寬頻帶白噪聲暴露對巴馬香豬和豚鼠聽力損傷的影響

侯琨吳南塞娜王方園唐朝穎史詢貝李佳楠陳立偉楊仕明

1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室（北京100853）2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所（福州350005）

·基礎(chǔ)研究·

寬頻帶白噪聲暴露對巴馬香豬和豚鼠聽力損傷的影響

侯琨1吳南1塞娜1王方園1唐朝穎1史詢貝2李佳楠1陳立偉1楊仕明1

1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室（北京100853）2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所（福州350005）

目的 通過120dB SPL寬頻帶白噪聲對巴馬香豬和豚鼠各進行單次3小時的暴露，觀察比較該種噪聲對兩種模型動物聽力損傷的特點，找到更適用于研究噪聲性聽力損傷的動物模型。方法選取8只6月齡ABR聽閾正常的巴馬香豬，和8只5～6周齡ABR聽閾正常的豚鼠，設(shè)置4個ABR測聽記錄點：噪聲暴露前，噪聲暴露后即刻（P0）、1天（P1）、7天（P7）。全部測聽結(jié)束后，取材制作耳蝸標(biāo)本，進行掃描電鏡觀察形態(tài)。結(jié)果通過統(tǒng)計學(xué)分析，豚鼠組在120dB SPL寬頻帶白噪聲暴露后即刻的ABR閾值與暴露1天的ABR閾值具有明顯差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義，而巴馬香豬組則無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。豚鼠組在噪聲暴露前和噪聲暴露后7天的ABR閾值無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而巴馬香豬組卻有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。相對于豚鼠，巴馬香豬耳蝸標(biāo)本掃描電鏡提示了更多的纖毛異常。結(jié)論120dB SPL寬頻帶白噪聲暴露會對巴馬香豬和豚鼠造成一定程度的聽力損傷。其中巴馬香豬較豚鼠表現(xiàn)更為明顯的聽力損失，且毛細(xì)胞出現(xiàn)了更多的病理改變，由此本研究表明在120dB SPL寬頻帶白噪聲單次暴露3小時的條件下，巴馬香豬是一個更適于白噪聲與聽力損傷的研究的動物模型，從而可以更好地為噪聲性耳聾提供動物模型。

白噪聲；巴馬香豬；豚鼠；動物模型；毛細(xì)胞

Foundation item：the National High-tech R&D Program of China for Young Scientists(2014AA020510);the National Basic Research Program of China(973 Program)(#2012CB967900);Innovation Driving Power Project of China Association for science and technology（2016CXQD01）.

Authors would like to declare no conflicts of interest.

噪聲性耳聾（noise-induced deafness），亦可稱之為噪聲性聽力損傷（noise-induced hearing loss），作為對影響現(xiàn)當(dāng)代社會人類健康的一項疾病[1]，其主要誘因為長期暴露于損害性噪聲環(huán)境中，導(dǎo)致以內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷為主要表征的進行性感音神經(jīng)性耳聾[2-4]。隨著近年來科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，對于極重度感音神經(jīng)性耳聾，人工耳蝸治療已經(jīng)表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。而關(guān)于人工耳蝸植入是否適用于噪聲性耳聾，目前還沒有較為完善的實驗動物研究，主要原因受限于噪聲研究動物模型的體型大小[5,6]。

生物醫(yī)學(xué)研究的進展在很大程度上依賴于運用動物模型進行實驗和運用動物模型對臨床假說的實驗驗證。中國巴馬香豬是一種重要的經(jīng)濟豬品種。因其平均壽命超過十年，有利于實驗的長期進行與觀察，且其解剖結(jié)構(gòu)和病理生理特性與人類非常相似，尤其是內(nèi)耳各器官的解剖結(jié)構(gòu)與人類很相似，體積相對較大，在形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)研究方面更加直觀，被用于多種生物醫(yī)藥的研究中[7-9]。哺乳綱嚙齒目豚鼠科豚鼠由于引進時間較長，飼養(yǎng)繁殖技術(shù)成熟，繁殖率高，遺傳背景清楚，動物體型較小，易操作，也被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中的各個領(lǐng)域[10-12]。

因此本研究以巴馬香豬和豚鼠為實驗對象，比較在120dB SPL白噪聲暴露3小時后對兩種動物的聽力的影響，以及暴露后兩者動物聽力的恢復(fù)情況，以期明確巴馬香豬除解剖學(xué)外，其生理學(xué)特征是否也更適于成為噪聲性聽力損傷治療研究的動物模型。

1 材料與方法

1.1實驗分組

選取6月齡，體重10～20kg雄性巴馬香豬8只（由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供），外耳道潔凈，實驗前進行聽性腦干誘發(fā)電位（Auditory Brain?stem Response,ABR）聽閾檢查，篩選出ABR聽閾正常的巴馬香豬8只，隨機分成一個形態(tài)對照組，三個實驗組，設(shè)置4個ABR測聽記錄點：噪聲暴露前，噪聲暴露后即刻（P0）、1天（P1）、7天（P7），對照組為各噪聲組噪聲暴露前巴馬香豬本身。選取5～6周齡，體重140～150g普通級雄性豚鼠（由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供），排除中耳及內(nèi)耳疾病，并進行ABR聽閾檢測，篩選出ABR聽閾正常的豚鼠8只。設(shè)置四個測聽時間點：噪聲暴露前，噪聲暴露后即刻（P0）、1天（P1）、7天（P7）。對照組為各噪聲組噪聲暴露前豚鼠本身。所有實驗操作均得到中國人民解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 噪聲暴露

采用120dB SPL的寬頻帶白噪聲（broad-band white noise）分別對ABR聽閾正常的巴馬香豬和豚鼠進行單次3h的暴露。噪聲暴露期間，實驗動物可在籠中自由活動，揚聲器置于籠子正上方，每次僅進行一只實驗動物的暴露。噪聲暴露前采用標(biāo)準(zhǔn)聲級計對聲音強度進行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)時聲級計探頭置于籠內(nèi)進行，聲音在籠子內(nèi)各部位的聲強變化小于1dB。暴露后實驗動物送至實驗動物中心進行分籠飼養(yǎng)至相應(yīng)時間點。

1.3 ABR聽閾檢測

采用美國TDT測聽設(shè)備對實驗動物進行ABR閾值檢測。每只實驗組實驗動物在噪聲暴露前及噪聲暴露后分別進行一次ABR閾值檢測，測聽過程在隔音屏蔽室進行。巴馬香豬使用3%戊巴比妥（1mg/kg）耳緣靜脈注射進行麻醉，豚鼠使用3%戊巴比妥（1mg/kg）腹腔注射進行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于實驗動物兩側(cè)耳廓前緣連線中點皮下，參考電極置于測試耳耳垂，接地電極置于對側(cè)耳耳垂，測試耳機距外耳道口約0.5cm，檢測實驗動物雙耳ABR閾值。刺激聲采用短聲（Click），帶通濾波為300～3000 Hz，疊加1024次，掃描10ms。刺激聲強度從90dB開始，以10dB逐漸遞減，直至檢測不出重復(fù)的ABR波形，再向上增強5dB，直至能檢測出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強度即為實驗動物的聽閾。測聽時注意動物保溫。

1.4掃描電鏡耳蝸標(biāo)本制備

7天測聽結(jié)束后，麻醉處死實驗動物，迅速將其斷頭，快速取出耳蝸，將耳蝸放入盛有2.5%戊二醛溶液的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下，用細(xì)針在蝸頂鉆孔，并開放圓窗和卵圓窗。用2.5%戊二醛溶液自蝸頂進行灌流，沖出淋巴液。將已灌流的耳蝸標(biāo)本置于2.5%戊二醛溶液溶液中繼續(xù)固定，4℃冰箱過夜。解剖顯微鏡下仔細(xì)剝離，暴露基底膜，鋨酸處理，脫水，干燥，真空噴鍍。掃描電鏡下觀察內(nèi)外毛細(xì)胞的變化。

1.5 統(tǒng)計分析

為了減少個體差異及實驗誤差等因素對實驗動物本底聽閾的影響，故本實驗采用自身對照的配對設(shè)計思路，即將每組實驗動物暴露后即刻的ABR閾值與暴露1天的ABR閾值進行配對，噪聲暴露前和噪聲暴露后7天的ABR閾值進行配對，實驗動物的ABR閾值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，資料分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，進行分析值分析選用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1噪聲暴露后豚鼠和巴馬香豬的ABR閾值變化情況

表1在120dB SPL寬頻帶白噪聲噪聲暴露3小時后，豚鼠和巴馬香豬組均在不同頻率上出現(xiàn)了聽力損失，但1天后的ABR檢測提示，豚鼠的聽力有所恢復(fù)，暴露后即刻與1天后的各頻率ABR閾值比較，P值均小于0.05，即在暴露后1天內(nèi)，豚鼠的聽力恢復(fù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。而巴馬香豬暴露后即刻與1天后各頻率閾值對比發(fā)現(xiàn)，P值均遠(yuǎn)大于0.05，說明在暴露1天內(nèi)，巴馬香豬無統(tǒng)計學(xué)意義的聽力恢復(fù)。

表1 巴馬香豬噪聲暴露前后ABR閾值（±s，n=16，dB SPL）Table 1 ABR thresholds of miniature pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）

表1 巴馬香豬噪聲暴露前后ABR閾值（±s，n=16，dB SPL）Table 1 ABR thresholds of miniature pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）

*P＜0.05 means statistic difference

before noise Seven days after t value P value Click 39.67±2.21 49.00±7.12 -5.0021＜0.0001*2 kHz 38.00±3.56 45.33±6.45 -3.9798 0.0004*4 kHz 39.33±4.42 56.00±10.52 -5.8436＜0.0001*8 kHz 37.67±6.67 51.67±9.07 -4.9740＜0.0001*16 kHz 38.67±3.86 48.67±6.45 -5.3397＜0.0001*24 kHz 40.33±4.64 51.67±5.37 -6.3915＜0.0001*24 kHz 68.67±4.27 68.00±5.72 0.3755 0.3550 Immediately after one day after t value P value Click 69.00±2.71 68.00±3.56 0.8940 0.1892 2 kHz 68.33±3.94 67.33±5.44 0.5955 0.2780 4 kHz 70.67±4.03 70.00±4.83 0.4260 0.3366 8 kHz 70.00±2.58 68.67±4.27 1.0664 0.1474 16 kHz 67.67±4.03 66.33±5.31 0.8041 0.2138

表2 豚鼠噪聲暴露前后ABR閾值（±s，n=16，dB SPL）Table 2 ABR thresholds of guinea pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）

表2 豚鼠噪聲暴露前后ABR閾值（±s，n=16，dB SPL）Table 2 ABR thresholds of guinea pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）

*P＜0.05 means statistic difference

before noise Seven days after t value P value Click 22.00±5.11 24.33±4.83 -1.3255 0.0975 2 kHz 31.33±4.92 32.00±4.15 -0.4164 0.3401 4 kHz 25.67±3.76 26.00±5.57 -0.1964 0.4228 8 kHz 22.83±2.58 23.33±4.63 -0.3773 0.3543 16 kHz 30.67±3.16 32.33±8.21 -0.7548 0.2281 24 kHz 30.33±2.76 31.67±6.21 -0.7887 0.2182 24 kHz 86.00±8.13 36.00±5.62 20.2360＜0.0001*Immediately after one day after t value P value Click 75.00±6.19 31.67±5.67 20.6472＜0.0001*2 kHz 82.33±7.05 40.67±6.47 17.4148＜0.0001*4 kHz 85.67±6.80 37.33±5.92 21.4466＜0.0001*8 kHz 83.33±6.51 30.67±5.03 25.6040＜0.0001*16 kHz 86.67±7.97 36.67±5.68 20.4355＜0.0001*

表2對比兩種動物噪聲暴露前與暴露后七天的ABR閾值發(fā)現(xiàn)，豚鼠在噪聲暴露后，7天的正常飼養(yǎng)環(huán)境恢復(fù)后，其聽力損失與暴露前各頻率對比，P值均大于0.05，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即7天的恢復(fù)使豚鼠的聽力與噪聲暴露前無明顯差異。而巴馬香豬在7天后，其聽力損失與暴露前對比，P值均小于0.05，具有統(tǒng)計學(xué)差異，即巴馬香豬在7天的恢復(fù)后，其聽力依然較暴露前有損失。

表3中我們可以看到，在噪聲暴露后1天和7天后，巴馬香豬的click-ABR閾移占暴露后即刻閾移均明顯大于豚鼠，即在1天和7天的正常環(huán)境飼養(yǎng)后，巴馬香豬的聽力損失依然保持著噪聲暴露帶來的聽力損失。

2.2噪聲暴露后豚鼠和巴馬香豬的毛細(xì)胞損傷情況

通過對豚鼠和巴馬香豬暴露后第7天測聽結(jié)束取耳蝸制作標(biāo)本，進行掃描電鏡進行對比觀察。圖2中的圖A為豚鼠耳蝸基底膜，依次為底、中、頂回，僅見少數(shù)纖毛脫落，并未觀察到明顯的毛細(xì)胞纖毛損傷，而在圖B，即巴馬香豬耳蝸標(biāo)本上，在頂、中、底各回均觀察到了明顯的毛細(xì)胞病理改變。

圖1 豚鼠與巴馬香豬耳蝸靜纖毛掃描電鏡對比圖Fig.1 scanning electron microscopic observation of the stereocilia in guinea pig cochlea and bama miniature pig

3 討論

人類疾病的研究通常很復(fù)雜，臨床研究得到的經(jīng)驗與數(shù)據(jù)往往難以在疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律上進行深入研究，而實驗動物模型的出現(xiàn)，可以更加有效地幫助人類認(rèn)識疾病，研究疾病，研究防治策略[13,14]。在先前的耳聾研究中，通常采用嚙齒類動物作為動物模型[15,16]，但是其個體小，耳蝸解剖結(jié)構(gòu)與人類差距較大，無法進行人工耳蝸植入等相關(guān)治療研究。而小型豬無論在進化關(guān)系上，還是解剖學(xué)結(jié)構(gòu)上都與人類擁有較強的相似性[17-19]，且在倫理學(xué)及生物學(xué)數(shù)量上，都更為適合，所以小型豬可能是最佳的耳科領(lǐng)域研究動物模型。

本研究擬通過對巴馬香豬及豚鼠進行白噪聲造模，比較噪聲后聽力ABR閾值的恢復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)巴馬香豬在噪聲后聽力閾值發(fā)生明顯變化，即在本實驗噪聲條件刺激下，巴馬香豬產(chǎn)生了更加明顯的聽力損失。而在噪聲后不同時段，通過對比白噪聲暴露后即刻的ABR閾值與暴露1天的ABR閾值以及噪聲暴露前和噪聲暴露后7天的ABR閾值兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，可以發(fā)現(xiàn)豚鼠在120dB SPL寬頻帶白噪聲單次暴露3小時的條件下，比巴馬香豬更快、更好地恢復(fù)聽力，這對我們實驗研究動物造模是不利的，在該條件噪聲下，巴馬香豬可以較久地維持噪聲暴露后帶來的聽力損失，其閾移隨時間增加，與噪聲暴露即刻相比，所占百分比恢復(fù)慢，選擇巴馬香豬造模，可以等到更持久穩(wěn)定的動物模型。

此外，豬和人類在出生后即有聽力，人的聽覺頻率范圍大致在20Hz-20KHz，而豬的聽覺頻率范圍較人的更廣，高頻可達48KHz水平，而鼠類在高頻頻率可達到100KHz[2,6]，通過對比可以發(fā)現(xiàn)，豬作為聽覺研究動物模型，其聽覺頻率范圍與人類較嚙齒類動物更為接近。

我們的研究對比在聽力暴露后7天，對ABR進行測聽結(jié)束后，迅速處死取材，制作掃描電鏡標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)豚鼠內(nèi)外毛細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯損傷，而巴馬香豬內(nèi)外毛細(xì)胞可見明顯損傷。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)豬的基底膜同樣具有四排毛細(xì)胞，此外，在掃描電鏡下可觀察到毛細(xì)胞從底轉(zhuǎn)到頂磚螺旋式排列，與人類極為相似。而豬的耳蝸大小也與人類及其接近，這為聽覺植入的臨床研究提供了非常理想的動物模型，目前已經(jīng)有諸多關(guān)于人工聽骨、振動聲橋、人工耳蝸植入的相關(guān)研究報道。此外也為臨床醫(yī)生的耳外科手術(shù)操作教學(xué)提供了重要的實驗動物。

表3 噪聲暴露后不同時刻click-ABR閾移比較（，n=16，dB SPL）Table 3 comparison of click-ABR thresholds shifts（TF）after exposure in different time points（，n=16，dB SPL）

表3 噪聲暴露后不同時刻click-ABR閾移比較（，n=16，dB SPL）Table 3 comparison of click-ABR thresholds shifts（TF）after exposure in different time points（，n=16，dB SPL）

Immediately TF Percentage Immediately 1day after Percentage 1day after 7day after Percentage 7day after miniature pigs guinea pigs 30.33 53.00 100% 100% 29.33 9.67 96.70% 18.25% 10.33 2.33 34.06% 4.40%

本實驗從電生理及形態(tài)上對比了巴馬香豬及豚鼠對噪聲的聽力學(xué)損傷及形態(tài)損傷對比，表明巴馬香豬在本研究條件下，相比豚鼠，可以得到更加穩(wěn)定、理想的噪聲性耳聾動物模型，可以更高效地完成實驗動物造模，為相關(guān)治療研究創(chuàng)造實驗動物。

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Effects of White Noise Exposure on Hearing in Bama Miniature Pigs and Guinea Pigs

HOU Kun1，WU Nan1,SAI Na1,WANG Fangyuan1,TANG Chaoying1,SHI Xunbei2, LI Jianan1,CHEN Liwei1,YANG Shiming1
1 Department Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Institute of Otolaryngology, Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China 2 Department of Otolaryngology,Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China Corresponding author:YANG Shiming Email:yangsm301@263.net

Objective To find a more suitable animal model for investigating the noise-induced hearing loss by comparing the effects of 120 dB SPL white noise exposure for three hours on the hearing in bama miniature pigs and guinea pigs.Methods Auditory brainstem response(ABR)in 8 bama miniature pigs and 8 guinea pigs with normal hearing was tested before exposure,immediately(P0),1 day(P1)and 7 days(P7)after exposure.Cochlear specimens were observed using scanning electron microscopy.Results The ABR threshold showed a statistically significant difference between the immediate group and P1 group in guinea pigs,but not in bama miniature pigs.There was a statistically significant difference between the immediate group and P7 group in bama miniature pigs,but not in guinea pigs.Furthermore,the bama miniature pigs showed more severe cochlear hair cell damages than that in guinea pigs.Conclusions The bama miniature pig cochleae are more vulnerable to 120 dB SPL white noise exposure,with more profound hearingloss and more severe pathological changes.The results suggest that bama miniature pig could be a more suitable animal model for noise-induced hearing loss study.

White noise;Bama miniature pig;Guinea pig；Animal model;Hair cell

R764

A

1672-2922（2017）01-83-5

2016-12-22審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.017

國家863青年科學(xué)家項目(2014AA020510)；國家973計劃重大科學(xué)研究計劃干細(xì)胞項目（2012CB967900)；中國科協(xié)創(chuàng)新驅(qū)動助力工程（2016CXQD01）

侯琨，在讀碩士，研究方向:耳科學(xué)

侯琨和吳南為并列第一作者

楊仕明，Email:yangsm301@263.net