干細(xì)胞在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的應(yīng)用

吳佳源 劉俊?

·綜述·

干細(xì)胞在內(nèi)耳毛細(xì)胞再生中的應(yīng)用

吳佳源 劉俊?

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有2.78億人患有耳聾疾?。?］。永久性聽(tīng)力損失是由于耳蝸內(nèi)的毛細(xì)胞喪失了再生能力［2］。目前恢復(fù)因耳蝸毛細(xì)胞丟失而引起的中重度聽(tīng)力損失的唯一方法是使用人工耳蝸或助聽(tīng)器直接刺激聽(tīng)神經(jīng)。但其使用受限于復(fù)雜的聽(tīng)力損傷機(jī)制和組織損傷程度［3］。理想的解決方案是用干細(xì)胞、基因、藥物治療阻止耳蝸毛細(xì)胞的丟失或再生耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元［4］。本文對(duì)干細(xì)胞再生耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元作如下綜述。

1 內(nèi)耳干細(xì)胞

在哺乳動(dòng)物中，毛細(xì)胞的生成只出現(xiàn)在早期胚胎形成過(guò)程中相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)。在成熟的Corti器里，一旦毛細(xì)胞死亡，其便不會(huì)再生［5］。盡管哺乳動(dòng)物內(nèi)耳不能再生丟失的毛細(xì)胞，但仍然有證據(jù)表明哺乳動(dòng)物內(nèi)耳具有某種再生能力的細(xì)胞，因可以從前庭感覺(jué)上皮和新生的耳蝸中分離出這種細(xì)胞［6］。這些細(xì)胞被稱之為內(nèi)耳胚胎干細(xì)胞。

非哺乳脊椎動(dòng)物的內(nèi)耳胚胎干細(xì)胞存在于內(nèi)耳感覺(jué)上皮區(qū)且這些細(xì)胞可以產(chǎn)生一個(gè)顯著再生反應(yīng)。與此相反，哺乳動(dòng)物的內(nèi)耳干細(xì)胞僅存在于年輕內(nèi)耳感覺(jué)上皮，其數(shù)量會(huì)隨時(shí)間的推移顯著降低（耳蝸甚至?xí)档搅悖?。雖然這些細(xì)胞數(shù)目較少，僅占一個(gè)橢圓囊細(xì)胞中0.025%的細(xì)胞，但其擁有干細(xì)胞最重要的特征即自我更新和具有多功能性［7］。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物幸存的支持細(xì)胞也可以被誘導(dǎo)橫向分化成新的毛細(xì)胞［8］。哺乳動(dòng)物耳蝸的支持細(xì)胞和鳥類耳蝸毛細(xì)胞來(lái)源于相同的祖細(xì)胞。然而在成年哺乳動(dòng)物中，對(duì)于耳蝸毛細(xì)胞的損傷，這些支持細(xì)胞并不能做出反應(yīng)而自發(fā)的分化成毛細(xì)胞［9］。這可能是由于相應(yīng)信號(hào)的缺乏或某種抑制劑的存在而導(dǎo)致成年哺乳動(dòng)物前庭上皮的低再生能力［10］。

在內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞周期抑制因子起著重要作用。例如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白（CDK抑制蛋白）—p27kip1及p19Ink4d。p27kip1的表達(dá)在毛細(xì)胞的分化過(guò)程中逐漸下降，而在成熟Corti器的有絲分裂后期支持細(xì)胞中卻持續(xù)表達(dá)。這表明p27kip1的一個(gè)主要作用便是維持支持細(xì)胞的靜息狀態(tài)。這也暗示抑制p27kip1的表達(dá)可以促進(jìn)感覺(jué)細(xì)胞的前體細(xì)胞增殖，同時(shí)對(duì)于哺乳動(dòng)物聽(tīng)力器官中毛細(xì)胞再生的誘導(dǎo)提供一條重要途徑。p19Ink4d的作用 跟p27kip1一樣，其共同作用維持著已分化的感覺(jué)細(xì)胞的靜息狀態(tài)［11］。內(nèi)耳毛細(xì)胞增殖同樣也受成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（RB蛋白）控制。RB蛋白的主要作用同樣也是維持細(xì)胞的靜息狀態(tài)［12］。研究發(fā)現(xiàn)抑制老鼠未分化毛細(xì)胞的前體細(xì)胞RB蛋白的激活可以導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞的擴(kuò)增及新的毛細(xì)胞的生成［13］。臨時(shí)或永恒抑制這些細(xì)胞周期抑制因子也許會(huì)生成新的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，這也給治療感音神經(jīng)性耳聾提供一種新的治療方法。ATOH1基因編碼轉(zhuǎn)錄因子Math1有助于神經(jīng)元和耳蝸毛細(xì)胞的生成，當(dāng)一些哺乳動(dòng)物的支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Math1被過(guò)表達(dá)時(shí)，這些細(xì)胞便會(huì)改變形態(tài)以增加耳蝸毛細(xì)胞纖毛的數(shù)量，同時(shí)也會(huì)促進(jìn)腦干誘發(fā)電位的功能恢復(fù)［14］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)notch信號(hào)在毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的分化過(guò)程中起至關(guān)重要的作用［15］。當(dāng)notch信號(hào)被抑制時(shí)，新的毛細(xì)胞可以被誘導(dǎo)生成，還發(fā)現(xiàn)噪音刺激引起的聽(tīng)力損傷可以被部分恢復(fù)［14］。

因此在耳聾動(dòng)物的耳蝸里對(duì)于細(xì)胞周期抑制因子、ATOH1基因和notch信號(hào)通路的調(diào)控可能是一種讓毛細(xì)胞再生的有效方法。

2 外耳干細(xì)胞

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（也稱為骨髓基質(zhì)細(xì)胞）是多能的且能在體內(nèi)和體外修復(fù)組織。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以產(chǎn)生骨和軟骨且還能分化成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞及最重要的神經(jīng)細(xì)胞。由于這些原因，間充質(zhì)干細(xì)胞是一種用于干細(xì)胞替代療法的有前景的細(xì)胞來(lái)源。

Jae-Hong Lee等從SD大鼠骨髓中分離得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)14d后發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞和施萬(wàn)細(xì)胞的比例遠(yuǎn)高于毛細(xì)胞［16］。Sujeong Jang等成功將神經(jīng)誘導(dǎo)的人類間充質(zhì)干細(xì)胞移植入成年雌性豚鼠耳蝸，發(fā)現(xiàn)被植入的細(xì)胞主要存在于受損耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器及耳蝸神經(jīng)，且這些細(xì)胞可以存活8周。在注入NI-hMSCs后的成年雌性豚鼠與注入平衡鹽溶液的對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)前者的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目有所增加，被嫁接的人類間充質(zhì)干細(xì)胞也表達(dá)一種成熟的神經(jīng)元標(biāo)志—MAP2。這表明人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化成神經(jīng)細(xì)胞且可以替代丟失的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［17］。因此間充質(zhì)細(xì)胞可以被用來(lái)治療因螺旋神經(jīng)節(jié)退化而導(dǎo)致的神經(jīng)性聽(tīng)力損失和提高人工耳蝸植入的成功率［18］。

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞 成人神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新能力和多能性。神經(jīng)干細(xì)胞可以從發(fā)育中的大腦區(qū)域中分離獲得，包括大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和嗅覺(jué)上皮［19-20］。移植的神經(jīng)干細(xì)胞被證明可以遷移至腦損傷部位并分化成原生的細(xì)胞類型，諸如少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮質(zhì)神經(jīng)元和脊髓神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元。這些結(jié)果表明，神經(jīng)干細(xì)胞既能替換損壞的神經(jīng)組織又能恢復(fù)損傷后的功能。

Parker等將克隆神經(jīng)干細(xì)胞（cNSCs）注入至聽(tīng)力受損的小鼠和豚鼠的鼓階中，6周以后，在兩組動(dòng)物模型中的一些cNSCs均出現(xiàn)在整個(gè)耳蝸中并顯現(xiàn)出神經(jīng)耳蝸組織（例如：螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，衛(wèi)星細(xì)胞和雪旺細(xì)胞）和柯蒂器細(xì)胞（柱細(xì)胞、支持細(xì)胞和毛細(xì)胞）的形態(tài)學(xué)，蛋白質(zhì)和基因的特征。被植入的cNSCs在形態(tài)學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)上的不同取決于其在耳蝸內(nèi)所處的位置，這表明耳蝸內(nèi)的微環(huán)境對(duì)cNSCs的發(fā)展起到重要作用。一旦這個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞系遷移至耳蝸內(nèi)，接受來(lái)自微環(huán)境的信號(hào)后，這些細(xì)胞便表達(dá)由內(nèi)耳細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞基因命運(yùn)程序，并對(duì)該程序進(jìn)行正反饋和負(fù)反饋的調(diào)節(jié)以達(dá)到平衡。這些結(jié)果表明干細(xì)胞具有發(fā)展?jié)摿?。同時(shí)也表明成年哺乳動(dòng)物耳蝸內(nèi)還保留著一些信號(hào)，這些信號(hào)對(duì)于干細(xì)胞沿著耳蝸的表型分化是必要的，盡管這些信號(hào)并不能作用于內(nèi)耳的細(xì)胞群從而再生這些細(xì)胞［21］。

2.3 胚胎干細(xì)胞 胚胎細(xì)胞的巨大潛力在于其在無(wú)限增長(zhǎng)的同時(shí)還能保持多能性，且可以分化成所有三個(gè)胚層的細(xì)胞。人類干細(xì)胞可以被用來(lái)治療較多疾病，比如帕金森疾病、脊髓損傷和糖尿病。然而其生產(chǎn)需要摧毀胚胎，這便會(huì)在某些群體中引發(fā)強(qiáng)烈的道德反對(duì)。此外，使用這些細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植可能會(huì)引發(fā)免疫排斥且需要使用免疫抑制劑。在2006年，由于山中伸彌等在實(shí)驗(yàn)上的突破，這些問(wèn)題似乎已經(jīng)被規(guī)避。作者介紹一種方法即通過(guò)人為表達(dá)四種基因（轉(zhuǎn)錄因子OCT4，MYC，SOX2和KLF4）重新編程成纖維細(xì)胞使之進(jìn)入多能狀態(tài)（類似胚胎干細(xì)胞）［22］。

2.4 人工誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞 盡管誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞（iPSCs）的治療前景巨大，但這可能是一個(gè)錯(cuò)誤忽視胚胎干細(xì)胞，以完全專注在iPSCs?？梢灶A(yù)期的是控制iPSCs分化的信號(hào)和規(guī)則和管理人類胚胎干細(xì)胞的信號(hào)和規(guī)則是一樣的。然而，已有證據(jù)表明iPSCs分化成特地譜系細(xì)胞的成功率是高度可變的［23］，且其可能遭受大量基因組的變異。

Niliksha Gunewardene等用兩種誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞（hiPSCs）和一種人類胚胎干細(xì)胞（hESCs），使其朝一個(gè)特定的感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞譜系（neurosensory lineage）分化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在體外35d，hiPSC和hESCs衍生的感覺(jué)神經(jīng)祖細(xì)胞均有感覺(jué)神經(jīng)標(biāo)志物的高表達(dá)水平。此外，從該實(shí)驗(yàn)中所產(chǎn)生的神經(jīng)元被認(rèn)為是有電活性的。雖然所有的細(xì)胞系均產(chǎn)生有功能的感覺(jué)神經(jīng)樣祖細(xì)胞，但與hESCs相比較，hiPSCs在神經(jīng)標(biāo)志物表達(dá)水平上是可變的?？傮w而言，這些結(jié)果表明，hiPSCs有能力分化成感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞系，但必須提高h(yuǎn)iPSCs分化成所需要譜系的一致性［24］。

3 最適合用于再生內(nèi)耳的干細(xì)胞

理論上，胚胎干細(xì)胞是對(duì)于內(nèi)耳細(xì)胞的恢復(fù)最好的選擇。然而，有證據(jù)表明一些胚胎干細(xì)胞譜系能夠發(fā)展成為腫瘤，在細(xì)胞移植后產(chǎn)生不良組織。另外，獲取胚胎干細(xì)胞需要破壞胚胎，這在倫理角度上受質(zhì)疑。

神經(jīng)干細(xì)胞可以從器官獲取，這在倫理上似乎是被認(rèn)可的。然而，一旦神經(jīng)干細(xì)胞只在大腦深部區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，那么對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞有限的獲取方式會(huì)阻礙其臨床應(yīng)用。另一方面，間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取較容易且在其分化過(guò)程中也可以產(chǎn)生神經(jīng)元細(xì)胞。再加上其能產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，它們能增加神經(jīng)元的數(shù)量且對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)有支持保護(hù)作用，這也潛在的提高電子耳蝸的植入效率［25］。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)耳蝸后存活的比例較低，Matsuoka等把BMMsC移植進(jìn)蒙占沙鼠耳蝸內(nèi)，發(fā)現(xiàn)鼓階注射的細(xì)胞存活率僅為0.54‰，蝸軸注射的存活率僅為0.59 ‰，而存活的細(xì)胞中也僅有少部分能分化為內(nèi)耳功能細(xì)胞表型［26］。

對(duì)比神經(jīng)干細(xì)胞和成人內(nèi)耳干細(xì)胞在體外分化成內(nèi)耳毛細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，它們之間有兩個(gè)不同：（1）內(nèi)耳干細(xì)胞的分化能力是神經(jīng)干細(xì)胞的100倍。（2）內(nèi)耳干細(xì)胞比神經(jīng)干細(xì)胞能更完全的分化成毛細(xì)胞［27］。

動(dòng)員內(nèi)源性干細(xì)胞為替代損壞的內(nèi)耳毛細(xì)胞提供了一種新方式。動(dòng)員宿主干細(xì)胞不需要像移植外來(lái)細(xì)胞（如胚胎干細(xì)胞和非胚胎干細(xì)胞）進(jìn)入耳內(nèi)那樣復(fù)雜，避免了移植方式的選擇，移植過(guò)程中造成的手術(shù)創(chuàng)傷，移植排斥反應(yīng)，無(wú)節(jié)制移植細(xì)胞的增殖和腫瘤形成。因此內(nèi)耳干細(xì)胞對(duì)于耳蝸毛細(xì)胞的修復(fù)可能是最好的選擇［28］。

4 總結(jié)

目前，用干細(xì)胞移植治療來(lái)恢復(fù)聽(tīng)力在臨床上尚未得到應(yīng)用。對(duì)于聽(tīng)力的恢復(fù)，不可能使用單一的方法，需要對(duì)多種治療方法進(jìn)行聯(lián)合以提高治療效率，這些方法包括對(duì)細(xì)胞周期機(jī)制的基因操作，通過(guò)基因療法誘導(dǎo)毛細(xì)胞的生成，干細(xì)胞移植進(jìn)入受損的耳蝸、耳蝸神經(jīng)及耳蝸核神經(jīng)元。由于毛細(xì)胞可以從支持細(xì)胞中再生，通過(guò)橫向分化再生毛細(xì)胞的機(jī)制將會(huì)明顯提高治療聽(tīng)力損失措施的潛力［29-30］。

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浙江省教育廳（Z201119721）；浙江省衛(wèi)生廳（200913120）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（吳佳源）310006 浙江省中醫(yī)院（劉俊）*通信作者