自噬在急性腦損傷的研究進(jìn)展

劉雪 王楓 熊利澤

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉及圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032)

·綜述·

自噬在急性腦損傷的研究進(jìn)展

劉雪 王楓 熊利澤*

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院麻醉及圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710032)

自噬; 急性腦損傷; 自噬誘導(dǎo); 自噬抑制; 神經(jīng)保護(hù); 神經(jīng)毒性

半個(gè)世紀(jì)以前，比利時(shí)細(xì)胞學(xué)家Christian de Duve用自噬這一術(shù)語(yǔ)來(lái)描述細(xì)胞利用溶酶體來(lái)消化胞漿成分這一過(guò)程。依據(jù)待降解產(chǎn)物運(yùn)送到溶酶體時(shí)的形態(tài)不同，自噬主要可以分為三類：①大自噬，其特征是形成獨(dú)特的雙層膜細(xì)胞器-自噬小體，這是一種通過(guò)自噬小體與溶酶體融合的途徑并在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著重要作用；②小自噬，溶酶體器膜將胞漿成分直接內(nèi)吞進(jìn)去；③分子伴侶介導(dǎo)的自噬，是由分子伴侶熱休克蛋白70、溶酶體相關(guān)的膜蛋白2A介導(dǎo)的降解過(guò)程[1]。而本文主要探討的是大自噬(以下稱之為自噬)。一般情況下，自噬保持在基線水平并維持亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。在沒(méi)有外部刺激的情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中正常的自噬功能對(duì)于維持神經(jīng)元的存活是必須的，另外，自噬通過(guò)監(jiān)測(cè)影響穩(wěn)態(tài)的一系列指標(biāo)來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境中的刺激。因此，細(xì)胞可以調(diào)整自噬流，即，進(jìn)行著的自噬反應(yīng)協(xié)同溶酶體降解來(lái)應(yīng)對(duì)胞內(nèi)或胞外微環(huán)境的變動(dòng)，適應(yīng)性自噬經(jīng)常介導(dǎo)顯著的細(xì)胞保護(hù)作用和抗炎效應(yīng)[2]。因此，自噬的缺陷會(huì)導(dǎo)致多種細(xì)胞穩(wěn)態(tài)喪失和隨后細(xì)胞死亡的人體病理學(xué)，這些病理過(guò)程包括心血管和腎臟疾病。另外，自噬缺陷會(huì)削弱抗炎反應(yīng)穩(wěn)態(tài)并增加宿主對(duì)感染性疾病的易感性，并且越來(lái)越多的證據(jù)表明功能性的自噬反應(yīng)至少在一些情況下參與了一種特殊類型的細(xì)胞死亡方式，稱為可調(diào)控的細(xì)胞死亡(regulated cell death, RCD)，又稱為自噬性死亡[3]。這一證據(jù)說(shuō)明了自噬在某些特定環(huán)境下調(diào)控細(xì)胞毒性作用而不是細(xì)胞保護(hù)作用。在這篇綜述中，我們討論了近期的發(fā)現(xiàn)表明在不同類型的非感染性急性腦損傷中自噬發(fā)揮環(huán)境特異性影響，包括興奮性毒性改變、神經(jīng)毒性、新生兒窒息、成人腦卒中和神經(jīng)創(chuàng)傷，著重強(qiáng)調(diào)使用自噬的藥物調(diào)控(激動(dòng)劑或抑制劑)發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用。

一、自噬總體的調(diào)控

自噬取決于自噬相關(guān)蛋白家族的多種成員，協(xié)同作用介導(dǎo)自噬的啟動(dòng)、囊泡成核、囊泡的擴(kuò)展以及囊泡融合、自噬小體的降解退化[4]。自噬相關(guān)基因(autophagy related gene, ATG) 9是介導(dǎo)自噬小體形成中的一個(gè)重要的蛋白，ATG3、ATG4和ATG7共同催化微管相關(guān)的蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated membrane protein 1 light chain 3 B, MAP1LC3B)的脂化，而這一蛋白隨后積累在自噬小體膜上并結(jié)合待降解產(chǎn)物以便進(jìn)行自噬性降解。另外，ATG7與ATG10共同促進(jìn)ATG5-ATG12-ATG16L1 (autophagy related gene 16-like 1)復(fù)合物的形成，這一過(guò)程有助于自噬小體的延伸[5]。在眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中影響自噬激活狀態(tài)的有兩個(gè)多蛋白復(fù)合物：雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1 (mammalian target of rapamycin complex 1, MTORC1)或超大分子復(fù)雜混合物(beclin1, BECN1)和3型磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic type 3, PI3KC3/VPS34)。MTORC1包含雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, MTOR)和MTOR調(diào)控相關(guān)蛋白，作為自噬的主要抑制劑，與此相反，BECN1-VPS34復(fù)合物通過(guò)催化磷脂酰肌醇3磷酸化而促進(jìn)自噬進(jìn)程[4]。在在體和離體實(shí)驗(yàn)中一些代謝的、物理的和化學(xué)的誘因可以促進(jìn)自噬形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征的表現(xiàn)，包括多種自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，如ATG5、ATG7，以及Sequestosome1(p62)的降解，胞質(zhì)內(nèi)自噬小體和自噬溶酶體(胞質(zhì)液泡化)的累積，以及自噬相關(guān)蛋白8(microtubule-associated membrane protein 1 light chain 3, LC3)的脂化[2]。然而，胞質(zhì)液泡化和LC3脂化反映了自噬容量的增加，意味著當(dāng)自噬小體與溶酶體無(wú)法融合或溶酶體功能受阻時(shí)自噬小體的數(shù)量仍是增加的，因此監(jiān)測(cè)自噬流對(duì)于理解其正在進(jìn)行或者是自噬被阻斷變得至關(guān)重要。當(dāng)神經(jīng)毒性伴隨著自噬流阻斷，加快自噬清除或抑制自噬小體的形成或許能介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用，而此時(shí)藥物促進(jìn)自噬小體的形成或抑制溶酶體降解則發(fā)揮毒害作用。

二、自噬在急性腦損傷中的作用

1.自噬在興奮性毒性中的作用：興奮性毒性指的是突觸后膜延長(zhǎng)的去極化導(dǎo)致持續(xù)的鈣離子內(nèi)流。興奮性毒性物質(zhì)如谷氨酸、喹啉酸、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)和紅藻氨酸等被報(bào)道在嚙齒類動(dòng)物中能誘導(dǎo)自噬反應(yīng)上調(diào)。然而，自噬是否保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒性損傷還不明確。證據(jù)(特別是離體實(shí)驗(yàn))表明自噬或許能減輕興奮毒性的有害影響，自噬的藥物激活劑，包括雷帕霉素和海藻糖保護(hù)新生大鼠海馬神經(jīng)元在離體實(shí)驗(yàn)中由谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性死亡，而氯喹(自噬抑制劑)在這種環(huán)境下沒(méi)有有益的影響[6]。丙酮酸鹽(刺激VPS34激活和保存適宜的生物能量)減少谷氨酸應(yīng)用于人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，而這種效應(yīng)可以被非特異性VPS34抑制劑3-甲基腺嘌呤阻斷。鋰(刺激自噬)通過(guò)產(chǎn)生海藻酸來(lái)抑制興奮性毒性物質(zhì)對(duì)雞或小鼠胚胎脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損害。另外，BECN1或高遷移率族蛋白1 (high mobility group box-1 protein, HMGB1)的敲除則增加了培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元對(duì)NMDA的敏感性[7]。這些結(jié)果說(shuō)明至少在某些情況下，谷氨酸或其它興奮毒性物質(zhì)或許能通過(guò)造成線粒體功能紊亂和因此帶來(lái)的氧化壓力而阻斷自噬反應(yīng)，在這種情況下上調(diào)自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.自噬在急性神經(jīng)毒性反應(yīng)中的作用：急性神經(jīng)毒性指的是暴露于神經(jīng)毒素幾個(gè)小時(shí)到幾天。魚(yú)藤酮為一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下抑制線粒體呼吸鏈一型復(fù)合物，在大鼠和小鼠上建立一種帕金森疾病樣狀態(tài)。神經(jīng)元細(xì)胞系急性暴露于魚(yú)藤酮導(dǎo)致快速的RCD以及自噬現(xiàn)象。自噬的藥物激活劑包括雷帕霉素、去鐵胺(鐵的螯合劑，激活自噬)、山奈酚[一種植物雌激素，可以激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)]減少了魚(yú)藤酮對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞系的神經(jīng)毒性效應(yīng)。當(dāng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系暴露于魚(yú)藤酮，敲除高度特異的亮氨酸傳感器(sestrin2, SESN2)(MTORC1抑制劑的上游因子)，削弱了自噬反應(yīng)并加重了神經(jīng)毒性作用，然而SESN2的過(guò)表達(dá)則激活了AMPK依賴的自噬反應(yīng)，同時(shí)抑制了RCD[8]。使用小干擾RNA特異性下調(diào)3-磷酸甘油醛脫氫酶，這種酶能夠發(fā)揮自噬調(diào)控功能，在大鼠心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)上得出了類似的結(jié)果[9]。敲除人類神經(jīng)元細(xì)胞系中BECN1或LC3則增加其對(duì)奧氮平的敏感性，在氯喹出現(xiàn)的情況下小鼠對(duì)奧氮平的敏感性同樣也是增加的[10]?？傊陨线@些現(xiàn)象傾向于支持自噬反應(yīng)限制急性神經(jīng)毒性損傷作用。

3.自噬在新生兒窒息中的作用：新生兒死于缺血缺氧性腦病在多個(gè)大腦區(qū)域中表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和生化上自噬水平上調(diào)，這些區(qū)域包括神經(jīng)節(jié)、丘腦、皮層和海馬。這些自噬的標(biāo)記包括胞質(zhì)的液泡化、BECN1上調(diào)、LC3脂化和p62降解[11]。一般來(lái)說(shuō)，嚙齒類動(dòng)物神經(jīng)元在新生兒窒息模型中表現(xiàn)出自噬上調(diào)、RCD和進(jìn)行著的細(xì)胞降解。這些特征包括軸突或突觸的腫脹，線粒體碎片化，染色質(zhì)碎片化或固縮以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)激活等。第一個(gè)研究新生大鼠缺血缺氧模型的實(shí)驗(yàn)觀察了在缺血后給予雷帕霉素可以減少模型帶來(lái)的損傷[12]。同時(shí)這種神經(jīng)保護(hù)作用可以被隨后應(yīng)用的3-甲基腺嘌呤阻斷[13]，證明這種保護(hù)效應(yīng)來(lái)自于自噬反應(yīng)。然而，盡管缺血后給予3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素改變了神經(jīng)元死亡的分子機(jī)制(從caspase 3-依賴的凋亡到壞死)，并沒(méi)有一種自噬抑制劑能真正地減輕新生大鼠在缺血缺氧中的損傷[12]。與此有爭(zhēng)議的結(jié)論是，鋰(激活自噬)在大鼠新生兒缺血缺氧模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但卻降低了LC3脂化，這一現(xiàn)象同自噬抑制相一致，而不是激活。另外，其它幾個(gè)獨(dú)立的團(tuán)隊(duì)得出以下結(jié)果，3-甲基腺嘌呤降低原代大鼠皮層神經(jīng)元、大鼠海馬切片以及人類神經(jīng)元細(xì)胞系暴露于氧糖剝奪狀態(tài)下的細(xì)胞死亡[14]。類似的，新生大鼠在缺血后(缺血后4 h)在側(cè)腦室給予3-甲基腺嘌呤相比對(duì)照組明顯減少了病損面積[15]?？偨Y(jié)起來(lái)，這些數(shù)據(jù)對(duì)于自噬在新生兒缺血缺氧中的作用并未得出一致結(jié)論。

4.自噬在成人腦卒中中的作用：成年小鼠或大鼠在給予缺血損傷后表現(xiàn)出自噬水平上調(diào)的特征。至少有兩條證據(jù)表明自噬在成年嚙齒類動(dòng)物暴露于缺血事件中如短暫的大腦中動(dòng)脈缺血(transient middle cerebral occlusion, tMCAO; 通常是缺血30 min到3 h)或永久的大腦中動(dòng)脈缺血(permanent middle cerebral occlusion, pMCAO)發(fā)揮保護(hù)作用。首先，使用基因水平的干涉手段抑制自噬水平，包括敲除線粒體超氧化物歧化酶2、S-抗原、視網(wǎng)膜和松果體(抑制蛋白)，或者是使用靶向編碼結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白1-基因的shRNA[16]，加重了神經(jīng)元在tMCAO或pMCAO中的損傷。使用立體定位技術(shù)過(guò)表達(dá)尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，上調(diào)自噬水平，在成年大鼠遭受tMCAO損傷時(shí)發(fā)揮了顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。另外，抑制自噬水平，如敲除蛋白激酶AMP-激活的α2催化亞基或去乙酰化酶1，或下調(diào)ATG7或結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白1則加重了原代大鼠或小鼠皮層神經(jīng)元暴露于氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)下的神經(jīng)毒性。使用干擾RNA技術(shù)介導(dǎo)溶酶體相關(guān)的膜蛋白2(介導(dǎo)分子伴侶介導(dǎo)的自噬)而不是ATG5(特異性參與大自噬)，增加了小鼠來(lái)源的神經(jīng)瘤母細(xì)胞(mouse neuroblastoma N2a cells, Neuro-2a)細(xì)胞對(duì)單獨(dú)缺氧的易感性，然而使用麥考酚酸激活分子伴侶介導(dǎo)的自噬則會(huì)帶來(lái)顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[17]。這些發(fā)現(xiàn)證明了不同形式的自噬類型在不同情況下缺血損傷的中發(fā)揮不同的作用。使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素在小鼠tMCAO或pMCAO模型中減少了腦梗面積；然而，類似的結(jié)果卻在使用了自噬抑制劑氯喹(盡管神經(jīng)保護(hù)作用比較輕微)上得出。另外，盡管3-甲基腺嘌呤或mdivi-1(線粒體自噬的抑制劑)加重了小鼠神經(jīng)元在tMCAO中的喪失，然而在pMCAO模型中卻表現(xiàn)出了神經(jīng)保護(hù)作用或無(wú)作用[18]。近期的研究成果對(duì)自噬在成人腦卒中模型中總是發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用提出質(zhì)疑。因此，總結(jié)以上結(jié)果，我們對(duì)自噬在成人腦卒中介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)毒性損傷作用并不能得出一致結(jié)論。

5.自噬在神經(jīng)創(chuàng)傷中的作用：自噬在幾種不同類型中的神經(jīng)創(chuàng)傷中都有研究，包括脊柱損傷，蛛網(wǎng)膜下腔出血和創(chuàng)傷性腦損害，其自噬的形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)明顯上調(diào)，無(wú)論在嚙齒類動(dòng)物還是在人類活體組織切片上。只有兩個(gè)研究試圖闡明這些生化指標(biāo)反映的是自噬本身水平的上調(diào)還是由于自噬被阻斷，這兩項(xiàng)研究均傾向于后者。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在神經(jīng)創(chuàng)傷的動(dòng)物模型中自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，有助于功能恢復(fù)。針對(duì)病灶雷帕霉素促進(jìn)神經(jīng)元存活，促進(jìn)軸突再生并促進(jìn)嚙齒類動(dòng)物在脊柱損傷中的后肢功能[19]。類似的結(jié)果也在自噬激活措施中得到證明，包括脊柱損傷后給予人類血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A (vascular endothelial growth factor A 165, VEGFA165)[20]，視黃酸(減少血-脊柱屏障破壞)和辛伐他汀(抗粥樣硬化藥物)。然而，VEGFA165或視黃酸的神經(jīng)保護(hù)作用都能分別被3-甲基腺嘌呤或氯喹阻斷。雷帕霉素限制了脊柱損傷并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，即便是患有糖尿病的大鼠(其對(duì)神經(jīng)病理?yè)p傷的敏感性高于野生型大鼠)。另外，3-甲基腺嘌呤或敲除BECN1都能加重原代脊柱神經(jīng)元細(xì)胞在機(jī)械性損傷中的死亡率，然而B(niǎo)ECN1的過(guò)表達(dá)或使用雷帕霉素則發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素、褪黑激素、辛伐他汀、曲古菌素A或重組的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (cystatin C, CST3)都能減少大鼠在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的大腦創(chuàng)傷[22]。在這種環(huán)境下，使用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素抑制自噬水平則加重蛛網(wǎng)膜下腔出血急行神經(jīng)退行性疾病，或廢除自噬激活帶來(lái)的神經(jīng)保護(hù)作用。總的來(lái)說(shuō)自噬對(duì)抗由脊柱損傷和蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的急性神經(jīng)退行性疾病。

三、結(jié)語(yǔ)和展望

正如上述討論，自噬在某些急性腦損傷中存在影響，包括多種精神藥物中毒、脊柱損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、新生兒缺血缺氧等等，然而，針對(duì)不同的急性腦損傷類型，包括興奮性毒性、可卡因中毒、成人腦卒中和創(chuàng)傷性腦損害等自噬反應(yīng)調(diào)控也存在差異。近20年在頂尖雜志上的文章得出的結(jié)果具有異質(zhì)性同時(shí)是明顯矛盾的。盡管這些結(jié)果部分差異性應(yīng)歸咎于實(shí)驗(yàn)因素的不同(包括模型類型、強(qiáng)度和神經(jīng)毒性的耐受性)，但至少有四部分因素應(yīng)該被考慮在內(nèi)：①刺激的密度和強(qiáng)度或許能決定自噬在神經(jīng)元暴露于急性壓力(當(dāng)神經(jīng)毒性狀態(tài)比較強(qiáng)并且被延長(zhǎng))時(shí)的死亡或產(chǎn)生顯著的細(xì)胞保護(hù)作用和密封效應(yīng)(當(dāng)神經(jīng)毒性狀態(tài)比較弱或及時(shí)被限制)。②大多數(shù)的這些研究缺少檢測(cè)精確的自噬流。③以上的研究中自噬大多被藥物所調(diào)控，而這些藥物所表現(xiàn)的特異性都不是很高(如3-甲基腺嘌呤或溶酶體抑制劑)，或者在基因水平上靶向自噬的某單一成分，而這些蛋白很可能參與到其他同自噬無(wú)關(guān)的通路中。④由急性腦損害產(chǎn)生的局部炎癥反應(yīng)所帶來(lái)的長(zhǎng)期功能損害至少部分是因?yàn)樾∧z質(zhì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)垂死神經(jīng)元釋放的危險(xiǎn)信號(hào)所啟動(dòng)的。因此這些自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑所帶來(lái)的效應(yīng)可能來(lái)源于：自噬對(duì)釋放的危險(xiǎn)信號(hào)的影響；自噬對(duì)炎癥的控制；或自噬的藥物調(diào)控影響炎癥反應(yīng)作為一種非靶向效應(yīng)。一個(gè)比較相關(guān)的例子是自噬抑制劑氯喹有明顯的抗炎效應(yīng)，同時(shí)這種抗炎效應(yīng)可以用來(lái)治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡?？偨Y(jié)全篇，以上這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)急需使用一種更好的工具或方法檢測(cè)在急性腦損傷中自噬的確切影響。

致謝：衷心感謝西京醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科王楓講師對(duì)于撰寫(xiě)論文的幫助和支持！感謝對(duì)于課題的指導(dǎo)！

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1671-2897(2017)16-371-03

國(guó)家自然科學(xué)基金-國(guó)際合作與交流項(xiàng)目資助項(xiàng)目(81420108013)

劉雪，碩士研究生，E-mail: 15229059536@163.com

*通訊作者：熊利澤，教授，E-mail: mzkxlz@126.com

R 782.05+4

A

2016-11-20；

2017-03-05)