免疫蛋白酶體β2i亞基在DOCA/鹽敏感小鼠血管炎癥反應(yīng)中的作用*

李南南， 周春宇， 劉立新， 侯翠柳， 王紅霞， 徐愛麗， 李匯華△

(1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系, 北京 100069； 2首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室， 北京 101300)

免疫蛋白酶體β2i亞基在DOCA/鹽敏感小鼠血管炎癥反應(yīng)中的作用*

李南南1， 周春宇1， 劉立新2， 侯翠柳1， 王紅霞1， 徐愛麗1， 李匯華1△

(1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系, 北京 100069；2首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室， 北京 101300)

目的： 探討免疫蛋白酶體β2i亞基在醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)/鹽敏感小鼠血管炎癥反應(yīng)中的作用。方法: 將β2i基因敲除小鼠和同窩對照野生雄性小鼠的右側(cè)腎臟切除并在皮下植入DOCA 藥片，然后飲用NaCl 溶液(1%)3周，建立鹽敏感高血壓小鼠模型。3周后分別提取各實(shí)驗組新鮮胸主動脈組織中總的RNA和蛋白，或用福爾馬林固定和石蠟包埋組織后進(jìn)行切片。采用Western blot、實(shí)時熒光定量PCR和免疫組化法分別檢測胸主動脈中β2i、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Mac-2、NF-κB及促炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)水平。結(jié)果: 與假手術(shù)組相比，DOCA/鹽處理明顯增高血管組織中β2i 的mRNA和蛋白表達(dá)水平、巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)、NF-κB及促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平；相反，敲除β2i基因明顯抑制了DOCA/鹽誘導(dǎo)的這些改變。結(jié)論: 免疫蛋白酶體β2i亞基可能通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)DOCA/鹽誘導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)。

免疫蛋白酶體β2i亞基； 血管炎癥； 醋酸脫氧皮質(zhì)酮/鹽

遺傳和環(huán)境的交互作用是導(dǎo)致高血壓發(fā)生和發(fā)展的重要因素，調(diào)控高血壓發(fā)生的病理生理機(jī)制主要包括交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、一氧化氮合酶/一氧化氮及內(nèi)皮素系統(tǒng)異常激活。高血壓的發(fā)生過程涉及動脈血管結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，其主要病理改變包括血管壁增厚、平滑肌細(xì)胞增生/肥大、細(xì)胞外基質(zhì)增多和炎癥細(xì)胞聚集[1-2]。近些年，大量研究證明免疫炎癥反應(yīng)在高血壓發(fā)生中起著重要的作用，其中NF-κB信號通路可調(diào)控許多炎癥因子的表達(dá),參與多種炎癥反應(yīng)性疾病如高血壓、心臟衰竭和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[3]

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑。UPS主要包括泛素激活酶E1、泛素轉(zhuǎn)運(yùn)酶E2、泛素連接酶E3 和26S蛋白酶體。26S蛋白酶體由19S調(diào)節(jié)顆粒和20S核心顆粒2個亞復(fù)合物組成[4]。其中20S核心顆粒中含有組成型催化亞基β1、β2和β5，形成組成型蛋白酶體[5]。近些年研究發(fā)現(xiàn)在促炎癥因子如干擾素γ(interferon-γ，INF-γ)刺激下可促進(jìn)誘導(dǎo)型亞基β1i、β2i和β5i的表達(dá)，進(jìn)而形成免疫蛋白酶體;免疫蛋白酶體具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，其中催化亞基β1i 具有半胱天冬酶樣活性，β2i主要具有胰蛋白酶樣活性，而β5i具有糜蛋白樣活性，在蛋白質(zhì)水解、抗原遞呈和免疫反應(yīng)中起著重要作用[6]。應(yīng)用蛋白酶體抑制劑硼替佐米處理后可抑制活化CD4+T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表明蛋白酶體參與炎癥反應(yīng)[7]。但是，β2i是否參與醋酸脫氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone acetate，DOCA)/鹽引起的小鼠血管炎癥反應(yīng)尚不清楚。

本研究在野生和β2i基因敲除小鼠中，采用DOCA/鹽誘導(dǎo)高血壓模型，觀察免疫蛋白酶體β2i亞基敲除對血管巨噬細(xì)胞聚集、NF-κB及促炎癥因子表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

β2i基因敲除小鼠(129S2/SvPas)購自Jackson實(shí)驗室，在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物屏障(SPF級)中心飼養(yǎng)和繁殖，小鼠自由攝食和飲水，半光照，房間溫度保持在22～23 ℃，濕度在50%～55%。取其雄性子代8～10周齡(體重24～25 g)用于本實(shí)驗。

2 藥物、試劑及儀器

DOCA購自Sigma；IL-1β、IL-6和TNF-α引物購自北京生物工程公司；抗GAPDH抗體及 II 抗均購自CST；抗β2i抗體購自Enzo；抗Mac-2和NF-κB 抗體購自Abcam。多色熒光凝膠成像系統(tǒng)購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；顯微鏡購自Nikon；TGradient 48 型PCR儀購自Whatman Biometra。

3 方法

3.1 實(shí)驗分組、模型制備及給藥方法β2i基因敲除及同窩野生對照雄性小鼠分別隨機(jī)分為4組(每組8只)：假手術(shù)組(WT+sham組;僅切除右腎，正常飲水)、β2i KO組(僅切除右腎，正常飲水)、野生DOCA/鹽組(WT+DOCA，切除右腎，植入DOCA藥片同時飲用生理鹽水)和β2i KO+DOCA/鹽組(切除右腎，植入DOCA藥片同時飲用生理鹽水)。模型制備過程：采用三溴乙醇 (12 mL/kg) 腹腔注射麻醉小鼠，取脊柱右側(cè)腎區(qū)進(jìn)行備皮，常規(guī)消毒后作一長約 1 cm 的切口，暴露腎臟，緊貼腎門處以手術(shù)縫線結(jié)扎，剝離腎被膜并切除右腎后逐層縫合[8]。待術(shù)后小鼠狀態(tài)穩(wěn)定(約2～3 d)野生DOCA/鹽組和β2i KO+DOCA/鹽組植入DOCA 藥片，并飲用NaCl (10 g/L)溶液3周，其余2組皮下不植入DOCA藥片且均正常飲水。

3.2 血管取材與染色 小鼠麻醉后打開胸腔進(jìn)行心血管體循環(huán)系統(tǒng)灌注，剪取小鼠胸主動脈，用濾紙吸干血管表面的水分，用于提取RNA和蛋白的組織用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱。用于病理檢查的血管在甲醛中固定，然后用石蠟包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行Mac-2和NF-κB免疫組織化學(xué)染色。

3.3 免疫組化染色 將石蠟切片分別在二甲苯和乙醇(100%、100%、95%、80%)逐級脫蠟和脫水， 然后在壓力鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)(1.5 min)。首先用過氧化物酶阻斷劑(3%雙氧水)室溫處理10 min，PBS沖洗3次；用血清封閉1 h。然后加入 I 抗4 ℃濕盒過夜，PBS沖洗3 次；加 II 抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 次后，DAB顯色。最后用蘇木素復(fù)染核3 min，自來水洗3次，乙醇(80%、95%、100%、100%)和二甲苯處理，中性樹膠封片。使用ImageJ軟件觀察和分析統(tǒng)計DAB陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞所占血管總橫截面積的百分比[2]。

3.4 Western blot實(shí)驗 將血管組織在蛋白裂解液中剪碎、勻漿，再用超聲波細(xì)胞破碎儀低溫裂解細(xì)胞，離心(4 ℃, 12 000 r/min) 15 min，取上清備用。BCA法測蛋白濃度。各組動物取等量蛋白(50 μg)于SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，再用 I 抗(1∶800)4 ℃孵育過夜。第2天，將膜取出，復(fù)溫20 min，洗滌 10 min、2次。然后用 II 抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，洗滌 15 min、4次；最后將PVDF膜置于ECL顯影液中浸泡3 min后取出。利用顯影儀(多色熒光凝膠成像系統(tǒng))顯影。

3.5 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗 用Trizol 法提取小鼠血管組織RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后每個體系加入2 μL cDNA模板、上下游引物各1 μL和SYBR 10 μL，配制成20 μL 的反應(yīng)體系。通過實(shí)時熒光定量PCR儀測定β2i、IL-1β、IL-6和TNF-α 的mRNA水平。β2i的上游引物為5’-CGCCCCCAAAATCTACTGCT-3’，下游引物為5’-ACGCGTGTAGCTCCATCTTG-3’；IL-1β的上游引物為5’-TTGGGCCTCAAAGGAAAGAAT-3’，下游引物為5’-TGGGTATTGCTTGGGATCCA-3’;IL-6的上游引物為5’-CCAGAAACCGCTATGAAGTTCCT-3’，下游引物為5’-AGAACCCTGACTACGACCAC-3’；TNF-α的上游引物為5’-GCCAACGGCATGGATCTC-3’，下游引物為5’-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGAG-3’。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析均使用SPSS 19.0軟件。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示；多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 敲除β2i基因降低血管中β2i的蛋白水平

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)敲除小鼠主動脈中β2i的蛋白水平比野生小鼠明顯降低 (P<0.01)，見圖1。

Figure 1.Expression of immunoproteasome β2i protein in vascular tissue ofβ2igene knockout mice. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vsWT group.

圖1 免疫蛋白酶體β2i蛋白在β2i基因敲除小鼠血管組織中的表達(dá)

2 DOCA/鹽處理后上調(diào)血管組織中β2i的表達(dá)水平

DOCA/鹽處理小鼠3周后，qPCR和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)小鼠血管組織中β2i的mRNA和蛋白水平比假手術(shù)對照組均明顯增高(P<0.01)，見圖2。

3 敲除β2i基因降低DOCA/鹽誘導(dǎo)的血管巨噬細(xì)胞浸潤

與假手術(shù)對照組比較，DOCA/鹽處理3周后血管中巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯增多(P<0.01)；相反，β2i敲除顯著減輕DOCA/鹽誘導(dǎo)的這種改變(P<0.05)。在正常飲水情況下，β2i敲除組和對照組間巨噬細(xì)胞數(shù)量的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖3。

4 敲除β2i基因降低DOCA/鹽誘導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)水平

與假手術(shù)對照組比較，DOCA/鹽處理后血管中NF-κB的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)；相反，β2i敲除顯著減輕DOCA/鹽誘導(dǎo)的這種改變(P< 0.05)。在正常飲水情況下，β2i敲除組和對照組間NF-κB表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 2.The effect of DOCA/salt treatment on β2i expression in vascular tissue. A: qPCR analysis of aortic β2i mRNA expression in each group; B: immunohistochemical staining of aortic sections in each group with anti-β2i antibody. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vssham group.

圖2 DOCA/鹽處理后對血管組織中β2i表達(dá)的影響

Figure 3.The effects ofβ2igene knockout on vascular macrophage infiltration induced by DOCA/salt (immunohistochemical staining with anti-Mac-2 antibody). Mean±SEM.n=8.**P<0.01vsWT+sham group;#P<0.05vsWT+DOCA/salt group.

圖3 敲除β2i基因?qū)OCA/鹽引起的血管巨噬細(xì)胞浸潤的影響

Figure 4.The effects ofβ2igene knockout on vascular NF-κB protein level induced by DOCA/salt (immunohistochemical staining with anti-NF-κB antibody). Mean±SEM.n=8.**P<0.01vsWT+sham group;#P<0.05vsWT+DOCA/salt group.

圖4 敲除β2i基因?qū)OCA/鹽引起的血管中NF-κB蛋白水平的影響

5 敲除β2i降低DOCA/鹽誘導(dǎo)的血管炎癥因子的表達(dá)

與假手術(shù)對照組比較，DOCA/鹽處理后血管中促炎因子包括IL-1β、 IL-6和TNF-α的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)；相反，β2i敲除顯著降低DOCA/鹽引起的這些變化(P<0.05)。在正常飲水情況下，β2i敲除組和對照組間這些促炎因子表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5。

討 論

本實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)在DOCA/鹽處理小鼠3周后，主動脈血管中β2i表達(dá)水平明顯升高。敲除β2i基因后可明顯降低DOCA/鹽引起的血管組織中巨噬細(xì)胞聚集、NF-κB和炎癥因子的表達(dá)水平。這些結(jié)果提示β2i亞基可促進(jìn) DOCA/鹽引起的血管炎癥反應(yīng)。

大量證據(jù)表明炎癥反應(yīng)參與高血壓及其靶器官損害的整個過程。高血壓和高鹽可促進(jìn)炎癥細(xì)胞包括單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等在血管壁中聚集和活化，產(chǎn)生大量氧自由基和炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)血管重塑和高血壓發(fā)生[9-10]。我們最近研究表明血管緊

Figure 5.The effects ofβ2igene knockout on DOCA/salt induced mRNA expression of vascular proinflammatory cytokines. The mRNA expression of aortic IL-1β, IL-6 and TNF-α in each group was determined by qPCR analysis. Mean±SEM.n= 8.**P<0.01vsWT+sham;#P<0.05,##P<0.01vsWT+DOCA/salt group.

圖5 敲除β2i基因?qū)OCA/鹽引起的血管促炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

張素II和高鹽可刺激趨化因子CXC趨化因子1(CXC chemokine 1，CXCL1)的產(chǎn)生， 招募CXC趨化因子受體2(CXC chemokine receptor 2，CXCR2)陽性的單核/巨噬細(xì)胞在血管聚集和活化，進(jìn)而增強(qiáng)氧化應(yīng)激和炎癥因子大量釋放，然后促進(jìn)血管損傷和高血壓的發(fā)生[2]。

近些年，研究發(fā)現(xiàn)免疫蛋白酶體在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，可調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖、T輔助細(xì)胞分化及細(xì)胞因子的表達(dá)。如樹突狀細(xì)胞中β1i缺陷也可明顯抑制流感病毒引起的NF-κB 信號激活及炎癥因子(IFN-α、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)[11]。 研究證明NF-κB是炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其活性受IκB的調(diào)控。免疫蛋白酶體激活后可降解磷酸化IκB蛋白，進(jìn)而激活細(xì)胞中NF-κB信號通路，促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)[11]。抑制蛋白酶體的活性可顯著抑制炎癥性疾病的發(fā)生，如應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG-132處理后明顯改善球囊損傷引起的血管炎癥反應(yīng)[12]，也可通過抑制NF-κB 信號通路從而減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。本實(shí)驗結(jié)果表明β2i敲除顯著降低DOCA/鹽引起的血管巨噬細(xì)胞聚集、NF-κB和炎癥因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)，提示免疫蛋白酶體β2i亞基也可通過激活NF-κB信號通路調(diào)節(jié)DOCA/鹽引起的血管炎癥反應(yīng)，β2i可作為治療高血壓性血管炎癥反應(yīng)的一個潛在新靶點(diǎn)。但是，敲除β2i僅部分降低NF-κB和IL-1β的表達(dá)以及巨噬細(xì)胞聚集，提示其它免疫蛋白酶體亞基如β1i和β5i也可能參與血管炎癥反應(yīng)，但是仍需要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of immunoproteasome subunit β2i in DOCA/salt-induced vascular inflammation in mice

LI Nan-nan1, ZHOU Chun-yu1, LIU Li-xin2, HOU Cui-liu1, WANG Hong-xia1, XU Ai-li1, LI Hui-hua1

(1DepartmentofPathophysiology,CollegeofBasicMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2DepartmentofMorphology,CollegeofYanjingMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing101300,China.E-mail:hhli1935@aliyun.com)

AIM: To investigate the role of immunoproteasome subunit β2i in deoxycorticosterone acetate (DOCA)/salt-induced vascular inflammation in mice.METHODS: Wild-type andβ2iknockout male mice were used. The right kidney was removed and DOCA pellet was subcutaneously implanted in the mice. The mice were then received 1% NaCl as drinking water for 3 weeks. The total RNA and protein were isolated from thoracic aorta 3 weeks later. The aortic tissues were fixed in formalin, embedded in paraffin and sectioned. Western blot, real-time PCR and immunohistochemistry were performed to detect the expression of β2i, macrophage marker Mac-2, NF-κB， and proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNF-α in thoracic aorta. RESULTS: Compared with sham group, DOCA/salt treatment significantly increased the expression of β2i at mRNA and protein levels, increased the infiltration of macrophages and expression of Mac-2, and upregulated the expression of NF-κB and proinflammatory cytokines including IL-1β, IL-6 and TNF-α in wild-type group, whereas theses effects were markedly attenuated inβ2iknockout mice. CONCLUSION: Immuneproteasome subunit β2i is involved in DOCA/salt-induced vascular inflammation through activation of NF-κB signaling in the mice.

Immuneproteasome subunit β2i; Vascular inflammation; Deoxycorticosterone acetate/salt

1000- 4718(2017)05- 0930- 05

2016- 10- 11

2017- 03- 07

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃科技部(973計劃)項目基金(No. 2012CB517802)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.027

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