大鼠急性腎缺血再灌注損傷早期的基因表達(dá)

林俊毅，茅幸，吳慧娟，薛愛(ài)民

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，上海 200032）

·論著·

大鼠急性腎缺血再灌注損傷早期的基因表達(dá)

林俊毅1，茅幸2，吳慧娟2，薛愛(ài)民1

（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，上海 200032）

目的研究急性腎缺血再灌注損傷早期的差異基因表達(dá)，探索其潛在的分子機(jī)制。方法通過(guò)單純夾閉大鼠腎動(dòng)脈制備腎缺血再灌注模型，進(jìn)行基因表達(dá)芯片檢測(cè)和生物信息學(xué)分析，篩選急性腎損傷早期的差異基因表達(dá)及其所涉及的細(xì)胞活動(dòng)和信號(hào)通路。同時(shí)，通過(guò)構(gòu)建差異表達(dá)基因的生物網(wǎng)絡(luò)來(lái)尋找與急性腎損傷關(guān)系密切的分子，并進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果在檢測(cè)出的151個(gè)差異表達(dá)基因中，132個(gè)基因顯著上調(diào)，19個(gè)基因顯著下調(diào)，GO與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示主要與細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路和免疫反應(yīng)等有關(guān)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，挑選出的3個(gè)與急性腎損傷高度相關(guān)的基因（ANXA1、PHLDA1、KLF6）在疾病早期具有顯著的表達(dá)差異，上升倍數(shù)與芯片檢測(cè)出的倍數(shù)基本一致。結(jié)論本研究揭示了急性腎損傷早期的差異基因表達(dá)特征以及所涉及的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，其中ANXA1、PHLDA1、KLF6可能在急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制中起到一定作用。

法醫(yī)病理學(xué)；再灌注損傷；差異基因表達(dá)；生物信息學(xué)

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種高發(fā)病率、高死亡率的腎疾病，其發(fā)病因素眾多。在法醫(yī)臨床司法鑒定實(shí)踐中，常涉及創(chuàng)傷、休克、嚴(yán)重感染、藥物中毒等引發(fā)AKI表現(xiàn)的鑒定，部分?jǐn)D壓綜合征、心血管手術(shù)術(shù)后的傷者也有AKI的表現(xiàn)[1]。由于AKI的治療效果很差，隨著病程的發(fā)展，往往在住院治療期間病情加重，導(dǎo)致患者出現(xiàn)終末期腎病甚至死亡[2]，容易引發(fā)醫(yī)療糾紛，給患者、醫(yī)療工作者和司法鑒定人員帶來(lái)諸多困擾[3]。因此，探索AKI的發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)前腎病研究工作的一個(gè)重點(diǎn)，早期發(fā)現(xiàn)和早期治療更是改善AKI預(yù)后的關(guān)鍵，但至目前為止，其分子機(jī)制仍不明確，尤其是早期的分子機(jī)制，有必要進(jìn)行深入研究。

隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用基因芯片對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為探索基因功能研究的一個(gè)重要手段[4]?；虮磉_(dá)芯片可以同時(shí)比較成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)變化，同時(shí)利用生物信息學(xué)從海量的數(shù)據(jù)中挖掘基因之間表達(dá)變化的內(nèi)在聯(lián)系，可為探索疾病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而防治疾病提供重要的線索。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠腎缺血再灌注損傷模型，對(duì)比AKI早期與對(duì)照組基因表達(dá)的差異，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，為深入研究AKI的發(fā)病機(jī)制及探索新的治療靶點(diǎn)提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及器械

健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（248±5）g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。微型動(dòng)脈夾由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑和儀器

麻醉所用10%水合氯醛購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PrimeScriptTMRT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)AB公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型制作

將大鼠隨機(jī)分為8組，每組3只，根據(jù)缺血再灌注時(shí)間分為3 h、6 h、12 h、24 h組以及各自對(duì)應(yīng)的對(duì)照組。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮固定，消毒手術(shù)野。

缺血再灌注大鼠沿腹中線切開(kāi)皮層后，先后在結(jié)腸脾區(qū)及結(jié)腸肝區(qū)位置暴露左、右腎，用玻璃分針小心分離左、右腎動(dòng)脈，然后用血管夾同時(shí)將雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉，30 min后同時(shí)松開(kāi)雙側(cè)血管夾，恢復(fù)雙側(cè)腎組織血供，觀察腎組織顏色，從紫色變?yōu)榧t色說(shuō)明經(jīng)過(guò)腎缺血再灌注的病理生理過(guò)程，關(guān)腹后繼續(xù)觀察2h，大鼠能正?；顒?dòng)則說(shuō)明建模成功。

對(duì)照組同法打開(kāi)腹腔并找到腎動(dòng)脈，但不夾閉腎動(dòng)脈。

1.2.2 標(biāo)本留取

根據(jù)再灌注時(shí)間的不同，分別在關(guān)腹后3、6、12、24h取其尿液，麻醉處死后取下雙腎。每個(gè)樣本取部分組織置于4%甲醛水溶液中固定，進(jìn)行HE染色；部分組織迅速放入RNA保護(hù)液，存入液氮中，隨后進(jìn)行RNA抽提；余放入-80℃冰箱凍存。

1.2.3 指標(biāo)的檢測(cè)

尿蛋白的檢測(cè)：采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白的含量，并分別用1、5μg的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)品，運(yùn)用ImageJ v1.28（美國(guó)健康協(xié)會(huì)）測(cè)量尿蛋白灰度值并統(tǒng)計(jì)其與3h對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。

總RNA的提?。航M織樣本按照TRIzol法提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA無(wú)降解，并用紫外分光光度法檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度。RNA在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處的吸光度比值（D260/D280）在1.8～2.1范圍內(nèi)，方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 芯片數(shù)據(jù)處理

采用Rat lncRNA（8×60K）芯片（美國(guó)Agilent公司）及Feature Extraction v10.7.1.1軟件（美國(guó)Agilent公司）處理原始圖像并提取數(shù)據(jù)。接著利用GeneSpring v12.5軟件（美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。組織間差異基因的篩選通過(guò)t檢驗(yàn)和差異倍數(shù)（fold-change，F(xiàn)C）獲取而出，篩選閾值為P值≤0.01且|logFC|＞2，通過(guò)聚類分析軟件Cluster v3.0（美國(guó)斯坦福大學(xué)）對(duì)差異基因進(jìn)行聚類和熱圖制作。采用注釋可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID）對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因組百科庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG）通路富集分析，得出差異基因轉(zhuǎn)錄域覆蓋率。同時(shí)利用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING對(duì)差異基因進(jìn)行蛋白互作分析。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)

熒光定量PCR反應(yīng)使用SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒在7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，利用蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的3個(gè)差異顯著基因［膜聯(lián)蛋白A1（annexin A1，ANXA1）、血小板白細(xì)胞C激酶底物同源性樣域家族A成員1（pleckstrin homology-like domain，family A，member 1，PHLDA1）和Kruppel樣因子6（Kruppel-like factor 6，KLF6）］進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其熒光定量PCR引物具體見(jiàn)表1。采用GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。各個(gè)基因的表達(dá)量測(cè)量均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 急性腎缺血再灌注模型的構(gòu)建

HE染色顯示，缺血再灌注3h組的部分腎小管中開(kāi)始出現(xiàn)蛋白管型，并且隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白管型逐漸增多；6h組局部腎小管上皮細(xì)胞中出現(xiàn)大量空泡樣改變，部分上皮細(xì)胞刷狀緣消失；12 h組開(kāi)始出現(xiàn)小管上皮細(xì)胞的壞死脫落，表現(xiàn)為細(xì)胞核的固縮、溶解、消失以及胞質(zhì)變紅，部分基底膜裸露；在24h組中，小管上皮細(xì)胞壞死明顯增多，間質(zhì)水腫，并伴有大量的細(xì)胞管型與蛋白管型。而所有對(duì)照組的腎組織結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)正常，腎小球、腎小管和腎間質(zhì)均未見(jiàn)明顯病理改變（圖1）。

使用凝膠電泳檢測(cè)尿蛋白發(fā)現(xiàn)，所有對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)尿蛋白，而所有的缺血再灌注組均出現(xiàn)了尿蛋白（圖2），與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。以上結(jié)果顯示，通過(guò)單純夾閉腎動(dòng)脈成功構(gòu)建了急性腎缺血再灌注的大鼠模型，并表現(xiàn)了AKI的病理特點(diǎn)。

2.2 急性腎缺血再灌注早期的差異基因表達(dá)

提取腎缺血再灌注3 h組和對(duì)照組腎組織的mRNA進(jìn)行基因表達(dá)芯片的檢測(cè)。經(jīng)基因微陣列分析3h組與其對(duì)照組的差異表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)的40 420個(gè)表達(dá)基因中，共檢出151個(gè)差異表達(dá)基因，其中132個(gè)顯著上調(diào)，19個(gè)顯著下調(diào)，差異基因聚類和熱圖制作結(jié)果見(jiàn)圖4。所有檢出基因的差異表達(dá)倍數(shù)均大于2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。差異表達(dá)基因經(jīng)GO分析（表2）后發(fā)現(xiàn)，有10個(gè)基因富集在細(xì)胞增殖的反向調(diào)節(jié)上，且這些差異基因主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中；而在分子功能的分析上，富集程度最高的是在DNA結(jié)合區(qū)。進(jìn)一步經(jīng)KEGG通路分析這些差異表達(dá)基因的通路后發(fā)現(xiàn)，涉及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相關(guān)通路的差異基因最多（表3）。

表2 GO分析結(jié)果

表3 KEGG通路分析結(jié)果

2.3 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證

通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，本研究探索的3個(gè)與AKI早期病變相關(guān)的基因（ANXA1、PHLDA1和KLF6）分別與免疫、凋亡及轉(zhuǎn)錄關(guān)系密切，且在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中均處于核心位置（圖5）。熒光定量PCR驗(yàn)證其表達(dá)情況，結(jié)果顯示，3個(gè)基因的表達(dá)均顯著上升，且上升的倍數(shù)與基因芯片檢測(cè)出的倍數(shù)基本一致（表4）。

表4 熒光定量PCR驗(yàn)證3個(gè)差異基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=3，±s）

表4 熒光定量PCR驗(yàn)證3個(gè)差異基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=3，±s）

注：1）與3h對(duì)照組比較，P＜0.05

組別ANXA1PHLDA1KLF6對(duì)照1.00±0.181.00±0.091.00±0.09 3h4.46±0.921）3.13±0.171）3.20±0.411）

3 討論

AKI常發(fā)生于心血管手術(shù)后、腎移植術(shù)后以及交通事故、地震等意外事故造成腎擠壓綜合征后，主要由腎缺血再灌注造成，其特征為腎功能的快速下降，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率降低、體內(nèi)含氮廢物積聚以及水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂。一旦在早期未得到及時(shí)治療，可進(jìn)展為終末期腎病，造成巨大的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]，同時(shí)也給社會(huì)、醫(yī)患關(guān)系的緊張?jiān)斐刹涣加绊憽?/p>

自1990年開(kāi)始小鼠被引入缺血再灌注所致AKI模型的制備[5]，由于可方便制作各類轉(zhuǎn)基因小鼠研究單個(gè)基因在AKI發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，其用量大大超過(guò)大鼠。然而，由于小鼠個(gè)體差異大，而且小鼠模型還受解剖結(jié)構(gòu)的限制，例如在夾閉腎動(dòng)脈時(shí)無(wú)法分離動(dòng)靜脈和輸尿管，以致結(jié)果穩(wěn)定性差[6]。

本研究成功構(gòu)建了大鼠腎缺血再灌注損傷模型，從形態(tài)上觀察到了隨時(shí)間逐漸增多的蛋白管型、可能與自噬相關(guān)的小管上皮細(xì)胞內(nèi)空泡形成[7]以及小管上皮細(xì)胞的壞死脫落，模型呈現(xiàn)了AKI的典型病理表現(xiàn)[8]；從功能上發(fā)現(xiàn)了尿蛋白的增多。為了研究AKI早期的病理生理過(guò)程及分子機(jī)制，本研究選取形態(tài)學(xué)上最先出現(xiàn)病理變化的3h組作為重點(diǎn)研究對(duì)象，即經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)缺血再灌注3h的大鼠腎小管開(kāi)始出現(xiàn)少量的蛋白管型，提示腎小管功能開(kāi)始下降。在選取3h組和對(duì)照組進(jìn)行基因表達(dá)芯片檢測(cè)并通過(guò)生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析后，共發(fā)現(xiàn)了151個(gè)差異表達(dá)基因，其中132個(gè)顯著上調(diào)，19個(gè)顯著下調(diào)，GO與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示主要與細(xì)胞增殖的反向調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、免疫反應(yīng)等有關(guān)。

本研究挑選了3個(gè)差異顯著的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，其表達(dá)差異與基因芯片的結(jié)果基本一致。與對(duì)照組相比，3h組中的ANXA1、PHLDA1和KLF6基因均呈現(xiàn)顯著升高。其中，ANXA1所在的膜聯(lián)蛋白家族是一組由鈣離子調(diào)節(jié)、能夠結(jié)合到帶負(fù)電荷的膜磷脂上并參與一系列與鈣離子相關(guān)的生物學(xué)活動(dòng)的蛋白，其與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡關(guān)系密切[9]。Seidel等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1可抑制環(huán)氧合酶-2的形成和中性粒細(xì)胞的活性及游出，從而避免炎癥因子的合成和釋放。另一家族成員ANXA5已在腎缺血再灌注的研究中受到關(guān)注，其可通過(guò)阻斷磷脂酰絲氨酸依賴的免疫信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)發(fā)揮其抗炎作用，保護(hù)腎小管細(xì)胞[11]。因此，ANXA1在腎缺血再灌注早期的升高，極有可能通過(guò)抑制環(huán)氧合酶-2，阻斷免疫信號(hào)的傳導(dǎo)來(lái)發(fā)揮其抗炎作用，進(jìn)而保護(hù)缺血再灌注對(duì)腎組織造成的損傷。PHLDA1是編碼血小板同源結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)蛋白，廣泛參與細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)壬磉^(guò)程[12]。Lama等[13]研究表明，PHLDA1與腎近端小管上皮細(xì)胞的凋亡相關(guān)性強(qiáng)；Lyu等[14]研究表明，PHLDA1的表達(dá)受到JAK2-ERK1/2-STAT3信號(hào)通路的調(diào)控。因此，PHLDA1可能通過(guò)JAK2-ERK1/2-STAT3信號(hào)通路調(diào)控腎近端小管上皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而引發(fā)AKI。KLF6是Kruppel家族中普遍表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其與Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族的其他蛋白共有一個(gè)相似的羧基端，該羧基端可與DNA結(jié)合，但KLF6還具有獨(dú)特的氨基酸末端激活區(qū)、表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄靶基因，廣泛參與細(xì)胞的增殖分化、凋亡及組織修復(fù)等生理過(guò)程[15]。Mallipattu等[16]研究表明，KLF6可通過(guò)保護(hù)線粒體功能，拮抗凋亡，保護(hù)足細(xì)胞免受損傷。因此，KLF6在AKI早期模型中的升高可能是通過(guò)與DNA啟動(dòng)子的結(jié)合、調(diào)控線粒體基因的轉(zhuǎn)錄等，發(fā)揮保護(hù)腎近端小管上皮細(xì)胞凋亡的作用。

早期診斷、早期診療是減少AKI患者病死率的關(guān)鍵，但目前AKI的診斷標(biāo)準(zhǔn)仍主要以血清肌酐、尿素氮等傳統(tǒng)指標(biāo)為準(zhǔn)，無(wú)法滿足臨床早期診斷的需要，也給疾病分期和早期治療帶來(lái)一定的困難[17]。尋找早期的AKI標(biāo)志物是實(shí)現(xiàn)早期診斷的基礎(chǔ)，ANXA1、PHLDA1、KLF6三個(gè)差異基因在大鼠缺血再灌注模型早期的顯著升高，給AKI的早期診斷及分期提供了有效參考指標(biāo)，同時(shí)也為司法鑒定實(shí)踐過(guò)程中對(duì)AKI的損傷程度鑒定、分期提供了科學(xué)探索方向。ANXA1在疾病中的抗感染作用及KLF6的抗凋亡作用也為AKI靶向性治療研究提供新思路。

但目前對(duì)這三個(gè)基因的研究仍較為淺薄，尤其是其在急性腎缺血再灌注模型中的分子作用機(jī)制尚未明確，需要后續(xù)的深入研究才能更好地對(duì)AKI進(jìn)行定義和分期，實(shí)現(xiàn)早期診斷和靶向治療，這也將是今后的研究重點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過(guò)成功制備大鼠腎缺血再灌注損傷模型進(jìn)行基因表達(dá)芯片檢測(cè)和生物信息學(xué)分析差異基因，發(fā)現(xiàn)了一系列差異基因以及所涉及的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，為尋找AKI早期的分子靶點(diǎn)、進(jìn)一步研究AKI早期的發(fā)病機(jī)制以及探索新的治療靶點(diǎn)提供了方向。同時(shí)也為法醫(yī)在司法鑒定工作中針對(duì)AKI的損傷鑒定分期及預(yù)后評(píng)估提供了新的思路。

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Genes Expression in the Early Stage of Acute Renal Ischemia-reperfusion Injury in Rats

LIN Jun-yi1,MAO Xing2,WU Hui-juan2,XUE Ai-min1
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032, China;2.Department of Pathology,School of Basic Medical Sciences,Fudan University,Shanghai 200032, China）

ObjectiveTo study the differential genes expression in the early stage of acute renal ischemiareperfusion injury and explore potential molecular mechanisms.MethodsThe ischemia-reperfusion model was made via clamping renal artery of rat.The microarray detection and bioinformatics analyzing of the genes expression were performed.Differentially expressed genes were screened and related cellular activities and signaling pathways were analyzed in early stage of acute kidney injury.Meanwhile,molecules closely relative to acute kidney injury were explored by establishing a biological network of the differentially expressed genes,and the results were verified by real-time PCR.ResultsA total of 151 genes showed differential expression in this study,including 132 up-regulated and 19 down-regulated genes. Cell proliferation,cytokines mediated signaling transduction and immune responses were greatly enriched by GO and KEGG analysis.The results of real-time PCR showed that compared with control groups, three selected genes（ANXA1,PHLDA1 and KLF6）which related to the acute kidney injury had an obvious differential expression in the early stage of disease.The multiple of increase was essentially the same as the multiple detected by microarray.ConclusionThis study shows differential gene expression profile,related biological processes and signaling pathways involved in the early stage of acute kidney injury.ANXA1,PHLDA1 and KLF6 may play a role in the pathogenesis of acute kidney injury.

forensic pathology;reperfusion injury;differential gene expression;bioinformatics

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.001

1004-5619（2016）06-0401-05

2015-12-21）

（本文編輯：鄒冬華）

上海市科委科創(chuàng)項(xiàng)目（15140902900）

林俊毅（1989—），男，博士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：13111010032@fudan.edu.cn

薛愛(ài)民，男，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：amxue@fudan.edu.cn

通信作者：吳慧娟，女，講師，主要從事病理學(xué)研究；E-mail：hjwu@shmu.edu.cn