海洋沉積物中微生物基因組DNA提取方法的比較研究?

賀 惠，張 玉，甄 毓??，米鐵柱，陳陽陽，于志剛(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003；2.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266100；3.中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島266100；4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，山東 青島266071；5.中國海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島266100)

海洋沉積物中微生物基因組DNA提取方法的比較研究?

賀 惠1,3,4，張 玉2,3,4，甄 毓2,3,4??，米鐵柱2,3,4，陳陽陽2,3,4，于志剛4,5
(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003；2.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266100；3.中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島266100；4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室，山東 青島266071；5.中國海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點實驗室，山東 青島266100)

沉積物成分復(fù)雜，腐殖酸等物質(zhì)含量較高，這些雜質(zhì)在DNA提取過程中不易除去，可能會對后續(xù)的PCR擴增等產(chǎn)生抑制作用。因此，高質(zhì)量DNA的獲得是海洋微生物分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提。本研究采用6種不同的方法，分別提取同一來源海洋沉積物樣品中的微生物基因組DNA。對DNA純度、得率、16S rRNA基因拷貝數(shù)和微生物群落特征等多方面進(jìn)行比較，結(jié)果表明：方法1(QIAamp DNA Stool Mini Kit)、方法2(PowerSoil?DNA Isolation Kit)和方法3(RNA PowerSoil?DNA Elution Accessory Kit)得到的DNA產(chǎn)量較低，純度卻較高，可以直接用于后續(xù)分子生物學(xué)分析；與方法2相比，方法3得到的細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)和單位質(zhì)量DNA中可擴增細(xì)菌16S rRNA基因模板量較低；方法4(SDS高鹽法)得到的DNA雖然產(chǎn)量高，但雜質(zhì)含量也高，抑制了后續(xù)PCR反應(yīng)的進(jìn)行；方法5(方法4得到的DNA經(jīng)QIAamp DNA Stool Mini Kit純化)和方法6(方法4得到的DNA經(jīng)PowerSoil?DNA Isolation Kit純化)，雖然純度有所提高，但DNA大量損失，且耗時長，花費高。另外，方法2在提取過程中可以最大程度裂解菌體細(xì)胞壁，能更好反映微生物群落特征。綜合以上結(jié)果，方法2(PowerSoil?DNA Isolation Kit)提取海洋沉積物微生物基因組DNA效果最佳。本研究可為海洋微生物分子生態(tài)學(xué)研究提供一種有效的技術(shù)手段。

沉積物；微生物；DNA提取

1980年代以前，海洋微生物多樣性研究一直以分離培養(yǎng)的方法為主，即將海洋微生物從環(huán)境中分離純化后，根據(jù)微生物的形態(tài)和生化特征等進(jìn)行多樣性分析。然而，由于方法的限制，海洋中的微生物大多數(shù)不能培養(yǎng)，僅有少數(shù)海洋細(xì)菌(0.01%～0.1%)可形成菌落被培養(yǎng)出來[1]。1986年P(guān)ace等首次將核酸測序技術(shù)應(yīng)用于微生物學(xué)分析后，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)、分子雜交及克隆文庫等多種分子生物學(xué)技術(shù)得到了越來越廣泛的應(yīng)用[2-4]。分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以分離培養(yǎng)出所有微生物的缺點，成為微生物生態(tài)學(xué)研究的重要手段。

沉積物中成分復(fù)雜，腐殖酸、酚類物質(zhì)、重金屬等含量較高，這些雜質(zhì)在DNA提取過程中不易除去，可能會對后續(xù)的PCR擴增等產(chǎn)生抑制作用。因此，高質(zhì)量DNA的獲得是微生物分子生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)。對海洋沉積物樣品來說，十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, sodium salt, SDS)高鹽提取[5-6]和試劑盒提取是兩類常用沉積物DNA提取方法。本研究采用SDS高鹽提取法和幾個試劑盒等共6種方法對同一海洋沉積物樣品進(jìn)行DNA提取，通過DNA純度、DNA得率、16S rRNA基因拷貝數(shù)及微生物群落結(jié)構(gòu)等方面的比較，找出一種高效的針對海洋沉積物中微生物基因組DNA的提取方法，為海洋微生物分子生態(tài)學(xué)研究提供一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

2014年5月采集山東半島乳山灣鄰近海域表層沉積物，采樣站位為C2站(121.49°E，36.66°N)和C5站(121.51°E，36.50°N)(見圖1)。將沉積物分裝于滅菌鋁盒中，置于-80°C超低溫冰箱中進(jìn)行保存。

1.2 海洋沉積物中微生物基因組DNA的提取

采用6種方法分別提取同一海洋沉積物樣品，每個樣品重復(fù)提取3次。6種DNA提取方法分別對應(yīng)方法1(M1)、方法2(M2)、方法3(M3)、方法4(M4)、方法5(M5)及方法6(M6)。

1.2.1 方法1 沉積物自然解凍后，用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Germany)提取沉積物微生物基因組DNA，溶于200 μL緩沖液，-20 °C保存。實驗根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 方法2 沉積物自然解凍后，用PowerSoil?DNA Isolation Kit(MOBIO, USA)提取沉積物微生物基因組DNA，溶于100 μL緩沖液，-20 °C保存。實驗根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 方法3 沉積物自然解凍后，用RNA PowerSoil?DNA Elution Accessory Kit(MOBIO, USA)提取沉積物微生物基因組DNA，溶于100 μL緩沖液，-20 °C保存。實驗根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 方法4 沉積物自然解凍后，用SDS高鹽法提取沉積物中的DNA[5-7]。稱取5 g樣品，與13.5 mL DNA提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1磷酸鈉，1.5 mol·L-1NaCl，1% CTAB，pH=8.0)混合，加入100 μL蛋白酶K(10 mg·mL-1)，于225 r·min-1搖床上37 ℃振蕩30 min。加入1.5 mL 20% SDS，65 ℃水浴2 h，每隔15 min輕輕顛倒幾次。加入2% PVPP，室溫6 000 g離心10 min后，將上清液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中。在沉淀中再加入4.5 mL DNA提取液和0.5 mL 20% SDS，渦旋10 s，65 °C水浴10 min，室溫6 000 g離心10 min，重復(fù)抽提2次，將3次抽提得到的上清液轉(zhuǎn)移到同一離心管中。加入RNaseA(終濃度為200 μg·mL-1)，37 °C下作用15 min后，加入與上清等體積的氯仿異戊醇(體積比為24∶1)混合，6 000g離心10 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1 h后16 000g離心20 min，收集沉淀。用70%乙醇洗滌沉淀兩次，加入500 μL滅菌的去離子水重懸沉淀，-20 °C保存。

1.2.5 方法5 將方法4得到的DNA經(jīng)QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Germany)純化，溶于200 μL緩沖液，-20 ℃保存。

1.2.6 方法6 將方法4得到的DNA經(jīng)PowerSoil?DNA Isolation Kit(MOBIO, USA)純化，溶于100 μL緩沖液，-20 ℃保存。

1.3 DNA得率與純度檢測

采用超微量紫外分光光度計(Picodrop, UK)測定各種提取方法得到的DNA濃度和OD260/OD280等。根據(jù)測得的濃度計算每克沉積物中DNA的提取量，作為DNA得率的指標(biāo)。

1.4 細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)檢測

1.4.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 使用V3-V4可變區(qū)的擴增引物338F: 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和806R: 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’[8-9]擴增細(xì)菌16S rRNA基因，退火溫度為58 ℃，擴增產(chǎn)物長度約為470 bp。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，純化目的片段。將純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上后進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，選取陽性克隆提取質(zhì)粒。快速質(zhì)粒小提試劑盒(康為，北京)制備質(zhì)粒，將得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)電泳確認(rèn)后，送測序公司(華大基因，北京)測序。用超微量紫外分光光度計測得重組質(zhì)粒的濃度，計算重組質(zhì)粒的拷貝濃度。將得到的質(zhì)粒10倍梯度稀釋，保存在-80℃超低溫冰箱中，用于建立定量PCR體系的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與樣品測定 以梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒(Roche, Germany)進(jìn)行qPCR(Applied Biosystems, USA)，并在反應(yīng)體系中加入0.2 μg·μL-1牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)[10]。退火溫度為58 ℃。擴增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析，保證每個樣品都是特異性擴增。每個質(zhì)粒濃度3個平行樣，實驗體系中同時添加陰性對照。以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定的qPCR體系和條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，每個樣品設(shè)置3個平行樣，實驗體系中同時添加陰性對照和陽性對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)。同時，我們引入“可擴增濃度”表征單位質(zhì)量DNA中可擴增細(xì)菌16S rRNA基因模板量。1.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性分析

1.5.1 Illumina高通量測序 選取方法1、2、3提取的C2站DNA為模板，選擇16S rRNA基因V3-V4區(qū)作為測序區(qū)域，使用帶有測序標(biāo)簽barcode的特異引物338F/806R進(jìn)行PCR擴增。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣后，純化目的條帶。采用試劑盒進(jìn)行擴增子文庫構(gòu)建，檢測合格后，使用Miseq測序平臺進(jìn)行上機測序，高通量測序委托上海銳翌生物科技有限公司進(jìn)行。將測序得到的16S rRNA基因核酸序列上傳至NCBI高通量測序數(shù)據(jù)庫Sequence Read Archive(SRA)，登錄號為SRP073067。

1.5.2 原始數(shù)據(jù)拼接及序列質(zhì)量控制 使用FLASh(Fast Length Adjustment of Short reads)軟件利用重疊區(qū)域?qū)㈦p末端測序得到的成對reads拼接成一條序列，并對其測序質(zhì)量進(jìn)行篩選，刪除引物或barcode錯配堿基數(shù)大于1的序列、堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的序列和長度較低的序列等，得到高質(zhì)量序列，用于進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

1.5.3 OTU聚類 使用Uparse在0.97相似性水平下對16S rRNA基因序列進(jìn)行聚類，得到用于物種分類的操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU)。與GreenGenes數(shù)據(jù)庫比對后，對每個OTU進(jìn)行物種注釋，并分析物種的相對豐度。

1.5.4 生物信息學(xué)分析 利用Qiime軟件計算Alpha多樣性指數(shù)，包括物種豐富度指數(shù)(Chao I、ACE)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)等，并進(jìn)行稀釋曲線分析，評估不同方法得到的DNA中微生物群落的物種豐富度和多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA純度比較

OD260/OD280是檢測DNA純度的常用指標(biāo)，主要用來檢測DNA的純度。一般認(rèn)為，提取的DNA越純，OD260/OD280應(yīng)該越接近1.8。由圖2可知，方法4和方法5得到的DNA OD260/OD280比值低于1.6，說明DNA純度不高，存在蛋白質(zhì)或酚類污染。相比較而言，其余4種方法得到的DNA OD260/OD280比值均超過1.6，說明這4種方法所得的DNA雜質(zhì)去除效果較好，純度較高。

從提取的DNA顏色也可以判斷其中腐殖酸的含量，方法4所得的DNA顏色為淺褐色，說明其中含有大量的腐殖酸，污染最嚴(yán)重。

2.2 DNA得率比較

由圖3可知，方法1、方法5和方法6得到的DNA含量較低，每克沉積物中DNA含量均低于5 μg，而方法2、方法3和方法4得到的DNA含量較高。對于方法4，雖然DNA得率為19 μg·g-1，但因雜質(zhì)含量較高，根據(jù)OD260計算得到的DNA含量可能與實際的DNA含量不符。

2.3 16S rRNA基因拷貝數(shù)比較

2.3.1 細(xì)菌16S rRNA基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線 以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4)?；貧w方程為y=-3.585x+41.647，回歸系數(shù)r=-0.999。熔解曲線只在83.5 ℃處有一單峰出現(xiàn)，說明qPCR反應(yīng)過程中無引物二聚體或其他非特異性擴增。

2.3.2 細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)比較 利用qPCR對不同方法提取的DNA進(jìn)行16S rRNA基因拷貝數(shù)定量，發(fā)現(xiàn)不同提取方法得到的DNA中拷貝數(shù)存在差異(見圖5)。方法4得到的DNA中雜質(zhì)含量較高，抑制了PCR反應(yīng)的進(jìn)行，因此無法檢測其中16S rRNA基因拷貝數(shù)。其余五種方法中，方法2得到的DNA中16S rRNA基因拷貝數(shù)最高，與其他方法差異顯著(P<0.05)。

2.4 單位質(zhì)量DNA中可擴增細(xì)菌16S rRNA基因模板量比較

由于提取方法不同，DNA中雜質(zhì)含量存在差異，對于PCR擴增的抑制程度不同，因此對于同一樣品的同一個目的基因，擴增得到的拷貝數(shù)可能不同。從圖6可知，對于C2或C5站，可擴增濃度都是方法2、1和6較高，其中方法2的可擴增濃度最高，與其他方法差異顯著(P<0.01)。

2.5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

由于方法4得到的DNA需進(jìn)一步純化才可用于下游實驗，方法5、6得到的DNA雖然純度有所提高，但損失較大，且花費較高，因此選擇方法1、方法2、方法3得到的C2站DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。

2.5.1 序列統(tǒng)計、細(xì)菌多樣性及豐富度指數(shù)統(tǒng)計 對方法1、2、3得到的C2站沉積物微生物基因組DNA進(jìn)行測序，共得到133 332條序列(見表1)，3種方法得到的序列條數(shù)介于42 361～47 343之間。按照0.97的序列相似性進(jìn)行OTU聚類，共得到2 904個OTUs，3種方法得到的OTU個數(shù)介于1 824～2 203之間。

M1、M2和M3的覆蓋度(Coverage)均高于99%，且隨著序列數(shù)的增加，稀釋曲線趨于平穩(wěn)(見圖7)，說明再增加測序量也只能產(chǎn)生少量的OTUs，現(xiàn)有的測序深度足以反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息。由表1可知，方法2與方法3得到的DNA中細(xì)菌豐富度比方法1高；Shannon指數(shù)則說明方法3得到的DNA中細(xì)菌群落多樣性較高。

2.5.2 細(xì)菌群落組成比較 由于不同的DNA提取方法偏好性不同，因此得到的細(xì)菌類群有所差異。將方法1、2、3得到的16S rRNA基因序列與GreenGenes數(shù)據(jù)庫比對，3種方法檢測到的能確定分類地位的細(xì)菌類群見表2。由表2可知，方法2、3得到的細(xì)菌類群范圍更廣泛。

分析3種方法得到的細(xì)菌類群發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteriodetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、WS3等均是豐度較高的類群，其中變形菌門是所有類群中豐度最高的菌群(見圖8)。

對于變形菌門，在綱分類水平上，Gamma-變形菌綱、Delta-變形菌綱、Alpha-變形菌綱、Beta-變形菌綱、Epsilon-變形菌綱在3種提取方法所得的序列中均有分布(見圖9)。其中，Gamma-變形菌綱占據(jù)絕對優(yōu)勢地位(在M1、M2和M3中所占比例分別為45.71%、61.67%、53.89%)，其次是Delta-變形菌綱(在M1、M2和M3中所占比例分別為27.10%、27.96%、35.71%)；而對于Zeta-變形菌綱，只出現(xiàn)在方法2、3得到的序列中，且豐度最低(在M2和M3中所占比例分別是0.09%和0.004%)。

3 討論

目前，微生物多樣性研究通常采用分子生物學(xué)手段，如克隆文庫技術(shù)、高通量測序技術(shù)和qPCR技術(shù)等，然而這些技術(shù)的前提是獲得片段完整、純度較高且能全面覆蓋微生物信息的DNA，因此微生物基因組DNA的提取尤為重要。對海洋沉積物樣品而言，常用的DNA提取方法有試劑盒提取和SDS高鹽提取2類。

本研究中使用的方法4即為SDS高鹽法。通過研究發(fā)現(xiàn)，方法4步驟繁瑣，耗時較長，且得到的DNA溶液為淺褐色，表明其中腐殖酸等雜質(zhì)殘留較多，可能會抑制后續(xù)PCR過程中DNA聚合酶的活性[11-12]。雖然提取過程中添加了能夠吸附腐殖酸等雜質(zhì)的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(Crosslinking polyvingypyrrolidone, PVPP)，但qPCR過程仍受到抑制，無法檢測到PCR產(chǎn)物。對方法4得到的粗提DNA，分別采用方法1、2的試劑盒進(jìn)行純化，即本研究中的方法56，雖然得到的DNA純度有所提高，但純化過程會造成DNA的大量損失，DNA含量下降約10倍，表明純化過程會導(dǎo)致DNA的大量損失[13]。且耗時長、花費高，可能會導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析結(jié)果出現(xiàn)偏差[14-15]。

相比之下，試劑盒法(方法1、2、3)在DNA提取過程中加入了去除腐殖酸等雜質(zhì)的步驟，雖然DNA產(chǎn)量較低，但純度較高，可以直接用于后續(xù)分子生物學(xué)分析。

目前qPCR技術(shù)是研究微生物群落豐度的主要手段。本研究以細(xì)菌16S rRNA基因為目的基因，對于同一海洋沉積物樣品來說，方法1、2、3得到的16S rRNA基因拷貝數(shù)較高，其中方法2得到的16S rRNA基因拷貝數(shù)最高。由于提取方法不同，DNA中可抑制PCR擴增的雜質(zhì)含量存在差異，因此對于同一樣品的同一個目的基因，擴增得到的拷貝數(shù)可能不同。本研究中，我們引入“可擴增濃度”表征單位質(zhì)量DNA中可擴增16S rRNA基因模板量。對于C2或C5站，可擴增濃度都是方法1、2和6較高，且2個站位都是方法2的可擴增濃度最高。因此，與其他提取方法相比，方法2提取得到的DNA質(zhì)量較高，對于可抑制PCR擴增的雜質(zhì)處理得比較完全。

在用Illumina高通量測序技術(shù)比較細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性時發(fā)現(xiàn)，方法2、3能發(fā)掘出更多的細(xì)菌類群，且其多樣性相對較高。提取DNA時，方法2、3都采用裂解液和玻璃珠破碎相結(jié)合的方法破碎細(xì)菌菌體，對微生物細(xì)胞壁的破碎效果較好，因而能更好地反映海洋沉積物微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性情況；而方法1只采用裂解液破碎菌體，可能對微生物細(xì)胞壁的破碎不完全，從而導(dǎo)致在分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性時出現(xiàn)偏差。從微生物多樣性和菌群覆蓋度的角度考慮，方法2、3較好。但與方法2相比，方法3得到的細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)和單位質(zhì)量DNA中可擴增細(xì)菌16S rRNA基因模板量較低，因此方法2更能客觀地反映樣品中微生物群落豐度的真實信息。

4 結(jié)語

與其他提取方法相比，方法2得到的DNA純度高，可抑制PCR擴增的雜質(zhì)含量較低，有利于后續(xù)的分子生態(tài)學(xué)分析。該方法在提取過程中對菌體細(xì)胞壁達(dá)到最大程度的裂解，可以更好地反映微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性情況。因此，方法2即PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒提取海洋沉積物微生物基因組DNA效果最佳，適合用于海洋沉積物中微生物分子生態(tài)學(xué)研究。

致謝：感謝國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心冉祥濱老師及劉軍同學(xué)在野外采樣中給予的幫助。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Comparison Study on Extraction Methods of Microbial DNA in Marine Sediments

HE Hui1,3,4, ZHANG Yu2,3,4, ZHEN Yu2,3,4, MI Tie-Zhu2,3,4, CHEN Yang-Yang2,3,4, YU Zhi-Gang4,5

(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.College of Environmental Science and Engineering, Qingdao 266100, China; 3.Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China; 4.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China;5.The Key Laboratory of Marine Chemical Theory and Technology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China)

The composition of sediments is complex, and the impurities, such as humic acid, are difficult to remove when DNA extraction. Because of the inhibition on PCR amplification, high quality DNA is the basis and prerequisite for the molecular ecology of marine microorganisms. In this study, six different methods were used to extract microbial DNA from marine sediments. Comparisons of the purity and yield of microbial DNA, 16S rRNA gene copy numbers and the characteristics of microbial community were used to analyze the quality and quantity of the genomic DNA. The results showed that DNA purity obtained by method 1, method 2 and method 3 were high despite low in yield, which could be directly used in the following microbial ecology analysis. Compared to method 2, the bacterial 16S rRNA gene copy numbers and template amount for bacterial 16S rRNA gene in per nanogramme DNA obtained by method 3 was low. DNA obtained by method 4 was high in yield but low in purity. After purification (method 5 and method 6), DNA samples were high in purity but there were massive losses. Moreover, method 2 could fully break up cells, reflecting the characteristics of microbial community better. Synthesizing the above results, the method 2 (PowerSoil?DNA Isolation Kit) was the best one to marine sediment microbial DNA extraction. This study provides an effective technique for the molecular ecology of marine microorganisms.

sediments; microbe; DNA extraction

國家自然科學(xué)基金項目(41521064；41376093)；中國科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室、青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)開放課題項目(KLMEES201601)資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China(41521064；41376093)；the Open Fund of Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciencea,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,and Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science,Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology(KLMEES201601)

2016-07-04；

2016-10-27

賀 惠(1987-)，女，博士生。E-mail:hehui-07@163.com

?? 通訊作者：E-mail:zhenyu@ouc.edu.cn

Q93-3

A

1672-5174(2017)06-017-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20160246

賀惠，張玉，甄毓，等. 海洋沉積物中微生物基因組DNA提取方法的比較研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 47(6):17-24.

HE Hui, ZHANG Yu, ZHEN Yu, et al. Comparison study on extraction methods of microbial DNA in marine sediments [J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(6):17-24.