腸道真菌與消化系統(tǒng)疾病關(guān)系研究進(jìn)展

朱文華，吳本儼

(解放軍總醫(yī)院南樓消化內(nèi)科，北京 100853)

人體消化道約定植 1012～1014個(gè)微生物，由細(xì)菌群、真菌群、病毒群、螺旋體群、古生菌群等組成[1]。腸道菌群與健康息息相關(guān)，腸道菌群紊亂會引發(fā)多種疾病，如腹瀉、便秘、炎癥性腸病、糖尿病、自閉癥、腫瘤等[2]。目前已有大量的研究揭示腸道細(xì)菌菌群在人類健康及疾病中發(fā)揮著復(fù)雜的作用[3]，而對腸道真菌菌群研究的廣度和深度卻遠(yuǎn)不及腸道細(xì)菌菌群。本文就腸道真菌菌群的檢測方法、構(gòu)成情況以及其在疾病中發(fā)揮的作用等進(jìn)行綜述。

1 腸道真菌的檢測方法

1.1 傳統(tǒng)方法

依賴于培養(yǎng)的傳統(tǒng)研究方法主要包括： 顯微鏡下觀察、選擇特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)和生化鑒定。然而，由于大部分與人類相關(guān)的微生物均無法在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出來，因此，依賴培養(yǎng)的傳統(tǒng)研究方法就無法對整個(gè)腸道菌群的構(gòu)成及動態(tài)變化情況進(jìn)行研究[3]。

1.2 分子生物學(xué)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于腸道菌群的檢測，我們對腸道菌群有了更深入的了解。目前基于真菌18S rDNA及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)的DNA測序被廣泛應(yīng)用于腸道真菌的檢測。18S rDNA是真核生物核糖體小亞基rRNA的編碼DNA，序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)：保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系； 而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異。18S rDNA適用于真菌菌種及以上的分類。ITS包括ITS1和ITS2：ITS1位于核糖體18S和5.8S rDNA之間；ITS2位于核糖體5.8S和28S rDNA之間。ITS的變異性比18S rDNA大，可以用來鑒定真菌菌種及亞種水平。將18S rDNA與ITS結(jié)合進(jìn)行測序更加有利于真菌的分類研究[4-6]。但由于真菌在腸道中的豐度低、含量少，因此以通用引物擴(kuò)增真菌DNA時(shí)也會出現(xiàn)陰性結(jié)果，這在某種程度上限制了腸道真菌的研究。而將培養(yǎng)法與測序法相結(jié)合會得到有關(guān)腸道真菌菌群的更多信息。

2 人類腸道真菌組成情況及影響因素

人類消化道及口腔共檢出158個(gè)菌屬和335個(gè)菌種，大都屬于絲狀真菌及酵母菌，主要由子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門構(gòu)成[7]，并且受年齡、性別、飲食、種族、受檢部位等的影響[4,8]。位于食管的優(yōu)勢真菌為念珠菌屬；胃部存在念珠菌屬和單胞瓶霉屬真菌屬；由于搜集小腸的樣本比較困難，關(guān)于小腸的真菌分布情況研究很少，在小腸移植患者體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)釀酒酵母、克魯弗酵母菌、念珠菌、新型隱球菌等；結(jié)腸及糞便的優(yōu)勢真菌菌群為念珠菌及釀酒酵母，而曲霉菌、毛霉菌等被認(rèn)為是過路菌或致病菌[4]。Dollive等[9]利用焦磷酸測序法檢測健康志愿者的糞便真菌菌群情況，發(fā)現(xiàn)主要有曲霉菌屬、隱球菌屬、青霉菌屬、肺囊蟲屬、念珠菌屬、酵母屬等。Strati等[10]在健康人群80%的糞便樣本中分離出349個(gè)菌株，其中34種菌株被認(rèn)為是共生菌或條件致病菌，主要包括白色念珠菌(39.8%)、黏紅酵母(12.6%)、近平滑假絲酵母(12.3%)等，這些真菌對腸道環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。56%的真菌都可形成菌絲或假菌絲，它們與菌株的侵襲性相關(guān)，菌絲和假菌絲形成菌最具有侵入性，最易黏附或侵入宿主組織。培養(yǎng)結(jié)果顯示分離的真菌具有較高的耐藥頻率，女性腸道真菌的數(shù)目及種類比男性多，腸道真菌的數(shù)量及豐度與年齡無關(guān)。而宏基因組學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)消化道真菌菌群的構(gòu)成因年齡及性別的不同而有差異。Hoffmann等[11]應(yīng)用深測序法檢測飲食對正常人群糞便真菌、細(xì)菌等的影響，發(fā)現(xiàn)進(jìn)食富含動物蛋白飲食的人群，其腸道細(xì)菌的含量增多；進(jìn)食碳水化合物的人群，其腸道普氏菌屬數(shù)量增多；僅進(jìn)食碳水化合物的人群腸道真菌數(shù)量增多。Mar Rodríguez等[12]的研究發(fā)現(xiàn)肥胖組與非肥胖組的腸道真菌多樣性存在差異，肥胖組的真菌多樣性較非肥胖組降低；毛霉菌(8.07%)在非肥胖組中檢測率最高；毛霉屬的相對豐度與體質(zhì)量降低程度呈正相關(guān)，與體質(zhì)量指數(shù)、腰圍、臀圍，腰部/臀部脂肪百分比、低密度脂蛋白膽固醇、空腹甘油三酯、尿酸和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)呈負(fù)相關(guān)。

我國針對健康人群腸道真菌的研究較國外少，楊震球等[13]對正常人群青年組、老年組及長壽組行糞便真菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)糞便真菌隨年齡的增長而增多，白色念珠菌檢出率最高。朱偉等[14]對健康中年人及老年人糞便菌群進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)中年人群糞便中檢測不出真菌孢子，而老年人群可檢測到真菌孢子，占菌群比例的0.1%。劉蘊(yùn)珍[15]對健康查體人員的糞便進(jìn)行真菌檢測，檢出率為41.6%，霉菌和酵母菌的帶菌率分別為19.0%和19.4%，霉菌以交鏈孢霉和草酸青霉占優(yōu)勢，酵母菌以白色假絲酵母和毛孢子菌占優(yōu)勢。

這些研究提示真菌菌群在健康人體腸道普遍存在，但是其在各地區(qū)、各種族、各年齡層次、各飲食習(xí)慣等人群中的具體情況還需進(jìn)一步研究，為正確定義“健康腸道真菌菌群”提供更多理論數(shù)據(jù)。

3 腸道真菌與疾病

少量文獻(xiàn)報(bào)道腸道真菌在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、肝炎、抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)、腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)、消化性潰瘍、移植物抗宿主反應(yīng)(graftversushost disease，GVHD)、腫瘤、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、厭食癥等疾病中都發(fā)揮著重要的作用[7,16]。

3.1 腸道真菌與IBD

IBD發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為易患IBD人群在外環(huán)境的作用下其免疫應(yīng)答改變，從而致病。已有大量研究表明腸道細(xì)菌菌群在腸道炎癥的啟動及發(fā)展中起著重要的作用，黏膜炎癥的發(fā)展依賴于復(fù)雜腸道菌群的存在。作為腸道菌群的一部分，腸道真菌在IBD患者體內(nèi)所起的作用不容忽視。近幾年有文獻(xiàn)報(bào)道，幾種IBD相關(guān)基因如Card9，參與了針對真菌的免疫反應(yīng)[17]；在小鼠體內(nèi)，腸道炎癥可促進(jìn)真菌的增殖；而白色念珠菌可促進(jìn)和增強(qiáng)小鼠的結(jié)腸炎癥，布拉酵母菌則可抑制和降低小鼠化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥[18,19]?？贯劸平湍缚贵w(anti-saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA)是克羅恩病(Crohn’s disease，CD)患者診斷的生物性標(biāo)志分子[20]。這些都表明腸道真菌與腸道炎癥之間關(guān)系密切。Sokol等[21]以測序法檢測并分析IBD患者與健康人群的糞便真菌，結(jié)果顯示IBD患者與健康人群相比，腸道真菌菌群失衡，內(nèi)擔(dān)子菌門/子囊菌門率的比例增加、釀酒酵母比例下降及白色念珠菌比例增加。釀酒酵母與雙歧桿菌屬、Blautia屬、羅斯氏菌屬及瘤胃球菌屬呈正相關(guān)，這些細(xì)菌在IBD患者體內(nèi)數(shù)量下降；馬拉色菌目則與這些細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。Ott等[22]對比IBD患者及對照人群結(jié)腸組織及糞便的真菌情況，發(fā)現(xiàn)IBD患者腸道真菌的豐富度和多樣性較對照人群增加，分子孢子菌屬或白色念珠菌可在各組人群中測出，而出芽短梗霉、球毛殼菌等僅能在CD患者中檢測到。Li等[23]分析活動性CD患者及健康人黏膜相關(guān)真菌及糞便真菌的情況，發(fā)現(xiàn)與非炎癥性黏膜比較，發(fā)炎黏膜的真菌豐富度和多樣性在增加，并且主要真菌組成顯著改變，以白色念珠菌、串珠狀赤霉、黑斑病菌、新生隱球菌比例擴(kuò)大為特征。CD患者的糞便真菌多樣性也增加，構(gòu)成以白色念珠菌、棒曲霉、新型細(xì)球菌為主。腸道真菌菌群組成的變化程度可能與CD黏膜炎癥和疾病活動程度相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)將為IBD的發(fā)病機(jī)制提供更多的線索，并有可能發(fā)現(xiàn)IBD患者的潛在治療靶點(diǎn)。

3.2 腸道真菌與肝炎

目前有關(guān)腸道真菌與乙肝病毒感染的研究，多集中在肝炎患者腸道真菌感染的危險(xiǎn)因素、臨床診斷、治療等方面。對于乙肝患者腸道真菌的構(gòu)成報(bào)道很少，陳瑜等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，人類腸道中存在較為豐富的真菌菌群，優(yōu)勢真菌菌屬為念珠菌屬和酵母菌屬；乙肝肝硬化患者組較慢性乙肝患者組、乙肝攜帶組、健康對照組腸道真菌菌群多樣性增強(qiáng)，腸道白色念珠菌、克柔念珠菌、釀酒酵母等常見真菌菌量明顯增多，腸道真菌菌群失衡的程度與乙肝重癥化存在一定的相關(guān)性。腸道真菌豐度增加與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染之間的潛在聯(lián)系，有可能是宿主的免疫應(yīng)答缺陷導(dǎo)致。Thomas等[25]報(bào)道了甘露糖結(jié)合蛋白(mannose binding protein，MBP)突變與持續(xù)性乙型肝炎病毒感染的關(guān)系。MBP 可與真菌細(xì)胞壁的甘露聚糖結(jié)合，導(dǎo)致宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在抗真菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。也許乙肝患者體內(nèi)MBP缺失或功能異常會導(dǎo)致抗真菌功能的減退，使這些病原菌得以在腸道內(nèi)增殖[8]。有關(guān)乙肝患者體內(nèi)腸道真菌菌群的作用機(jī)制及影響因素有待進(jìn)一步研究。

3.3 腸道真菌與AAD

研究證實(shí)長期使用抗生素會導(dǎo)致腸道菌群失衡，廣譜抗生素對腸道菌群的影響特點(diǎn)是具有保護(hù)作用的細(xì)菌數(shù)量減少，而真菌的數(shù)量增加。接受抗生素治療的患者其糞便念珠菌濃度≥105CFU/ml可導(dǎo)致腹瀉，而<105CFU/ml則不會。30%的老年AAD患者與念珠菌有關(guān)，經(jīng)抗真菌治療后病情可得到緩解[4]。胃腸道微生物在抗生素治療后患者的恢復(fù)中也起著重要的作用。一些動物研究表明，廣譜抗生素治療可引起盲腸和胃的白色念珠菌過度生長，而白色念珠菌定植也可以幫助恢復(fù)腸道的菌群多樣性[26,27]。車媛等[28]發(fā)現(xiàn)AAD小鼠糞便真菌菌群較對照小鼠多樣性明顯升高。有研究認(rèn)為真菌毒力因子，如磷脂酶和天冬氨酸蛋白酶，可能導(dǎo)致AAD，但研究也認(rèn)為腸道真菌及其代謝產(chǎn)物是抗生素使用或者腹瀉導(dǎo)致的結(jié)果，而不是原因。在AAD患者中，腸道真菌與艱難梭菌相比較也許只是起到次要作用[29,30]。因此，雖然有研究發(fā)現(xiàn)了腸道真菌菌群在AAD宿主體內(nèi)發(fā)生了變化，但是究竟是腸道真菌導(dǎo)致了AAD還是AAD導(dǎo)致了腸道真菌菌群的變化？在AAD體內(nèi)腸道真菌與細(xì)菌怎樣相互影響？腸道真菌在AAD預(yù)防、發(fā)生、發(fā)展及治療中究竟能發(fā)揮多大的作用？這些問題將有待進(jìn)一步研究。

3.4 腸道真菌與消化道腫瘤

眾所皆知，真菌毒素黃曲霉素與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，那么腸道真菌是否在其他腫瘤的形成、發(fā)展等過程中發(fā)揮作用了呢？目前對于這方面的研究僅有少量報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素也參與了胃癌和食管癌的發(fā)展[31,32]，真菌感染也是一個(gè)誘發(fā)因素，它可引起局部慢性炎癥及上皮細(xì)胞的增殖，從而致癌。已經(jīng)證實(shí)腸道菌群失調(diào)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[33]，腸道真菌及其代謝產(chǎn)物是否真能夠有助于腫瘤的發(fā)生呢？這仍需要進(jìn)一步研究。

3.5 腸道真菌與感染

當(dāng)宿主免疫力降低或是疾病打破了腸道菌群平衡，腸道真菌定植及腸道真菌產(chǎn)生菌絲或假菌絲，真菌毒力增強(qiáng)侵入宿主易導(dǎo)致真菌感染。消化道真菌感染可由腸道正常真菌菌群或是外來的致病菌引發(fā)。真菌性食管炎及胃炎的主要致病菌為白色念珠菌；毛霉菌屬、念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等可導(dǎo)致腸道的真菌性炎癥[34]。雖然臨床上與消化道疾病相關(guān)的消化道真菌感染并不常見，但是由于缺乏特異性癥狀、體征、內(nèi)鏡及影像學(xué)表現(xiàn)，并且缺乏有效的治療手段，往往導(dǎo)致致命性的結(jié)果。因此仍需深入研究消化道真菌感染的特點(diǎn)，以期做到早診斷、早治療，并尋找到有效的治療方案。

4 小 結(jié)

腸道真菌是腸道菌群的重要組成部分，近年來，越來越多的研究開始關(guān)注這一影響人類健康的必不可少的群體。隨著真菌菌群在健康人群及患病人群中的構(gòu)成情況逐漸清晰，人們也開始探討腸道真菌參與宿主病理生理過程的機(jī)制。但是，由于各研究實(shí)驗(yàn)方法不一致、研究部位的差異等，加之腸道菌群本身復(fù)雜多變、影響因素較多，各個(gè)研究機(jī)構(gòu)的結(jié)論不盡相同，且缺乏可比性。腸道真菌是大海里的一座冰山，我們目前發(fā)現(xiàn)的只是冰山一角，還有更多的信息有待我們發(fā)掘。腸道真菌與疾病的因果關(guān)系還需進(jìn)一步鑒定，究竟是菌群導(dǎo)致疾病的發(fā)生還是疾病的發(fā)生使真菌菌群產(chǎn)生了變化？整個(gè)腸道微生態(tài)是否密不可分地發(fā)揮作用？腸道真菌及細(xì)菌菌群如何相互作用共同影響宿主健康？我們是否可以通過分析不同疾病患者的腸道菌群情況找到各疾病的特征性腸道真菌譜？因此，下一步應(yīng)該繼續(xù)完善腸道真菌菌群在各種健康及患病人群中的分布，并且發(fā)掘出疾病相關(guān)的特異性真菌菌株，對其進(jìn)行作用機(jī)制研究，以期在不久的將來找到相關(guān)疾病治療的精確靶點(diǎn)。

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