聚賴氨酸偶聯(lián)活性氧誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞凋亡

侯 穎，馬文瑞，程雅文，鄭浩然，譚之磊，賈士儒

（省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

細(xì)胞死亡是維持機(jī)體正常發(fā)展的一個(gè)重要過程，有機(jī)體生長發(fā)育或組織在清除多余或受損細(xì)胞時(shí)，維持機(jī)體完整性的生命特征[1-2]。細(xì)胞死亡一般分為主動(dòng)死亡和被動(dòng)死亡兩種形式[3]。其中，細(xì)胞凋亡是一種由基因表達(dá)調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，凋亡細(xì)胞體積變小，形態(tài)逐漸變圓，脫離相鄰的細(xì)胞[4]。釀酒酵母是單細(xì)胞真菌微生物，遺傳信息分析研究較為全面透徹，其細(xì)胞凋亡生化表征與哺乳動(dòng)物細(xì)胞十分相似，研究細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制，可以作為一類優(yōu)勢的模式生物[5-6]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞凋亡重要的誘導(dǎo)劑，ROS過量產(chǎn)生會使胞內(nèi)大分子發(fā)生染色質(zhì)濃縮，DNA片段化，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻等氧化損傷，進(jìn)而開啟細(xì)胞凋亡途徑[7]。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種攜帶氨基的陽離子表面活性劑，由25～35 個(gè)L-賴氨酸組成，通過ε-氨基和α-羧基縮合而成的堿性氨基端同聚物，也稱堿性聚酰胺，其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌以及一些病毒均有抑制作用[8-9]。因此，ε-PL的抑菌機(jī)制及其應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。薄濤等[10]研究了不同質(zhì)量濃度ε-PL對釀酒酵母的抑菌機(jī)制，結(jié)果表明隨著ε-PL質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞膜通透性和疏水性升高，細(xì)胞活性降低，并確定了亞致死質(zhì)量濃度為200 μg/mL，致死質(zhì)量濃度為500 μg/mL。同時(shí)，薄濤等[10]研究了ε-PL濃度對釀酒酵母細(xì)胞壁的影響，細(xì)胞壁壓力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ε-PL處理會對其細(xì)胞壁產(chǎn)生擾動(dòng)，變得更加脆弱。在亞致死濃度ε-PL處理組中，細(xì)胞壁的主要組成成分磷酸甘露糖和幾丁質(zhì)含量隨著ε-PL處理濃度上升而顯著上升，β-1,3-葡聚糖含量并沒有顯著變化，透射電子顯微鏡照片顯示釀酒酵母細(xì)胞壁沒有明顯變化。在致死濃度ε-PL處理組中，上述3 種主要組成成分含量較對照組均顯著上升；細(xì)胞壁某些位點(diǎn)明顯斷裂，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出。與此同時(shí)，雙氫羅丹明123和DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示亞致死濃度ε-PL處理還會引起釀酒酵母胞內(nèi)ROS積累和DNA斷裂[11]。譚之磊等[12]將ε-PL與帶負(fù)電荷的卵白蛋白形成帶不同電荷的復(fù)合物，通過靜電作用減少與大腸桿菌的相互作用，從而降低抑菌效果。Ye Rusong等[13]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL會造成大腸桿菌氧化脅迫，使DNA損傷應(yīng)答調(diào)節(jié)基因的表達(dá)受到影響。Zhao Ruifang等[14]將ε-PL與陽離子聚合物形成可降解的復(fù)合納米粒子，研究對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性并分析其在藥物包封率和抑菌性的應(yīng)用潛力。但是關(guān)于ε-PL與微生物凋亡的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本研究以釀酒酵母為模式真菌，研究ε-PL對酵母細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，解析ROS與細(xì)胞凋亡的偶聯(lián)關(guān)系，旨在為ε-PL的抑菌機(jī)理和真菌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AS2399由天津科技大學(xué)菌種保藏中心保藏。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

ε-PL（≥99%） 浙江新銀象生物技術(shù)有限公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC） 江蘇佰耀生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；JC-1線粒體膜電位試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；磷酯酰絲氨酸外翻檢測試劑盒 美國BD公司；原位末端凋亡（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）檢測試劑盒 瑞士Roche公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPD2010-230正置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；SU1510掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母細(xì)胞前處理

NAC是一種常見的抗氧化劑，具有干擾自由基生成、清除已生成自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活性、預(yù)防DNA損傷、抗細(xì)胞凋亡等功能[15]。為進(jìn)一步探究ROS在ε-PL抑菌過程中的作用，將抗氧化劑NAC與ε-PL共同作用于釀酒酵母。

活化好的酵母培養(yǎng)液初始細(xì)胞密度OD600nm值達(dá)到0.3～0.4時(shí)，添加ε-PL和NAC，28 ℃、180 r/min條件下連續(xù)培養(yǎng)8 h后終止培養(yǎng)。其對照處理組中，一組樣品僅有細(xì)胞培養(yǎng)液，作為空白對照，另一組向細(xì)胞培養(yǎng)液中再加入終濃度為10 mmol/L NAC溶液。ε-PL處理組中，一組需要分別加入200、500 μg/mL的ε-PL溶液，另一組需要分別加入200、500 μg/mL的ε-PL溶液后，再分別加入10 mmol/L NAC溶液。每組樣品制備3 份。

1.3.2 釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)觀察

參照Hair等[16]的方法并加以改良，細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3.1節(jié)。

1.3.3 釀酒酵母細(xì)胞熒光顯微鏡檢測

1.3.3.1 ROS檢測

2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHD A）進(jìn)入細(xì)胞后水解生成2,7-二氯二氫熒光素（2,7-dichlorodihydrofluorescein，DCFH），被裝載到細(xì)胞內(nèi)后，ROS能夠氧化無熒光的DCFH生成有綠色熒光的2,7-二氯熒光素（2,7-dichlorofluorescein，DCF）。通過檢測DCF的熒光程度，可以得出細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[17]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，具體如下：首先，低速離心收集酵母細(xì)胞液，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2 次細(xì)胞。其次使用DCFH-DA重懸細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔3～5 min輕微顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。然后使用空白培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，再次使用PBS洗滌2 次并重懸。最終取200 μL菌液加入96 孔板中，酶標(biāo)儀檢測。同時(shí)取適量菌液，制片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3.2 磷酯酰絲氨酸外翻檢測

異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白V（fluorescein isothiocyanate-Annexin V，F(xiàn)ITC-Annexin V）利用細(xì)胞凋亡早期的細(xì)胞膜不對稱性，確定凋亡細(xì)胞的比例。Annexin V是一種鈣離子依賴型的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有較高的吸附性，同時(shí)FITC能夠產(chǎn)生綠色熒光。碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種標(biāo)準(zhǔn)的流式紅色探針，細(xì)胞膜完整時(shí)可以將PI排出胞外，以之，PI完全進(jìn)入細(xì)胞。因此，使用Annexin V和PI熒光探針分辨存活和死亡細(xì)胞。FITC陽性且PI陰性的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC和PI雙陽性的細(xì)胞是凋亡后期、正在壞死或者已經(jīng)死亡的細(xì)胞，F(xiàn)ITC和PI雙陰性的細(xì)胞是正常細(xì)胞或者還未檢測到凋亡的細(xì)胞[18]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細(xì)胞液，PBS清洗2 次細(xì)胞。然后使用染色緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μL菌懸液到5 mL離心管中；同時(shí)加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI染色液，輕微顛倒混勻，25 ℃黑暗孵育15 min，最后加入400 μL染色緩沖液。制片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3.3 染色質(zhì)固縮檢測

藍(lán)色熒光染料Hoechst 33342和PI均可與細(xì)胞核DNA或RNA結(jié)合，Hoechst穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞熒光會比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。對于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，PI可以染色壞死細(xì)胞。雙染后，正常細(xì)胞則呈現(xiàn)為弱紅色熒光+弱藍(lán)色熒光，細(xì)胞核內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒，凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色熒光，核內(nèi)濃集而呈亮藍(lán)色，壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色熒光，核內(nèi)呈紅色[19]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細(xì)胞液，用PBS清洗2 次細(xì)胞。加入5 μL Hoechst染色液和5 μL PI染色，輕微顛倒混勻，4 ℃黑暗孵育20～30 min后，離心沉淀細(xì)胞，使用PBS再次洗滌細(xì)胞，涂片，使用熒光顯微鏡觀察。

1.3.3.4 線粒體膜電位檢測

親脂性陽離子熒光染料JC-1結(jié)合到線粒體基質(zhì)并產(chǎn)生紅色熒光，其熒光強(qiáng)度說明膜電位的狀態(tài)。以之，線粒體跨膜電位耗散，細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡過程，JC-1單體產(chǎn)生綠色熒光[20-21]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細(xì)胞液，用PBS清洗2 次細(xì)胞。使用0.5 mL YPD培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，再次加入0.5 mL JC-1染色液，立即混勻，37 ℃恒溫靜置20 min。4 ℃、600×g離心4 min，棄上清液。然后使用JC-1染色緩沖液洗滌2 次細(xì)胞，再次使用緩沖液重懸細(xì)胞，4 ℃、600×g離心4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清液，重復(fù)2 次。最后將細(xì)胞重懸使用熒光顯微鏡。

1.3.3.5 DNA損傷檢測

TUNEL法能夠檢測DNA損傷。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，部分DNA內(nèi)切酶被激活，會切斷核小體間的基因組DNA。在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，基因組DNA斷裂后3’-OH能夠結(jié)合綠色熒光探針FITC標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP），使用熒光顯微鏡檢測[22]。操作步驟見試劑盒使用手冊并加以改良，首先，低速離心收集酵母細(xì)胞液，用PBS清洗2 次細(xì)胞。使用0.5 mL YPD培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，再次加入10 μL TUNEL染色液，立即混勻。37 ℃恒溫孵育2 h，期間，每隔10 min上下顛倒混勻。37 ℃孵育結(jié)束后，4 ℃、600×g離心10 min，棄上清液，再次使用PBS洗滌并重懸細(xì)胞。取適量菌液，制片，使用熒光顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌細(xì)胞生長密度結(jié)果

通過測定釀酒酵母8 h后的細(xì)胞密度OD600nm值，觀察菌體的生長情況，結(jié)果見圖1。ε-PL處理組中，C組釀酒酵母的OD600nm值與A組細(xì)胞密度相比降低了83.7%，細(xì)胞生長受到明顯抑制。E組的OD600nm值與初始接種OD600nm值基本一致，細(xì)胞死亡率接近100%，活性完全受到抑制。但是加入NAC，D組的OD600nm值升高49.8%。

圖1 釀酒酵母細(xì)胞密度OD600 nm值Fig. 1 Cell density (OD600 nm) of S. cerevisiae

2.2 釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

通過掃描電子顯微鏡觀察釀酒酵母形態(tài)變化，如圖2所示。所有樣品的細(xì)胞大小沒有明顯變化。對照組細(xì)胞形態(tài)完整，表面光滑飽滿。ε-PL處理組中，C組細(xì)胞膜表面粗糙并有明顯的凹陷，E組細(xì)胞膜表面粗糙，出現(xiàn)明顯的凹陷、孔洞和細(xì)微凸起。加入NAC后的處理組細(xì)胞形態(tài)與ε-PL處理組無明顯差異。

圖2 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of ε-PL concentration on cell morphology of S. cerevisiae

2.3 釀酒酵母細(xì)胞熒光顯微鏡檢測結(jié)果

2.3.1 ROS檢測結(jié)果

DCFH-DA探針檢測釀酒酵母細(xì)胞胞內(nèi)ROS含量，圖3結(jié)果顯示，對照組中，A組和B組熒光強(qiáng)度一致。ε-PL亞致死濃度處理組中，C組熒光強(qiáng)度較A組增加了1.47 倍，ROS顯著積累，加入NAC后，D組的熒光強(qiáng)度較C組降低了54.6%。致死濃度處理組中，E組與A組相比減少了9%，說明細(xì)胞死亡過多，ROS含量減少，加入NAC后，F(xiàn)組的熒光強(qiáng)度較E組降低了21.1%。結(jié)合細(xì)胞密度和形態(tài)觀察結(jié)果，說明ε-PL誘發(fā)細(xì)胞ROS含量上升，使細(xì)胞活性受到抑制，同時(shí)NAC能夠緩解ε-PL對釀酒酵母細(xì)胞活性的抑制作用。

圖3 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母ROS含量的影響Fig. 3 Effect of ε-PL concentration on intracellular ROS content of S. cerevisiae

通過DCFH-DA探針對樣品進(jìn)行染色觀察，圖4結(jié)果顯示，對照組中，A組和B組均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞。ε-PL處理組中，亞致死濃度C組的綠色熒光細(xì)胞強(qiáng)度和數(shù)量最高，致死濃度E組出現(xiàn)少量綠色熒光細(xì)胞并且熒光強(qiáng)度降低，說明大部分細(xì)胞壞死，ROS含量降低，但是仍有小部分細(xì)胞出現(xiàn)ROS迸發(fā)現(xiàn)象。加入NAC后的處理組熒光強(qiáng)度均降低，說明外源添加NAC能夠抑制胞內(nèi)ROS含量。

圖4 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母ROS的影響Fig. 4 Effect of ε-PL concentration on intracellular ROS of S. cerevisiae

2.3.2 磷酯酰絲氨酸外翻檢測結(jié)果

通過Annexin V-PI探針對樣品進(jìn)行染色觀察，圖5結(jié)果顯示，A組未發(fā)現(xiàn)綠色或紅色細(xì)胞，證明無磷酯酰絲氨酸外翻現(xiàn)象和細(xì)胞壞死現(xiàn)象。ε-PL處理組均出現(xiàn)FITC陽性且PI陰性的綠色細(xì)胞和FITC和PI雙陽性的紅色細(xì)胞，說明ε-PL會使釀酒酵母細(xì)胞磷酯酰絲氨酸外翻，其中，亞致死濃度處理組的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量相比致死濃度組多，說明在亞致死濃度下，細(xì)胞膜較完整，未被PI染色，細(xì)胞能夠較長時(shí)間處于細(xì)胞凋亡早期階段。致死濃度處理組多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，說明致死濃度下大量細(xì)胞發(fā)生壞死。

圖5 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母磷酯酰絲氨酸外翻的影響Fig. 5 Effect of ε-PL concentration on phosphatidylserine externalization of S. cerevisiae

2.3.3 染色質(zhì)固縮檢測結(jié)果

通過Hoechst 33342-PI探針對樣品進(jìn)行染色觀察，細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色說明染色質(zhì)固縮，這一現(xiàn)象是細(xì)胞凋亡的顯著特征之一。圖6結(jié)果顯示，A組中多數(shù)細(xì)胞為淡藍(lán)色熒光，其中，內(nèi)部有深藍(lán)色顆粒，即為正常細(xì)胞。ε-PL處理組出現(xiàn)3 種細(xì)胞，第1種是正常細(xì)胞，第2種是細(xì)胞核內(nèi)有分散的亮藍(lán)色細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞，第3種是有紅色熒光背景的藍(lán)色壞死細(xì)胞，說明ε-PL會使細(xì)胞染色質(zhì)固縮。但是加入NAC后的處理組，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多。

圖6 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母染色質(zhì)固縮的影響Fig. 6 Effect of ε-PL concentration on chromatin pyknosis of S. cerevisiae

2.3.4 線粒體膜電位檢測結(jié)果

圖7 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母線粒體膜電位的影響Fig. 7 Effect of ε-PL concentration on mitochondrial transmembrane potential of S. cerevisiae

通過JC-1探針對樣品進(jìn)行染色觀察，圖7結(jié)果顯示，對照組中，A組和B組均為紅色熒光細(xì)胞，說明線粒體膜電位較高，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。ε-PL處理組出現(xiàn)兩種熒光細(xì)胞，一種是紅色熒光細(xì)胞；另一種是綠色熒光細(xì)胞，說明線粒體膜電位較低，部分細(xì)胞處于凋亡或死亡階段。其中，致死濃度E處理組綠色熒光細(xì)胞數(shù)量和強(qiáng)度最高，亞致死濃度C組次之，說明隨著ε-PL質(zhì)量濃度升高，線粒體膜電位耗散程度增強(qiáng)，細(xì)胞死亡，抑菌活性增強(qiáng)。與此同時(shí)，加入NAC后的處理組，綠色熒光強(qiáng)度均明顯降低，線粒體膜電位耗散程度降低。

2.3.5 DNA損傷檢測結(jié)果

通過TUNEL對樣品進(jìn)行染色觀察，圖8結(jié)果顯示，對照組中，A組和B組均未出現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞。ε-PL處理組中，亞致死濃度C組和致死濃度E組均出現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞。加入NAC后，亞致死濃度D組未出現(xiàn)熒光細(xì)胞，致死濃度F組中熒光細(xì)胞相對減少，可以降低DNA損傷。

圖8 ε-PL質(zhì)量濃度對釀酒酵母DNA損傷的影響Fig. 8 Effect of ε-PL concentration on DNA damage in S. cerevisiae

3 討 論

ε-PL作為一種天然綠色的防腐劑，其抑菌性能已經(jīng)得到國內(nèi)外研究者的廣泛研究。Hyldgaard等[23]以大腸桿菌和李斯特菌為模式菌株，檢測了二價(jià)陽離子對ε-PL抑菌活性的影響。周祺等[24]以腸球菌為研究對象，分析ε-PL對其的抑菌機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ε-PL通過改變細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而改變膜內(nèi)外電位，使得細(xì)胞大分子滲出并與DNA結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抑菌作用。蔡瑞等[25]以不同質(zhì)量濃度ε-PL研究了脂環(huán)酸芽孢桿菌最小抑菌濃度并將其應(yīng)用在模擬蘋果汁中，檢測菌落數(shù)和愈創(chuàng)木酚變化趨勢。孫鏈等[26]以不同貯藏溫度和時(shí)間為單因素，研究了ε-PL對牛肉火腿切片的細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌和大腸桿菌的抑制效果。陳曉青等[27]研究ε-PL質(zhì)量濃度對金黃色葡萄球菌生長曲線和生物膜形成的影響，結(jié)果表明ε-PL質(zhì)量濃度越高，對其抑制效果越好，并且生物膜形成能力下降。本課題研究了釀酒酵母菌細(xì)胞初始密度達(dá)到一定值后，添加不同質(zhì)量濃度的ε-PL和抗氧化劑NAC，分析細(xì)胞生長密度的變化，結(jié)果顯示亞致死濃度ε-PL的細(xì)胞生長密度與空白對照組相比降低了83.7%，致死濃度ε-PL的細(xì)胞密度基本不變，但是加入NAC后，其細(xì)胞生長密度升高了49.8%，表明加入NAC后可以有效控制細(xì)胞活性。同時(shí)，掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，亞致死濃度下細(xì)胞表面不光滑，部分細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷。致死濃度下細(xì)胞表面粗糙，出現(xiàn)明顯的凹陷和細(xì)微凸起，細(xì)胞膜造成嚴(yán)重?fù)p傷，這一結(jié)果與薄濤等[10]研究結(jié)果一致。

真核酵母細(xì)胞ROS水平上升，與抗氧化作用失衡，造成蛋白質(zhì)、核酸和膜脂等大分子物質(zhì)氧化損傷，進(jìn)而生理活動(dòng)異常誘發(fā)細(xì)胞凋亡。王興華等[28]研究了鎘誘導(dǎo)對酵母細(xì)胞作用的死亡機(jī)制，結(jié)果表明鎘處理可以降低細(xì)胞活性，ROS含量升高，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但是外源添加抗氧化劑或Ca2+，細(xì)胞死亡數(shù)量明顯降低。Madeo[29]研究了氧脅迫對酵母細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，結(jié)果表明，胞內(nèi)谷胱甘肽的消耗或外源低劑量H2O2的加入，可以誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞凋亡。同時(shí)，酵母也可以通過基因CDC48的突變或哺乳動(dòng)物Bax的表達(dá)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。在這兩種情況下，結(jié)果顯示胞內(nèi)氧自由基積聚，而自由基耗盡或缺氧則阻止細(xì)胞凋亡。劉慶菊等[30]研究了D-氨基酸對釀酒酵母的氧化損傷機(jī)制，結(jié)果表明，D-氨基酸誘導(dǎo)胞內(nèi)產(chǎn)生以H2O2為主要類型的ROS物質(zhì)，細(xì)胞產(chǎn)生毒性并抑制其生長。本課題利用探針染色和熒光顯微鏡技術(shù)，研究了不同質(zhì)量濃度ε-PL對酵母細(xì)胞活性的抑制機(jī)制，結(jié)果表明，ε-PL處理組的釀酒酵母細(xì)胞均出現(xiàn)磷酯酰絲氨酸外翻、染色質(zhì)固縮、線粒體膜電位耗散和DNA損傷現(xiàn)象，其中，在亞致死濃度下，ROS熒光強(qiáng)度最高，說明ε-PL能夠誘導(dǎo)釀酒酵母細(xì)胞ROS迸發(fā)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期階段。在致死濃度下，ROS含量相對減少，說明ε-PL濃度過高可使細(xì)胞直接進(jìn)入凋亡后期階段直至死亡。外源添加抗氧化劑NAC后，ROS熒光強(qiáng)度下降，細(xì)胞凋亡特征的熒光強(qiáng)度均降低，說明NAC能夠清除胞內(nèi)ROS，使ε-PL的抑菌活性降低。

4 結(jié) 論

ε-PL對酵母細(xì)胞活性有一定的抑制作用，不同質(zhì)量濃度的ε-PL抑制效果不一致，其中亞致死濃度下誘導(dǎo)ROS迸發(fā)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期階段，致死濃度下能使細(xì)胞進(jìn)入凋亡后期階段直至死亡，同時(shí)外源添加抗氧化劑NAC可清除胞內(nèi)ROS，有效抑制ε-PL的抑菌活性。