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    合理應用藥物敏感性試驗提高耐多藥結核病診斷率

    2017-01-12 20:22:27吳雪瓊張俊仙
    中國防癆雜志 2017年3期
    關鍵詞:抗結核結核結核病

    吳雪瓊 張俊仙

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    ·專家論壇·

    合理應用藥物敏感性試驗提高耐多藥結核病診斷率

    吳雪瓊 張俊仙

    耐多藥結核病(MDR-TB)是目前臨床結核病治療的難題之一,快速檢出耐多藥的結核分枝桿菌(MTB),指導臨床選擇有效抗結核藥物,制定合理的化療方案,是控制MDR-TB的關鍵。目前抗結核藥物的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法主要有下列三類:一是建立在細菌生長基礎上的藥敏試驗方法;二是建立在基因多態(tài)性分析基礎上的分子藥敏試驗方法;三是建立在耐藥MTB特異組分基礎上的色譜、質譜方法。作者概要地介紹了MTB的藥敏試驗方法,以及聯(lián)合應用現有藥敏檢測技術以提高臨床對MDR-TB的診斷率。

    分枝桿菌,結核; 藥物耐受性; 微生物敏感性試驗

    我國結核病的耐藥情況相當嚴重[1],耐多藥結核病(MDR-TB)是目前臨床結核病治療中亟待解決的難題之一。快速檢出耐多藥的結核分枝桿菌(MTB),指導臨床選擇有效抗結核藥物,制定合理的化療方案,是控制MDR-TB的關鍵,尤其對復治和難治患者更有意義。由于傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法是建立在培養(yǎng)基礎上的,繁瑣、費時,不能滿足臨床開展早期、有效治療的需求。近年來研發(fā)建立了一系列快速、有效的藥敏試驗新方法,部分方法已轉化為產品并獲得注冊證書,可應用于臨床。因此,筆者概要地介紹MTB藥敏試驗的方法,及聯(lián)合應用現有藥敏檢測技術,提高臨床MDR-TB診斷率。

    一、建立在細菌生長基礎上的MTB藥敏試驗方法

    細菌的生長特性決定了基于培養(yǎng)基礎上的藥敏試驗方法耗時長,但其可用于分析大多數抗結核藥物的耐受性。

    1. 傳統(tǒng)的藥敏試驗方法:傳統(tǒng)藥敏試驗是在改良羅氏培養(yǎng)基固體培養(yǎng)的基礎上,鑒定MTB對十幾種一線和二線抗結核藥物的敏感性水平的方法。我國常用絕對濃度法,也有部分實驗室采用比例法,該方法簡單、經濟,適用于基層。由于分枝桿菌生長周期長,該方法通常需1~2個月的時間。

    2.分枝桿菌快速培養(yǎng)藥敏試驗方法:是建立在分枝桿菌快速液體培養(yǎng)(如BACTEC MGIT 960[2]、BacT/ALERT 3D分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)[3]等)基礎上的直接或間接的藥敏試驗方法,與傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)基藥敏試驗方法具有較好的一致率,報告時間縮短至2~3周,較快速,但進口試劑成本高,只能檢測4~5種一線抗結核藥物的耐藥性,對二線抗結核藥物的藥敏試驗尚停留在實驗室階段[4]。

    3.微孔板測定法:是利用比色法或熒光法來檢測細菌增殖或活細菌數量的一種藥敏試驗方法,一般MTB需先培養(yǎng)7~10 d。常用下列氧化還原反應指示劑:MTT [3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑]、刃天青(Alamar-Blue)[5]、MTS [3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑 ]、TTC [2,3,5-三苯基氯化四氮唑]、XTT{3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉}、臺盼藍等,產生肉眼可見的顏色變化,從而判斷菌株的耐藥性。這些方法簡單,不需要復雜的儀器,但雜菌污染易導致假陽性,此外,對實驗室生物安全及實驗人員的防護要求較高。上述方法大多數尚停留在實驗室階段,而美國賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Scientific)開發(fā)出的分枝桿菌藥敏檢測板Sensititre?MYCOTB,已通過國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊,可檢測MTB對12種一線和二線抗結核藥物[包括利福平(rifampicin,RFP)、利福布汀(rifabutin,Rfb)、異煙肼(isoniazid,INH)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、鏈霉素(streptomycin,Sm)、氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)、阿米卡星(amikacin,Am)、對氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid,PAS)、乙硫異煙胺(ethionamide,Eto)、卡那霉素(kanamycin,Km)、環(huán)絲氨酸(cycloserine,Cs)]的耐藥性,各藥物與羅氏培養(yǎng)基比例法的一致率達90.0%以上,只需10 d時間即可獲得抗結核藥物的最低抑菌濃度[6]。

    4.噬菌體生物擴增法 (phage amplified biologi-cally assay,PhaB):分枝桿菌噬菌體對活的MTB具有親嗜性,MTB受感染后發(fā)生裂解,而形成清晰的噬菌斑。由于噬菌體不能感染死的MTB,因此,噬菌斑的數量與宿主菌的活菌數呈正相關。這是利用噬菌體建立的一種間接檢測標本中活MTB的快速檢測技術,通過檢測藥物作用后活菌減少的比例,可用來檢測MTB對藥物的敏感性[7]。英國BIOTEC Lab公司開發(fā)的MTB快速診斷試劑盒(噬菌體法;FASTPlaque TBTM)可用于臨床檢測,只需2 d 時間,無需特殊儀器,成本較低,但需克服因接種MTB量較難準確控制而重復性差、與其他分枝桿菌有交叉感染而特異度不高的問題。

    5.硝酸鹽還原試驗(nitrate reductase assay,NRA):將MTB接種于含硝酸鹽及含藥或無藥的羅氏培養(yǎng)基中,若MTB生長可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,通過Griess方法檢測培養(yǎng)基顏色變化。若含藥管無顏色變化為敏感;若含藥管呈粉紅色或紫藍色為耐藥??捎糜谥苯訖z測涂陽痰標本中MTB的耐藥性,與改良羅氏培養(yǎng)基比例法藥敏試驗有很好的符合率,但時間縮短至1~2周,而且觀察結果直觀,不需特殊儀器設備,可用于耐藥MTB的初步篩查[8]。

    6. 顯微鏡觀察藥敏試驗(microscopic observation drug-susceptibility assay,MODS):MTB在細胞培養(yǎng)板中液體培養(yǎng)3~6 d,通過顯微鏡觀察含藥孔和不含藥孔細菌生長情況,即可簡便、快速地檢測MTB對各種抗結核藥物的敏感性。該方法與傳統(tǒng)的絕對濃度法藥敏試驗結果比較具有很好的符合率(92%~98%),可用于快速檢測耐藥MTB,其缺點是需要倒置顯微鏡觀察MTB的生長情況[9]。

    7.采用顯微鏡延時成像的MTB瓊脂糖快速藥敏試驗:MTB接種于微流控芯片的瓊脂糖基質中,在液體培養(yǎng)基中的抗結核藥物通過瓊脂糖擴散到固定在瓊脂糖基質中的MTB,通過自動顯微鏡系統(tǒng)、圖像處理程序自動確定MTB對抗結核藥物的敏感性,只需9 d時間[10]。

    8. 三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光藥敏試驗:MTB細胞內ATP 水平與細胞存活率呈正相關。抗結核藥物殺死MTB后,細胞內ATP 經酶促催化降解后水平降低,試驗時加入熒光素-熒光素酶,記錄發(fā)光值并計算樣品ATP含量,即可了解MTB對抗結核藥物的敏感性,快速、簡便,與羅氏固體培養(yǎng)基法一致率為92.7%[11]。該方法最主要的問題是痰標本中其他細菌的干擾而導致的假陽性。

    9. mRNA定量聚合酶鏈反應(PCR)藥敏試驗:Ag85B是MTB增殖期分泌的蛋白,當MTB經抗結核藥物處理24 h后,應用熒光定量PCR檢測其Ag85B mRNA表達水平,若表達水平下降到無藥對照管的1%以下為敏感,>10%為耐藥,1%~10%之間為可疑。該方法與傳統(tǒng)的絕對濃度法具有較好的一致性,也是一種快速有效的耐藥檢測方法[12]。

    10. MPT64藥敏檢測方法:MPT64是MTB增殖期較豐富的分泌蛋白,耐藥菌株在含藥培養(yǎng)基中生長MPT64表達水平就高,通過檢測含藥和不含藥培養(yǎng)基中MPT64的含量即可間接反映MTB菌株對藥物的敏感程度[13]。目前該方法尚需進一步完善。

    11.流式細胞術藥敏檢測方法:MTB能水解二乙酸熒光素(fluorescein diacetate,FDA),應用FDA標記經過藥物處理后的MTB菌株,然后通過流式細胞術檢測帶FDA標記的菌株的熒光強度,而間接地檢測MTB對藥物的敏感性[14]。目前尚處于實驗室探索階段。

    二、建立在基因多態(tài)性分析基礎上的分子藥敏試驗方法

    該方法是采用分子生物學技術檢測、鑒定MTB耐藥靶基因的突變基因型。近年來隨著MTB對一線、二線抗結核藥物耐藥分子機制的闡明,耐藥基因檢測試劑盒不斷推出。目前,常用的方法有耐藥基因測序試劑盒(檢測MTB對RFP和INH的耐藥基因型)、GeneXpert MTB/RIF(檢測MTB對RFP的耐藥基因型)、GenoType?MTBDRplus檢測試劑盒(檢測MTB對RFP和INH的耐藥基因型)、GenoType?MTBDRsl檢測試劑盒(檢測MTB對EMB、氟喹諾酮類、氨基糖苷類藥物的耐藥基因型)、晶芯?MTB耐藥檢測基因芯片(檢測MTB對RFP和INH的耐藥基因型)[15]、INNO-LiPA MTB耐RFP基因型檢測試劑盒(INNO-LiPA Rif.TB MTB)及配套的自動檢測儀 (Auto-LiPA)及MeltPro?MTB耐藥檢測系統(tǒng)(實時熒光PCR-探針熔解曲線法;檢測MTB對RFP和INH的耐藥基因型)[16]等。新的耐藥基因檢測技術也不斷問世,如多層熒光實時定量PCR 方法應用4種熒光標記10個探針分析rpoB、katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC和rrs基因檢測RFP和INH耐藥[17];顏色反應生物芯片藥敏試驗方法通過不對稱多重PCR(templex PCR)、生物芯片雜交和酶顏色反應檢測RFP和INH耐藥性,與常規(guī)的藥敏試驗方法檢測結果具有很高的一致率[18]。應用數字PCR能夠較好地檢測MTB異質性耐藥,可檢出1000∶1的敏感株∶耐藥株混合物中的突變基因[19];下一代測序(next-genera-tion sequencing,NGS)將能夠更好地檢測異質性耐藥。分子藥敏試驗方法最大的優(yōu)點是快速,只需1~2 d,實現了MDR-TB的快速診斷。但其缺點是可檢測的藥物有限,仍有許多藥物無耐藥基因可檢測,或檢測的敏感度不高。因此,分子藥敏試驗并不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥敏試驗,仍需進一步闡明抗結核藥物的耐藥分子機制。

    三、建立在耐藥MTB特異組分基礎上的色譜、質譜方法

    MTB產生耐藥后,其菌株各組分會發(fā)生變化,應用色譜技術(薄層層析、氣相色譜、液相色譜技術)可分離并解析MTB細胞中各種組分,如脂肪酸、分枝菌酸、單糖等細胞成分,根據指紋圖譜或色譜峰的數量、位置和高度,鑒定耐藥MTB。應用質譜方法分析MTB耐藥菌株與敏感菌株蛋白質表達的差異,根據蛋白指紋圖譜也可鑒定耐藥MTB[20]。但這些方法都只能分析分離株,而且專用儀器設備和試劑成本高,目前這些方法沒有在臨床推廣應用。

    四、聯(lián)合檢測,提高臨床MDR-TB的診斷率

    目前,臨床上采用任何單一的藥敏試驗方法均無法完全滿足臨床需求,需采用多種方法聯(lián)合檢測以提高耐藥結核病的檢出率[21]。將可檢測對一、二線抗結核藥物的基于細菌生長的快速藥敏試驗方法與在1~2 d內即可檢出對部分藥物耐藥的MTB耐藥基因型的分子診斷方法相結合,優(yōu)勢互補,可快速、敏感地診斷MDR-TB。

    目前,國內大多實驗室采用分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)和改良羅氏培養(yǎng)基相結合進行藥敏試驗,首先通過分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)提高MTB培養(yǎng)的陽性率,縮短培養(yǎng)時間;而后通過改良羅氏培養(yǎng)基進行藥敏試驗,增加進行藥敏試驗藥物的種類,尤其是二線抗結核藥物的快速藥敏試驗對于確定MDR-TB治療方案是非常需要的,同時也降低了污染率和檢測成本,但仍需1個月左右的時間。

    目前,國內實驗室大多是采用分子藥敏試驗方法檢測涂陽或培陽的臨床標本,陽性檢出率較高,但傳統(tǒng)細菌學方法的低檢出率也導致一些菌陰耐藥結核病患者未能得到早期診斷。

    筆者所在實驗室將熒光定量PCR檢測MTB和NTM方法與耐藥基因檢測技術聯(lián)合應用,通過耐藥基因芯片直接檢測熒光定量PCR檢測MTB DNA陽性的臨床標本,以確定MTB對RFP和INH的耐受性,31%涂陰和17%培陰的臨床標本通過基因擴增可進行耐藥基因分析,提高了耐藥結核病患者的陽性檢出率,檢測耐多藥的MTB與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)藥敏試驗的一致率達83%~87%,敏感度70%~80%,特異度83%~90%[15],并且只需1~2 d時間,實現了真正意義上的快速藥敏,對于MDR-TB的早期診斷、有效治療具有重要的現實意義。但該方法檢測其他一、二線抗結核藥物的敏感度和特異度還有待進一步提高,部分二線藥物的耐藥分子機制還需闡明。

    新的表型藥敏試驗與分子藥敏試驗聯(lián)合應用將提高耐藥MTB的檢出率,如硝酸鹽還原試驗與反向斑點雜交試驗聯(lián)合檢測MTB耐藥性,其結果與傳統(tǒng)的絕對濃度法藥敏試驗具有高度的一致性,敏感度和特異度均優(yōu)于單一方法[22]。

    綜上所述,MTB藥敏試驗方法很多,但已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械注冊證書者不多,而在臨床廣泛推廣應用的新技術更少。因此,表型藥敏試驗仍是臨床判斷耐藥性、確定治療方案的主要依據,而分子藥敏試驗為MDR-TB的早期診斷提供了有效的手段,若兩者聯(lián)合應用將在MDR-TB的控制方面發(fā)揮重要作用。

    [1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015 [R/OL]. Geneva: World Health Organization, 2015(2015-11-16)[2016-06-07]. http://www.who.int/tb/publications/global_report/en/.

    [2] 郭蘇珊, 林健雄, 郭金鎮(zhèn), 等. BACTEC MGIT 960用于結核分枝桿菌直接藥敏試驗的研究. 中國病原生物學雜志, 2014, 9(10):946-952.

    [3] 徐東芳,王慶.BacT/ALERT 3D在結核分枝桿菌快速培養(yǎng)和藥敏試驗中的應用. 臨床輸血與檢驗,2011,13(1):59-61.

    [4] 蔣俊,張娟,張紅,等.MGIT 960系統(tǒng)行二線抗結核藥物敏感性試驗的實用性評價.中國防癆雜志,2012, 34(8):527-531.

    [5] 李桂蓮,張敬蕊,趙秀芹,等. 微孔板Alamar Blue顯色法檢測結核分枝桿菌臨床分離株利福平和異煙肼耐藥性研究. 中國人獸共患病學報,2012,28(4):319-326.

    [6] 王浩,趙青,陳妹紅. Sensititre?結核藥敏板檢測結核分枝桿菌藥敏的方法學研究. 河北醫(yī)科大學學報, 2016,37(2):187-190.

    [7] 李曉非,梁桂亮,汪亞玲,等.噬菌體生物擴增技術在結核分枝桿菌利福平耐藥性檢測中的應用.昆明醫(yī)科大學學報,2013, 34(4):103-104.

    [8] 田艷生,李紅光,崔幸琨,等.硝酸鹽還原試驗直接檢測痰標本中結核分枝桿菌耐藥性.中華檢驗醫(yī)學雜志,2012,35(7):653-655.

    [9] 黃自坤,熊國亮,姜碧霞,等.顯微鏡觀察藥敏檢測技術檢測結核分枝桿菌耐藥性研究. 重慶醫(yī)學, 2013, 42(19):2194-2197.

    [10] Choi J,Yoo J,Kim KJ,et al.Rapid drug susceptibility test ofMycobacteriumtuberculosisusing microscopic time-lapse imaging in an agarose matrix. Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(5): 2355-2365.

    [11] 劉君,裴豪,陳麗艷,等. 三磷酸腺苷發(fā)光法快速檢測結核分枝桿菌異煙肼耐藥的研究. 現代預防醫(yī)學, 2014, 41(1):108-109,113.

    [12] 蔡龍,施華萍,馬紀林,等.mRNA定量法檢測結核分枝桿菌藥物敏感性的應用評價. 實驗與檢驗醫(yī)學, 2008,26(1):36-38,78.

    [13] 尹小毛,謝貝,羅春明,等.應用MPT64 檢測建立結核分枝桿菌藥敏新方法的初步探索.實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(4):371-372.

    [14] 蘇政軍. 應用流式細胞儀檢測結核分枝桿菌對左氧氟沙星的敏感性. 廣州:廣州醫(yī)科大學,2013.

    [15] 劉銀萍, 王杰, 張俊仙,等.對異煙肼與丙硫異煙胺耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株檢測及相關基因突變的研究.中國防癆雜志, 2016,38(9): 718-721.

    [16] 徐費凡,顧德林,瞿梅,等.熒光PCR 溶解曲線法快速檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥突變.熱帶醫(yī)學雜志,2016,16(6):722-736.

    [17] Peng J, Yu X, Cui Z, et al. Multi-fluorescence real-time PCR assay for detection of RIF and INH resistance ofM.tuberculosis. Front Microbiol, 2016, 7:618.

    [18] Xue W, Peng J, Yu X, et al. A color-reaction-based biochip detection assay for RIF and INH resistance of clinical Mycobacterial specimens. J Microbiol Biotechnol, 2016, 26(1): 180-189.

    [19] Pholwat S, Stroup S, Foongladda S, et al. Digital PCR to detect and quantify heteroresistance in drug resistantMycobacteriumtuberculosis. PLoS One, 2013, 8(2):e57238.

    [20] 何秀云,朱傳智,逄宇,等.耐異煙肼和鏈霉素的結核分枝桿菌臨床分離株與敏感株差異蛋白表達研究.中國防癆雜志,2013,35(3):173-178.

    [21] 黃麗美,林健雄,彭東東,等.聯(lián)合檢測技術用于結核病及耐多藥結核病快速診斷的研究.中國病原生物學雜志,2015,10(7):638-641.

    [22] 潘建華,石燕,彭雪峰,等.硝酸鹽還原試驗與反向斑點雜交試驗聯(lián)合檢測結核分枝桿菌耐藥性.臨床肺科雜志,2012,17(2):277-279.

    (本文編輯:薛愛華)

    Rational use of drug sensitivity test techniques to improve the diagnosis rate of multidrug-resistant tuberculosis

    WUXue-qiong,ZHANGJun-xian.

    InstituteforTuberculosisResearch,ArmyTuberculosisPreventionandControlKeyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofNewTechniquesofTuberculosisDiagnosisandTreatment,the309thHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Beijing100091,China

    Correspondingauthor:WUXue-qiong,Email:xueqiongwu@139.com

    At present, multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is one of the difficult problems in clinical treatment of tuberculosis. The rapid detection of drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(MTB), to guide the clini-cal selection of effective anti-TB drugs, to determine reasonable chemotherapy regimen, were the key points to control MDR-TB. There are mainly three kinds of anti-TB drug sensitivity test methods as follow: (1) the anti-TB drug sensitivity test methods based on bacterial growth; (2) the molecular drug sensitivity test methods based on the gene polymorphism analyses; (3) the chromatography and mass spectrometry methods based on specific components of drug-resistant MTB. This paper briefly introduces the MTB drug sensitivity test methods, and the combined use of the existing drug sensitivity testing techniques, to improve the clinical diagnosis rate of MDR-TB.

    Mycobacteriumtuberculosis; Drug tolerance; Microbial sensitivity tests

    10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.003

    100091 北京,解放軍第三〇九醫(yī)院全軍結核病研究所 全軍結核病防治重點實驗室 結核病診療新技術北京市重點實驗室

    吳雪瓊,Email: xueqiongwu@139.com

    2016-10-27)

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