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少，首先累及頂轉(zhuǎn)[34,35]。

手術(shù)阻塞內(nèi)淋巴囊法優(yōu)點(diǎn)是成功率高，可達(dá)100%[36]。但此法存在很多局限性：首先手術(shù)操作技術(shù)要求嚴(yán)格，且手術(shù)破壞性大，動(dòng)物易感染致死。其次，不能確保引起前庭癥狀[37]。再次，手術(shù)阻塞后內(nèi)淋巴囊完全失去功能，與MD患者表現(xiàn)相悖。另外，此模型只能解釋存在顱內(nèi)解剖異常影響內(nèi)淋巴回流的現(xiàn)象，臨床上很多患者并無(wú)解剖異常，此模型并非MD的生理模型。

2.2兩期法

鑒于手術(shù)阻塞內(nèi)淋巴囊法的局限性，在此基礎(chǔ)上，研究人員開始探索新的動(dòng)物模型建立方法。1997年，Dunnebier[29]將部分內(nèi)淋巴囊功能障礙與急性應(yīng)激誘發(fā)內(nèi)淋巴生成相結(jié)合，建立了兩期法內(nèi)淋巴積水豚鼠模型。方法：豚鼠麻醉后經(jīng)顱后窩硬膜外徑路暴露內(nèi)淋巴囊，打開部分內(nèi)淋巴囊，在不損傷骨內(nèi)部的情況下，分離其遠(yuǎn)端部，輕度破壞最遠(yuǎn)端造成部分內(nèi)淋巴囊功能障礙。術(shù)后第3周起腹腔注射醛固酮，連續(xù)5天，刺激血管紋上Na+/ K+-ATP酶，K+分泌增多，使得內(nèi)淋巴液生成速率加快，導(dǎo)致內(nèi)淋巴生成過(guò)多，3周后通過(guò)耳蝸組織切片觀察積水程度。Ten[38]研究證實(shí)部分內(nèi)淋巴囊功能障礙也可導(dǎo)致ELH，醛固酮可能會(huì)加重ELH。兩期法是較為理想的動(dòng)態(tài)模型，部分阻塞內(nèi)淋巴囊導(dǎo)致內(nèi)淋巴吸收減少，此法產(chǎn)生的ELH主要影響耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)致低頻聽力下降；腹腔注射醛固酮誘發(fā)內(nèi)淋巴產(chǎn)生增多，影響耳蝸底轉(zhuǎn)致高頻聽力下降，可以解釋MD手術(shù)刺激致低頻聽力下降、藥物注射致高頻聽力下降等癥狀。

2.3系統(tǒng)性血管加壓素法/電灼內(nèi)淋巴囊后注射去氨加壓素

血管加壓素(vasopressin,VP)是由下丘腦視上核和室旁核神經(jīng)細(xì)胞分泌的九肽激素，以神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒形式經(jīng)下丘腦—垂體束到達(dá)神經(jīng)垂體后葉后釋放出來(lái)，其主要作用是提高遠(yuǎn)曲小管和集合管對(duì)水的通透性，促進(jìn)水的吸收。Mees[39]研究證實(shí)耳蝸內(nèi)存在VP受體，分為V1和V2兩種亞型。1993年Agre[40]發(fā)現(xiàn)水通道蛋白(aquaporin,AQP)，后來(lái)Nielsen[41]證實(shí)水重吸收的精確調(diào)節(jié)取決于AQP2，在VP刺激下，滲透壓可以快速改變。V2受體存在于耳蝸外側(cè)壁和內(nèi)淋巴囊，通過(guò)控制AQP的表達(dá)調(diào)節(jié)耳蝸內(nèi)水流運(yùn)動(dòng)[42]。Kitano等[43-47]證實(shí)VP與ELH密切相關(guān)，VP-AQP2激活導(dǎo)致內(nèi)淋巴液產(chǎn)生過(guò)多。Taked通過(guò)皮下埋植VP微泵1周，成功誘導(dǎo)豚鼠內(nèi)淋巴積水模型，成功率100%[45]。去氨加壓素是V2受體激動(dòng)劑，激活A(yù)C使得細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，引起血管加壓素樣可逆的內(nèi)淋巴電位降低。Naoya Egami[48]將豚鼠麻醉后，行背中線頭皮切口，去除左側(cè)枕骨，經(jīng)硬膜外徑路暴露內(nèi)淋巴囊，通過(guò)雙極電凝燒灼內(nèi)淋巴囊骨外部阻塞內(nèi)淋巴囊，然后給予去氨加壓素，誘導(dǎo)耳蝸和球囊重度積水，并觀察到平衡障礙和自發(fā)性眼震。研究中還揭示了眩暈發(fā)作的機(jī)理：通過(guò)激活VP-AQP2系統(tǒng)導(dǎo)致內(nèi)淋巴液生成過(guò)多，同時(shí)外淋巴向內(nèi)淋巴回流增多，導(dǎo)致內(nèi)淋巴壓力突然變化，存在慢性內(nèi)淋巴功能障礙時(shí)，內(nèi)淋巴壓力突然增高引起內(nèi)淋巴液吸收減少，導(dǎo)致MD相關(guān)臨床癥狀。通過(guò)VP誘導(dǎo)豚鼠ELH成功率高，所需時(shí)間短，但是關(guān)于此法誘導(dǎo)的ELH轉(zhuǎn)歸尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

2.4脂多糖、醛固酮聯(lián)合腎上腺素法

脂多糖是從大腸桿菌中提取的一種毒素，可以誘發(fā)免疫反應(yīng)，引起非感染性迷路炎。醛固酮是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的鹽皮質(zhì)激素，通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟對(duì)鈉離子的重吸收，維持水鹽平衡。Ta?kumida M[49]通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用脂多糖和醛固酮誘導(dǎo)出輕到中度ELH，但未模擬出前庭功能紊亂癥狀，因此加用腎上腺素。腎上腺素通過(guò)調(diào)節(jié)血管紋邊緣細(xì)胞K+分泌，加重內(nèi)淋巴囊骨內(nèi)部擴(kuò)張。具體方法：連續(xù)5天左側(cè)鼓室內(nèi)注射脂多糖，腹腔注射醛固酮，并在鼓室內(nèi)注射腎上腺素，誘發(fā)前庭功能障礙。注射腎上腺素后5min內(nèi)小鼠出現(xiàn)前庭功能障礙癥狀，最嚴(yán)重時(shí)難以維持姿勢(shì)穩(wěn)定，向左側(cè)（注射側(cè)）傾斜、不能游泳、走路時(shí)趨向左轉(zhuǎn)，同時(shí)有暈厥，紅外Frenzel眼鏡可記錄到明顯的眼震（向右側(cè)-非注射側(cè)）。注射后10min癥狀最明顯，持續(xù)30min后逐漸恢復(fù)，1h后前庭功能恢復(fù)正常。觀察期內(nèi)未見共濟(jì)失調(diào)和肌張力減弱。Miller JM[50]研究發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用腎上腺素后，耳蝸血流立即下降至基線水平的20%并維持此水平5min，推測(cè)內(nèi)耳血流量銳減導(dǎo)致前庭功能障礙。此模型的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單，無(wú)需開顱手術(shù)，對(duì)腦組織損傷小，可以分別單獨(dú)評(píng)價(jià)內(nèi)淋巴系統(tǒng)和內(nèi)淋巴囊，缺點(diǎn)是使用藥物種類多，難以排除內(nèi)源性相關(guān)因素干擾。

2.5免疫法

內(nèi)淋巴囊是內(nèi)耳的主要免疫應(yīng)答部位，近年來(lái)，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)ELH與內(nèi)淋巴囊局部免疫反應(yīng)關(guān)系密切。鑰孔嘁血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemo?cyanin,KLH）是T細(xì)胞依賴性抗原，具有高度免疫原性。Watanabe[51]先誘導(dǎo)豚鼠全身KLH致敏，2周后再行全身加強(qiáng)免疫，然后內(nèi)淋巴囊內(nèi)注射KLH行局部免疫。通過(guò)耳蝸組織切片觀察積水程度，內(nèi)淋巴囊免疫后第2天積水發(fā)生率即達(dá)100%，并持續(xù)至第7天，隨后積水程度逐漸下降，2個(gè)月后積水發(fā)生率又逐漸升高。前庭膜擴(kuò)張，移向前庭階，檢測(cè)到從底轉(zhuǎn)到頂轉(zhuǎn)的一氧化氮合酶免疫反應(yīng)。高水平一氧化氮可導(dǎo)致內(nèi)耳功能障礙，通過(guò)免疫組化檢測(cè)豚鼠耳蝸內(nèi)誘生性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耳蝸外側(cè)壁、Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)iNOS表達(dá)增加，推測(cè)iNOS在ELH中起調(diào)節(jié)作用。免疫法的優(yōu)點(diǎn)是成功率高，ELH隨時(shí)間變化有可逆部分，也有不可逆部分，可模擬MD反復(fù)波動(dòng)性發(fā)作。局限性是觀察周期長(zhǎng)，模型不穩(wěn)定，外淋巴液中產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞，而MD患者外淋巴液中無(wú)炎性細(xì)胞。

2.6 Phex基因小鼠模型

基因突變小鼠模型廣泛用于研究?jī)?nèi)耳疾病。Lorenz[52]于2004年首次闡述了PhexHyp-Duk基因突變鼠，此鼠在Phex有功能喪失性突變。Phex與X連鎖低磷酸鹽血癥性佝僂病相關(guān)，半合子雄性小鼠（PhexHyp-Duk/Y）會(huì)出現(xiàn)一系列表型，包括骨質(zhì)增厚、ELH和聽力損失，并伴有前庭功能障礙癥狀：搖頭、步態(tài)不穩(wěn)和/或轉(zhuǎn)圈行為。雌性小鼠也會(huì)出現(xiàn)周期性轉(zhuǎn)圈行為，但雄性小鼠表型更明顯、更穩(wěn)定，且已被Phex基因分型所證實(shí)，因此選擇攜帶Phex?Hyp-Duk等位基因雄性小鼠用于研究ELH。研究發(fā)現(xiàn)，5月齡小鼠耳蝸管層面可見：鼓階出現(xiàn)沉積物，耳蝸周圍骨質(zhì)增厚、內(nèi)淋巴管阻塞和ELH，內(nèi)淋巴管阻塞與周圍骨質(zhì)增厚有關(guān)。但內(nèi)淋巴管阻塞不是ELH的先決條件，因?yàn)橐吧褪蟀l(fā)生積水時(shí)無(wú)內(nèi)淋巴管阻塞。Semaan等提出假說(shuō)，ELH可能與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化有關(guān)[53]。

PhexHyp-Duk基因突變鼠出生后21-30天開始出現(xiàn)聽力損失。病理和形態(tài)學(xué)檢查顯示：聽功能退化多始于出生后3-4周，低頻聽力損失早于高頻聽力損失。大部分螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退化后，耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)毛細(xì)胞相對(duì)保留，與MD患者表現(xiàn)一致[26,54]。神經(jīng)元和毛細(xì)胞死亡是晚期事件，不是聽力損失的原因。未觀察到明顯的血管紋病理學(xué)改變，表明最初的聽力損失與血管紋無(wú)關(guān)，但血管紋正常并不代表蝸內(nèi)電位正常，為評(píng)估內(nèi)耳血管紋狀態(tài)需在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量蝸內(nèi)電位。

PhexHyp-Duk基因突變鼠用于研究ELH的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)須手術(shù)、自發(fā)產(chǎn)生積水，表型可重復(fù)觀測(cè)，基因檢測(cè)簡(jiǎn)便易行。亦存在許多局限性：首先記錄發(fā)作性眩暈困難。其次根據(jù)前庭膜腫脹程度判斷ELH程度，不能準(zhǔn)確反映內(nèi)淋巴穩(wěn)態(tài)失調(diào)的發(fā)生起點(diǎn)和嚴(yán)重程度，小鼠生存期為2年，MD患者通常在30歲以上出現(xiàn)內(nèi)淋巴積水，難以等同。再次，其進(jìn)行性聽力損失與MD波動(dòng)性聽力損失不一致，除ELH外，內(nèi)耳和中耳骨質(zhì)異常也可引起聽力損失，中耳炎易感性使得患耳閾值增加10-15dB，加重聽力損失程度[55]?；蛲蛔儗?duì)其他系統(tǒng)的影響尚需進(jìn)一步研究。

3 思考與展望

MD是常見的內(nèi)耳疾病，導(dǎo)致發(fā)作性眩暈、波動(dòng)性感音神經(jīng)性聽力損失、耳鳴、耳悶脹感，影響患者生活質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)可以致殘。MD病因不明，唯一明確的是其病理改變?yōu)镋LH。MD沒(méi)有特異性生物學(xué)標(biāo)志物，臨床診斷依據(jù)癥狀診斷和排除診斷，實(shí)驗(yàn)室診斷和臨床治療針對(duì)發(fā)現(xiàn)和控制ELH。內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型有助于了解ELH對(duì)內(nèi)耳解剖和功能的影響，為研究MD的發(fā)病機(jī)制、病理表現(xiàn)和治療方法提供有利條件。綜上所述，內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型建立方法多種多樣，各個(gè)模型雖有自身的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，但也都存在一定的局限性。迄今，無(wú)一種動(dòng)物模型與MD患者的癥狀、體征和病理改變完全吻合，并非所有模型都能模擬波動(dòng)性聽力損失和前庭癥狀。除PhexHyp-Duk基因突變鼠以外，其他模型均是通過(guò)手術(shù)、聲創(chuàng)傷或藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生ELH，與MD患者自發(fā)性發(fā)生ELH不符。PhexH?yp-Duk基因突變鼠雖然自發(fā)產(chǎn)生ELH和聽力損失，但中耳炎、內(nèi)耳和中耳骨質(zhì)異常也可引起聽力損失，且基因突變可對(duì)多個(gè)系統(tǒng)造成影響，難以排除其他系統(tǒng)干擾。目前所有模型均是在處死動(dòng)物后，通過(guò)耳蝸組織切片判定模型是否制作成功，至今尚無(wú)在體研究ELH的特異方法，不利于建模成功后開展進(jìn)一步研究。研究者應(yīng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)條件，結(jié)合模型建立成功率和所需時(shí)間選擇合適的方法。此外，ELH并非MD所獨(dú)有，創(chuàng)傷、內(nèi)淋巴囊腫瘤、腦膜瘤、聽神經(jīng)瘤和復(fù)發(fā)性多軟骨炎均可以導(dǎo)致繼發(fā)性內(nèi)淋巴積水。進(jìn)一步深入研究MD發(fā)病機(jī)制，排除內(nèi)源性和外源性干擾因素建立簡(jiǎn)便可行的內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型或在體研究方法，建立更加客觀的眩暈、耳鳴、耳脹滿感評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)，是今后需進(jìn)一步完善、努力的方向。

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Research Progress inAnimal Models of Endolymphatic Hydrops DING Yujing,LIU Junxiu,MAFurong

DING Yujing,LIU Junxiu,MA Furong
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Peking University Third Hospital,Beijing,100191,China Corresponding author:MA Furong Email:furongma@126.com

Meniere’s disease is an inner ear disorder characterized by recurrent episodes of rotational vertigo,fluctuating sensorineural hearing loss,and tinnitus,with or without ear fullness.The pathogenesis of Meniere’s disease is unclear.The typical pathological feature of Meniere’s disease is endolymphatic hydrops,although the precise mechanism is not fully understood.Studies have confirmed that endolymphatic sac plays an important role in endolymph volume regulation,and the cascade of histopathological and electrophysiological changes associated with chronic endolymphatic hydrops.Using the animal model of endolymphatic hydrops to investigate variable aspects of the disease(e.g., how hydrops occurs,its relationship with pathology and electrophysiology changes,how it affects the inner ear function,and so on)would be helpful to guide the treatment of the disease.The periodic episodes of Meniere's disease suggest that controlling the endolymphatic hydrops might be the key to maintain the inner ear homeostasis and to avoid progression of the disease.

Meniere’s Disease;Endolymphatic hydrops;Animal model

R764.33

A

1672-2922（2017）01-99-6

2016-11-27審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.019

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21272018）；國(guó)家重大研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（91213305），首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2016-2-4094）。

丁玉靜，博士，住院醫(yī)師，研究方向:耳鼻咽喉科學(xué)基礎(chǔ)研究

馬芙蓉，Email:furongma@126.com