藻類在除草劑生物毒性安全評估中的應(yīng)用

錢海豐，陳 思，金瑜劍

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

藻類在除草劑生物毒性安全評估中的應(yīng)用

錢海豐1,2，陳 思2，金瑜劍3

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

農(nóng)藥殘留對生態(tài)系統(tǒng)的干擾和危害是全球性環(huán)境問題.除草劑的使用量占農(nóng)藥的50%左右，其經(jīng)過雨水沖刷、地表徑流和地下水滲透等過程進入水體，危害水生生態(tài)系統(tǒng)中藻類的生長.作為初級生產(chǎn)者，藻類相比于其他水生生物，對污染物更加敏感，加之其個體小、繁殖快，在短時間內(nèi)可獲得除草劑對藻類種群水平的毒性效應(yīng)，因此常作為水質(zhì)檢測和水生毒性評估的模式生物.綜述了除草劑對藻類生長、生理生化、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達等水平的研究進展，揭示除草劑對藻類毒性效應(yīng)的分子機理，為除草劑安全創(chuàng)制和使用提供理論依據(jù)，并且對組學(xué)技術(shù)在除草劑毒理機制研究上的前景作了展望.

除草劑；藻類；組學(xué)

除草劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和城市景觀管理，其用量約占農(nóng)藥50%左右[1].在使用過程中，除草劑中的很大一部分通過多種途徑進入水生生態(tài)系統(tǒng)[2]，對水環(huán)境造成污染，并干擾包括藻類在內(nèi)的水生生物的正常生長[3-4].作為初級生產(chǎn)者，藻類完成地球上90%的光合作用，為魚類、兩棲類和鳥類等動物提供氧氣和食物，在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有至關(guān)重要的地位.因此，藻類的組成和數(shù)量反映了水生態(tài)系統(tǒng)健康與否；對藻類的危害將影響整個水生生態(tài)鏈，甚至通過食物鏈影響人類健康.同時，藻類多為單細胞生物[5]，個體小，繁殖快，易培養(yǎng)，且對各種外來物質(zhì)較為敏感，所以常作為水質(zhì)檢測和水生毒性評估的模式生物，在水生態(tài)系統(tǒng)保護、安全評估等方面均具有重要地位.就藻類在除草劑生物毒性評估中的應(yīng)用，我們進行綜述，從生理生長、細胞結(jié)構(gòu)、分子水平等多個層次闡述了藻類在除草劑毒理機制研究中的進展，為綠色除草劑創(chuàng)制和除草劑的安全使用提供理論依據(jù).

1 除草劑對藻類生理生化的影響

1.1 除草劑對藻類生長的影響

由于除草劑創(chuàng)制的初始靶標多為光合作用生物，其在水生生態(tài)系統(tǒng)中首先影響藻類和高等水生植物，其次為水生動物.因此，藻類生長是除草劑生物毒性最敏感的指標.由于不同除草劑化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同，對藻類的毒性存在較明顯差異.一些常用除草劑對小球藻的半致死質(zhì)量濃度(LC50)多在0.2×104～8.91×104μg/L[6].如草胺磷對斜生柵藻96 h的LC50=12 mg/L，而草丁膦質(zhì)量濃度在高達10～20 mg/L時，才對小球藻生長產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)[7].藻類對光合抑制型除草劑較為敏感，如百草枯在質(zhì)量濃度低至0.01 mg/L即可抑制小球藻[8]和藍藻的生長[9]；而稍高質(zhì)量濃度的百草枯(0.03 mg/L)可明顯影響水生植物的生長[10].另一常用光合抑制型除草劑阿特拉津?qū)Φ畺旁?2 h的LC50=43 μg/L，0.3 mg/L阿特拉津處理銅綠微囊藻96 h后，抑制率可高達78.6%[11].Yue等[12]研究表明：磺酰脲類除草劑(如芐嘧磺隆)對淡水藻也存在非常明顯的毒性效應(yīng)，可在較低質(zhì)量濃度下對柵藻和小球藻產(chǎn)生抑制作用，其LC50為0.015～6.2 mg/L.一般而言，除草劑的抑制效果具有時間和質(zhì)量濃度效應(yīng)；而更高質(zhì)量濃度的除草劑在水體長期殘留，會對水生動物產(chǎn)生致畸或內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，如干擾蛙類的性腺發(fā)育[13]及斑馬魚的胚胎發(fā)育情況[14].由此可見，藻類對除草劑的敏感性高于絕大多數(shù)水生高等植物或動物，因此適合作為水質(zhì)檢測和水生毒性評估的模式生物.

1.2 除草劑對藻類營養(yǎng)吸收以及代謝途徑的影響

藻類受除草劑脅迫后，不僅生長受到影響，其營養(yǎng)吸收以及次級代謝過程也將受到干擾[15].氮(N)、磷(P)即是藻類生長的必需營養(yǎng)元素，同時也限制了藻類的生長[16].除草劑在水體中的殘留，可影響藻類對水體N和P的吸收利用.研究表明：銅綠微囊藻在阿特拉津處理96 h后，N和P吸收顯著下降，進而抑制葉綠素a和藻膽蛋白的合成；并且可直接影響次生代謝物如微囊藻毒素的合成.類似現(xiàn)象在磺酰脲類除草劑和其它有機污染物處理中也有發(fā)現(xiàn)[17].

光合作用是藻類最重要的生理代謝過程之一，藻類光合活性也是重要的環(huán)境監(jiān)測指標.一些除草劑通過破壞或抑制藻類光合色素的合成來影響光合作用，特別是光合抑制型除草劑，它對藻的作用位點與其對高等植物的比較接近.研究表明：百草枯會導(dǎo)致小球藻葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量顯著性下降，抑制電子傳遞和二氧化碳固定[8].另一光合抑制型除草劑阿特拉津則可抑制銅綠微囊藻葉綠素a、藻紅蛋白(PE)、藻藍蛋白(PC)以及別藻藍蛋白(APC)的合成.Endo等[18]也利用葉綠素a熒光顯微成像技術(shù)分析了敵草隆對藻類光合活性的影響，并認為除草劑對未成熟藻造成的光合損傷大于對成熟藻細胞.除了通過抑制植物的光合作用，除草劑也可干擾靶標生物呼吸作用、能量代謝，抑制脂肪酸生物合成等途徑來產(chǎn)生除草效應(yīng)，同時也會對非靶標生物藻類的抗氧化系統(tǒng)造成影響.大量研究發(fā)現(xiàn)：除草劑(如草丁膦、禾草靈酸)會直接或間接觸發(fā)活性氧類物質(zhì)(Reactive oxygen species, ROS)，誘發(fā)藻類的強氧化損傷，并由此引起脂質(zhì)膜氧化，增加丙二醛(MDA)的含量.如百草枯打破藻類電子傳遞平衡，阻斷NADPH的形成，造成ROS的大量產(chǎn)生[19-20]，進而影響藻類的正常代謝.所以ROS和MDA可作為藻氧化損傷的生物標志物.

在除草劑或其它逆境脅迫下，藻細胞抗氧化能力降低，使ROS的產(chǎn)生和清除動態(tài)失衡，多余的ROS將對藻體造成不同程度的損傷.為消除或降低這種傷害，藻體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)抗氧化酶活性增加[20-21].研究表明：64.3 μg/L的百草枯通過促進萊茵衣藻ROS大量生成，同時也誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等活性，但藻細胞量和生長率依然下降[22].阿特拉津也能誘導(dǎo)銅綠微囊藻細胞內(nèi)CAT和POD活性升高.但是MDA水平持續(xù)升高，表明阿特拉津誘導(dǎo)的抗氧化酶活性并沒有在短期內(nèi)完全去除ROS，造成脂質(zhì)過氧化損傷，細胞生理代謝受到影響，以至藻類的生長受到抑制.類似現(xiàn)象在研究除草劑氟草煙(furoxypyr)對萊茵衣藻的作用中也有發(fā)現(xiàn)[23]，表明藻類雖有一套完整的抗氧化酶產(chǎn)生體系，但當(dāng)環(huán)境中除草劑質(zhì)量濃度過高時，藻類仍然會收到氧化損傷.

2 除草劑對藻類細胞結(jié)構(gòu)和基因表達的影響

2.1 除草劑對藻類亞細胞結(jié)構(gòu)的影響

藻類個體小、結(jié)構(gòu)簡單，多為單細胞生物.除草劑可通過對藻體亞細胞結(jié)構(gòu)(尤其是細胞器空間結(jié)構(gòu))的破壞，干擾藻類的正常代謝.葉綠體是藻類進行光合作用的場所，占藻細胞體積的60%；其類囊體是形成高能化合物(ATP)的場所，也是光合作用正常進行必不可少的細胞器[24].有研究證實，廣譜性除草劑草甘膦[25]改變藻類葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)疏松，破壞葉綠體的完整性[7].對葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞很可能是除草劑降低藻類光合活性的主因.禾草靈除了改變銅綠微囊藻類囊體之外，也可破壞氣泡等其他組織的超微結(jié)構(gòu)[26]；而2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)則會造成斜生柵藻葉綠體萎縮，細胞壁變形[27].此外，除草劑處理也會造成藻細胞核結(jié)構(gòu)變化，并出現(xiàn)淀粉粒增加的現(xiàn)象.以上研究說明藻類亞細胞結(jié)構(gòu)，特別是功能細胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，也是污染物毒性的重要指標.

2.2 除草劑對藻類基因轉(zhuǎn)錄的影響

為更深層次揭示除草劑的毒理機制，研究人員利用藻類基因組相對簡單，遺傳背景清晰等特點，從基因轉(zhuǎn)錄或表達水平來評估除草劑的生態(tài)風(fēng)險.對單細胞藻類而言，光合作用是其生長代謝最重要、最復(fù)雜的代謝過程.所以，對基因轉(zhuǎn)錄水平的影響更多集中在光合作用相關(guān)基因上，如編碼PSII反應(yīng)中心蛋白psb各亞基基因、編碼PSI反應(yīng)中心蛋白psa各亞基基因、編碼負責(zé)CO2固定Rubisco酶的基因rbcS和rbcL.它們作為光反應(yīng)和暗反應(yīng)的關(guān)鍵基因，可以結(jié)合多種電子傳遞輔因子的蛋白作為內(nèi)在天線分子，捕捉能量，并把光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，決定藻類的生長.多種除草劑都會對這些基因的轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)生影響，它們誘導(dǎo)或抑制psaB，psbA和rbcL等基因的轉(zhuǎn)錄，從而改變編碼蛋白的豐度，擾亂電子在光合系統(tǒng)中的正常傳遞.如百草枯處理可導(dǎo)致psaB和rbcL轉(zhuǎn)錄表達顯著下降，阻止PSI正常電子傳遞，抑制CO2的固定，阻礙光合作用暗反應(yīng)的進行，抑制細胞生長或分化[28].而草丁膦對光合作用基因的影響與之不同，它對藻內(nèi)psaB基因的表達有一個先誘導(dǎo)過程，隨后對其產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng).這可能是草丁膦并非光合抑制型除草劑，對光合作用相關(guān)基因的影響是間接的，因而需要較長時間處理才會影響光合電子傳遞；且草丁膦類除草劑毒性較小，藻細胞可通過提高光合作用相關(guān)蛋白的表達予以緩解，這也是細胞對外加環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，借此維持細胞正常的光合作用[29].

除草劑對藻類其他代謝途徑的影響也可通過干擾基因表達調(diào)控來實現(xiàn).以微囊藻毒素的合成為例：微囊藻毒素合成肽涉及到很多基因簇，主要包括mcyABC(縮氨酸合成酶)和mcyDE(混合聚酮縮氨酸合成酶)兩個操縱子[30]，其中mcyA，mcyD，mcyH是銅綠微囊藻毒素合成相關(guān)基因.研究證實，阿特拉津通過抑制銅綠微囊藻N和P相關(guān)基因的表達，影響藻細胞對N和P的吸收，進而抑制微囊藻毒素基因mcyA，mcyD，mcyH的表達，減少藻毒素合成[11].有趣的是，除草劑還可以改變藻類生物鐘基因的表達節(jié)律來影響藻類生理生化反應(yīng).目前，藍藻被證實是具有晝夜節(jié)律且最簡單的生物，可通過生物鐘感受外界環(huán)境的周期性變化，調(diào)節(jié)自身生理活動.研究表明，藍藻細胞中大多數(shù)的基因都受到生物鐘基因調(diào)控，呈晝夜節(jié)律表達，從而控制多種生理代謝過程，如DNA復(fù)制和修復(fù)、能量轉(zhuǎn)換、膜運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞生長和死亡等多種生理功能[31-32].QIAN等[33]首次從生物鐘角度闡述除草劑對銅綠微囊藻的作用機理，并檢測其生物鐘和代謝相關(guān)基因表達以及微囊藻毒素釋放的晝夜節(jié)律變化，銅綠微囊藻光合作用基因的節(jié)律性表達可被阿特拉津干擾，從而抑制藻類的光合作用[11].對銅綠微囊藻生物鐘及代謝活動節(jié)律的研究，進一步理解其生理代謝和生長繁殖規(guī)律，對研究和預(yù)防水華的發(fā)生具有重要的意義[34-35].

3 組學(xué)技術(shù)在除草劑生物效應(yīng)評估中的應(yīng)用

組學(xué)的誕生使毒理學(xué)研究進入新的時期，然而這些技術(shù)主要應(yīng)用于高等植物以及動物的研究中[36]，在藻類的毒理研究中應(yīng)用較少，部分研究主要集中在對重金屬毒理機制的分析上.借助于對差異表達蛋白質(zhì)的分離[37]，及生物同源性分析[38]，蛋白組學(xué)在藻類毒理學(xué)中的應(yīng)用逐漸被重視.Xie等運用蛋白組學(xué)技術(shù)揭示了鋁通過改變?nèi)呛种冈宓墓夂献饔?、亞細胞結(jié)構(gòu)、蛋白表達等影響藻類生長的毒性機制[39].另外，蛋白組學(xué)也為闡明納米材料暴露以及有毒污染物對藻類的生理影響提供更精確的證據(jù)[40].代謝組學(xué)在藻類中的應(yīng)用也越來越普遍，藻類的代謝產(chǎn)物反應(yīng)了藻類自身新陳代謝情況，不僅影響藻類生長、細胞結(jié)構(gòu)，還可能干擾生存環(huán)境中其他生物[41-42].利用代謝組學(xué)研究環(huán)境因素對藻類的影響、水華爆發(fā)成因及水體微生物種群演變逐漸成為當(dāng)前研究熱點.如Lindahl等[43]利用代謝組技術(shù)研究了碳濃度變化對藻類代謝物的變化.

Fan等[44]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)更全面的揭示了藻類固碳過程中的基因表達.然而，與陸生植物相比,藻類基因組學(xué)研究尚未大規(guī)模展開，僅在全基因組序列鑒定[45]和藻類共培養(yǎng)方面有所應(yīng)用[46].為更確切直觀的在DNA序列水平了解藻類基因組信息，獲得更重要的功能基因信息. Valledor等利用蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和qPCR等多種技術(shù)對Chlamydomonasreinhardtii在冷刺激壓力下的代謝變化，且分析了油脂代謝和糖代謝[47].同時借助于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)，可為揭示藻類應(yīng)對環(huán)境脅迫的分子調(diào)控機制提供重要信息[48].

4 結(jié) 論

研究除草劑脅迫對藻類在不同生物學(xué)層面的影響及內(nèi)在機制，不僅可深入了解除草劑對水生生物的毒性效應(yīng)，也進一步闡明除草劑對生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的整體影響，對于揭示農(nóng)藥在生態(tài)系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化規(guī)律，維護生態(tài)系統(tǒng)的健康有重要的現(xiàn)實意義.近年來，藻類在除草劑安全性評估中的相關(guān)研究，包括了生理生長、細胞結(jié)構(gòu)、光合作用、基因表達以及組學(xué)在毒理學(xué)研究中的最新應(yīng)用.但目前，多數(shù)工作僅停留在單一物質(zhì)的毒性效應(yīng)和毒理機制上，而對于環(huán)境因子(如光照、溫度等)變化對毒性的影響，以及模擬環(huán)境中多種污染物交互作用的研究還很有限.隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，除草劑的需求量日益增長，也陸續(xù)涌現(xiàn)了許多高效低毒的新型除草劑，而這些除草劑對植物作用機理以及水體生態(tài)系統(tǒng)的毒性風(fēng)險尚不明確.此外，新型材料(如納米材料)的大量使用，使除草劑在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化過程更趨復(fù)雜.而與其他化合物的協(xié)同或拮抗作用也必將改變除草劑原有的毒性效應(yīng).這種聯(lián)合作用及所隱藏的復(fù)雜機理，難以藉由單一除草劑的毒理研究可以反映.因此，對除草劑的生態(tài)安全性評估仍需進一步完善，亟待包括毒理學(xué)、生態(tài)學(xué)在內(nèi)的諸多相關(guān)領(lǐng)域科研工作者的努力與合作.

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Application of algae in evaluating the biological toxicity of herbicide

QIAN Haifeng1,2, CHEN Si2, JIN Yujian3

(1.College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；3.College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Herbicide residue made great impact on global environmental and ecological balance. In recent years, herbicide was widely used, and occupied approximately 50 percent of the usage of pesticides. In addition, herbicide enters aquatic system through storm, runoff and groundwater infiltration, which influences the growth of aquatic organisms. As primary producers, algae are more sensitive to pollutants than other aquatic organisms. Therefore, algae are the common species to be regarded as the model aquatic organisms to evaluate the toxicity of the herbicide. In this study, we reviewed the advance of herbicide toxicology focused on algal growth, physiology and biochemistry, gene transcription and protein expression levels, which is beneficial to new herbicide discovery and usage. Finally, the prospect of omics technologies used in herbicide toxicological research is summarized.

herbicide; alga; omics

(責(zé)任編輯：劉 巖)

2016-04-11

國家自然科學(xué)基金面上項目(21577128)；浙江省杰出青年基金資助項目(LR14B070001)

錢海豐(1973-)，男，浙江上虞人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為環(huán)境毒理學(xué)，E-mail: hfqian@zjut.edu.cn.

X915.5

A

1006-4303(2017)01-0032-05