嵌合抗原受體修飾T細胞在血液腫瘤中的研究進展

姜華 吳國清?

嵌合抗原受體修飾T細胞在血液腫瘤中的研究進展

姜華 吳國清?

嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T）技術近年來在血液腫瘤的臨床研究中取得良好的療效。在美國基于CD19的CAR-T療法已經進入Ⅱ期臨床試驗階段，前景可觀。CAR-T靶向惡性腫瘤細胞抗原，將能夠識別該抗原的結構通過基因工程技術的手段使其在患者T細胞的表面，進而特異性的識別惡性腫瘤細胞，最終將其殺滅。

1 CAR的結構

CAR是人為設計的結構，主要包括胞外抗原結合區(qū)，跨膜區(qū)，胞內信號區(qū)。胞外抗原結合區(qū)主要是來源于與腫瘤特異性抗原相對應的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)（single-chain variable fragment，scFv），通過跨膜區(qū)與胞內的信號區(qū)相連。胞內信號區(qū)最初包括TCR復合體的CD3ζ鏈，具有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAMs）負責T細胞信號的轉導［1］。CAR-T的優(yōu)勢是通過MHC非限制性的方式識別腫瘤抗原，有效避免有些腫瘤細胞因MHC表達降低而造成的免疫逃逸［2］。1987年Kuwana課題組首次將免疫球蛋白的V區(qū)與T細胞受體（T cell receptor，TCR）的α鏈和β鏈的恒定區(qū)融合構建可特異識別腫瘤細胞的CAR 原型［3］。隨后CAR 經歷多種修飾（見圖1）。從最初的單一信號分子發(fā)展到加入共刺激分子［4-5］，再到將細胞因子的基因也一同導入，逐漸增強CAR-T的識別能力，使這項技術更為精準、安全。加入細胞因子基因可以在T細胞殺傷腫瘤細胞的同時可以釋放大量的穿孔素、顆粒酶或表達FasL配體、腫瘤壞死因子（TNF）等［6］，從而誘導腫瘤細胞的凋亡。

CAR-T細胞制備的基本過程：通過淋巴細胞單采技術從患者體內采集外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），并在體外用載體將CAR的基因導入T細胞，并進行大量擴增，再回輸入患者的體內。通過基因工程技術改造的T細胞可特異性識別腫瘤細胞并通過釋放細胞因子誘導腫瘤細胞的凋亡。目前應用于臨床試驗的導入外源基因的載體有病毒載體（逆轉錄病毒、慢病毒等）和非病毒載體（點穿孔技術、脂質體轉染等）。最早的CAR-T構建時使用的是逆轉錄病毒，其安全性及穩(wěn)定性均可圈可點［7］。逆轉錄病毒感染主要是分裂期細胞，對于非分裂細胞感染能力較差，而慢病毒則對分裂和非分裂期細胞均具有較好的感染能力。因此絕大多數CAR-T細胞制備時使用的是慢病毒系統(tǒng)。除此之外，轉座子轉染以其低毒、不易引起插入突變和機體的免疫反應等優(yōu)點，越來越多的被應用在外源基因轉導中。被譽為“睡美人”（sleeping beauty，SB）的DNA轉座子是一種天然的、非病毒載體，可以攜帶特定的DNA片段進行基因轉移。應用SB轉座子能將目的基因轉移至體細胞、胚胎干細胞及分裂期細胞和非分裂期細胞，研究表明目的基因在整合到基因組后均能長期穩(wěn)定表達［8］。但其不足之處是SB的轉染效率不夠高。

2 CAR-T在血液腫瘤中的研究進展

2.1 B系血液腫瘤 B細胞是來源于骨髓的多能造血干細胞。CD19表面抗原表達于除漿細胞外的幾乎所有的B細胞表面，成為B系血液腫瘤良好的表面標志，基于CD19的CAR-T應運而生。2011年，美國賓夕法尼亞州大學Carl H.June領導的團隊在新英格蘭醫(yī)學雜志報道采用針對CD19的CAR-T細胞治療1例難治性慢性B淋巴細胞白血病，獲得完全緩解，并持續(xù)6個月［9］，這是首次單獨用免疫治療對晚期白血病治療獲得成功，此后CAR-T迅速成為熱點的研究方向。Jena小組用逆轉錄病毒轉染CAR結構序列應用于急性和慢性B系淋巴細胞白血病患者，后期結果顯示，臨床應用安全有效［10］。CD20這個靶點主要用于治療B細胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），而CD22在急性淋巴細胞白血?。˙-ALL）和成熟淋巴細胞惡性腫瘤上高表達，對于CD19低表達或CD19分子丟失的B-ALL細胞而言，CD22有希望成為CD19在B-ALL上的替代靶點。此外，將抗體藥物與CAR-T療法聯合應用有可能增強T細胞的增殖能力，同時減輕移植物排斥反應［11-12］。

2.2 急性髓細胞白血?。ˋcute Myeloid Leukemia，AML）對于AML，有研究應用Lewis Y（LeY）抗原和NKG2D這兩種抗原作為治療的靶點進行了探索。LeY寡糖抗原是腫瘤相關糖抗原，存在于erbB癌基因編碼的產物中。其被證實不表達于紅細胞表面，極少表達于正常組織的細胞表面，但表達于多數的血液腫瘤細胞表面，其中包括AML［13］。2013年一項研究中，4例AML高危患者應用針對該抗原的二代CAR-T，其中3例患者有效。但CAR-T細胞持續(xù)存在的情況下，疾病依然緩慢進展［14］。NKG2D是由NK細胞和T細胞表達的一種活化的受體，而NKG2D配體在正常組織中呈現限制性的表達，但其在惡性腫瘤和被感染的細胞內通常是過表達。有研究嘗試基于NKG2D配體構建CAR［15］，但依然受制于嚴重的細胞毒性［16］。在CD33和CD123的研究中，似乎靶向CD123的CAR-T對于正常細胞的殺傷更?。?7-19］。但兩者造成的細胞毒性同樣不可忽視。從抗原抗體親和力考慮，將特異性受體如葉酸等嵌入CAR-T結構中，有望提高T細胞的抗腫瘤活性，降低毒副反應。

2.3 多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM） MM是漿細胞異常增生的惡性腫瘤。由于最佳靶點CD19在漿細胞的缺失，研究人員致力于尋找漿細胞特異性的靶點，而骨髓瘤細胞表面糖蛋白CS1是其中之一。CS1表達于多數的惡性漿細胞和部分正常漿細胞，淋巴細胞、活化的單核細胞和樹突狀細胞也有較低水平的表達，但并未見于其他的正常組織［20］。目前應用于MM晚期的一種可溶性抗體伊洛珠單抗elotuzumab，即是靶向CS1［21］。2014年 Chu J小組設計針對該抗原的CAR，其同時轉染T細胞和NK細胞，結果發(fā)現在小鼠模型中能夠有效抑制MM疾病進程，顯著延長小鼠的生存期。因此CS1可能成為治療MM的有效靶點［22-23］。盡管如此，這種方法仍存在擔憂，因這種CAR可能會通過CS1攻擊活化的T細胞，從而損傷正常T細胞。此外，CS1是可溶性抗原，這對CAR-T在體內發(fā)揮抗腫瘤作用也是一個挑戰(zhàn)。此外潛在的靶點還包括κ輕鏈、CD138、B細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）、細胞表面糖蛋白CD38、NKG2D 、CD44v6等［24-25］。目前，MM的治療受制于MM復雜性、表型和功能的異質性及微環(huán)境，故療效并不理想［26-27］。

3 CAR-T細胞面臨的難題與未來的設想

CAR-T目前面臨的主要難題是“脫靶”效應，即CAR-T對于正常細胞和組織的殺傷［28］。基于CD19的CAR-T對于正常B細胞的殺傷尤其嚴重。Rosenberg小組在2011年進行臨床實驗來評估抗CD19-CAR-T造成的B系細胞的毒性，結果發(fā)現，8例患者中有4例表現為長期的B系細胞發(fā)育不良，而此類的副作用屢見不鮮。另一個嚴重的毒副作用即細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），造成部分患者死亡，死亡患者中血清炎性介質IFNγ和TNF的顯著升高［29］。引起CRS較常見的炎性細胞因子是白細胞介素6（Interleukin 6，IL-6），應用抗IL-6的抗體可以緩解由于CRS引起的機體損傷，損傷嚴重時可以應用甾體或激素類藥物，但需要明確的是這些藥物會顯著降低CAR-T的療效［30］。CRS引起的器官損傷，幾乎包括所有系統(tǒng)，比如神經系統(tǒng)出現頭痛，高熱，譫妄，失語，甚至腦水腫，這可能與炎癥介質IFNγ、IL-6有關；心血管毒性，可能由發(fā)熱引起的心動過速，低血壓，射血分數下降，原因未知的心肌負荷加重，心臟停博；呼吸系統(tǒng)出現肺水腫，呼吸困難，窒息，肺炎；急性腎臟損傷，膽紅素的上升，三系細胞減少，乏力，肌痛，關節(jié)痛，食欲下降等。除此以外，變態(tài)反應和移植物抗宿主病也危害機體甚至造成死亡［31］。

CAR-T發(fā)展至今已經走過20+年，縱觀CAR-T的發(fā)展歷程，有幾點展望：首先，尋找最佳的腫瘤特異性抗原是解決目前較為嚴重的“脫靶” 效應的關鍵；其次，探索最佳的CAR結構，包括合理的CM，細胞因子，載體等；再次，如何克服T細胞回輸后在體內持續(xù)增殖的問題，最后，尋找有效預防和治療CRS及其他副作用的方法。目前一些新嘗試包括：在CAR的基礎上引入自殺基因、分子開關或開發(fā)多靶點CAR-T技術；應用非整合性的慢病毒載體、電穿孔、睡美人轉座子等技術解決潛在的插入突變問題，改善長期安全性；應用CRISPR/cas9技術改造CAR-T細胞，即對回輸的CAR-T細胞敲除內源性的TCR和MHC分子，避免引起宿主的免疫排斥反應，提高CAR-T細胞識別的效率；CAR-T中加入趨向因子受體，增強其靶向性。綜上所述，目前的臨床研究發(fā)現CAR-T細胞治療血液腫瘤療效顯著，未來CAR-T細胞必將成為治療血液腫瘤的重要手段之一，但其安全性及特異性還有待進一步提高。

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310053 浙江中醫(yī)藥大學（姜華）310000 浙江省人民醫(yī)院（吳國清）

*通信作者