力學(xué)刺激對(duì)軟骨下骨修復(fù)過程中OPG/RANKL/RANK通路及破骨細(xì)胞的影響

朱鴻飛，褚立希，譚朝丹

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是生物學(xué)和力學(xué)因素共同作用下細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨細(xì)胞、軟骨下骨三者合成與分解失衡的結(jié)果，是一種以關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨質(zhì)再生以及關(guān)節(jié)軟骨變性和丟失為特征的慢性骨性關(guān)節(jié)疾病。近年來，機(jī)械力學(xué)刺激在軟骨下骨損傷修復(fù)以及重塑過程中的作用正日益受到關(guān)注。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡是軟骨下骨重塑與修復(fù)的關(guān)鍵，力學(xué)刺激對(duì)于成骨細(xì)胞的影響已有許多相關(guān)研究，而破骨細(xì)胞在骨修復(fù)過程中活性明顯強(qiáng)于成骨細(xì)胞，近年來越來越多的學(xué)者對(duì)此已有關(guān)注，本文就力學(xué)刺激對(duì)軟骨下骨修復(fù)過程中破骨細(xì)胞相關(guān)分子方面的作用機(jī)制予以綜述。

1 破骨細(xì)胞與軟骨下骨

軟骨下骨承接著關(guān)節(jié)軟骨向下傳導(dǎo)的應(yīng)力負(fù)荷，主要起到吸收應(yīng)力、將應(yīng)力負(fù)荷向關(guān)節(jié)的周圍和下方傳遞，可以保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨以緩沖震蕩，維持關(guān)節(jié)形狀。目前，軟骨下骨在未來的骨關(guān)節(jié)炎治療中將發(fā)揮重要作用已得到眾多學(xué)者的公認(rèn)[1]。骨關(guān)節(jié)炎時(shí)，正常的力學(xué)傳導(dǎo)平衡被打破，軟骨下骨骨組織所承受的應(yīng)力負(fù)荷明顯增加，當(dāng)超過骨小梁對(duì)于應(yīng)力的緩沖能力的限度時(shí)，骨小梁會(huì)發(fā)生微骨折，持續(xù)的微骨折的積累導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨下骨及骨組織的損傷。為了修復(fù)損傷的骨組織，在異常應(yīng)力和生物學(xué)作用下，骨皮質(zhì)的纖維血管組織浸潤鈣化軟骨，得以侵炎性組織入，繼而活化破骨細(xì)胞，導(dǎo)致軟骨內(nèi)的骨化中心激活以及潮線擴(kuò)張，加速軟骨的退變。研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨下骨中組織蛋白酶K、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)、細(xì)胞核因子kB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand, RANKL)和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP)等骨吸收標(biāo)記的基因表達(dá)水平增高，促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖與活化，而破骨細(xì)胞凋亡及白細(xì)胞介素受體I型(Interleukin-1 Receptor I Type，IL-1RI)表達(dá)卻下降，表現(xiàn)為骨重塑提高，骨吸收增加[2]。骨關(guān)節(jié)炎中，異常激活的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞可引起軟骨下骨的骨重塑，同時(shí)逆向影響上層軟骨生物力學(xué)環(huán)境，進(jìn)而導(dǎo)致上層軟骨的退變。軟骨下骨的修復(fù)與重塑取決于骨吸收與骨形成的平衡，在破骨細(xì)胞形成的同時(shí)成骨細(xì)胞也在增殖及分化。Sanchez等[3]對(duì)OA患者軟骨下骨硬化區(qū)和非硬化區(qū)的成骨細(xì)胞施加大小為1MPa、頻率為1Hz的周期性壓應(yīng)力，持續(xù)4h，結(jié)果RANKL和MMPs的表達(dá)均增加。但是，由于破骨細(xì)胞研究條件的局限性，骨關(guān)節(jié)炎中的破骨細(xì)胞影響軟骨下骨重塑的作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

2 破骨細(xì)胞與力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

2.1 破骨細(xì)胞的起源及信號(hào)調(diào)節(jié)通道 破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞的單核巨噬細(xì)胞譜系[4]，在骨吸收過程中起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，骨保護(hù)素(Osteoprotegerin,OPG) 是調(diào)控成骨細(xì)胞功能活動(dòng)的重要分子，破骨細(xì)胞分化因子(Osteoclast Ddifferentiation Factor,ODF)是調(diào)控破骨細(xì)胞功能活動(dòng)的重要分子。ODF又稱為細(xì)胞核因子kB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand RANKL),主要由成骨細(xì)胞合成,RANKL與破骨細(xì)胞表面的受體--細(xì)胞核因子κB 受體活化因子(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB，RANK)結(jié)合可增加破骨細(xì)胞的增殖，增加骨吸收。OPG/RANKL/RANK通路是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間相互作用的信號(hào)通道，可調(diào)控骨吸收。OPG主要由間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞合成和分泌,具有增加骨密度、抑制破骨細(xì)胞活性和降低破骨細(xì)胞分化的功能[5]，含有5 個(gè)外顯子，其與腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Factor Receptor，TNF)的編碼蛋白類似，屬于TNF受體超家族。研究表明，OPG 基因被敲除的小鼠有骨小梁和骨皮質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松嚴(yán)重等癥狀同時(shí)伴有OPG 轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)的小鼠則會(huì)出現(xiàn)骨硬化癥[6]。RANKL是一種三聚體Ⅱ型跨膜蛋白，由317 個(gè)氨基酸構(gòu)成，廣泛表達(dá)于淋巴細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中[7]。人類RANKL基因主要表達(dá)于骨髓、骨及淋巴組織。RANKL可結(jié)合破骨細(xì)胞表面受體RANK，具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、生成、活化成熟的作用，進(jìn)而破壞骨質(zhì)。 RANK屬于TNF超家族成員，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，由616個(gè)氨基酸組成。RANK編碼基因由29個(gè)氨基酸信號(hào)肽、細(xì)胞外編碼區(qū)183 個(gè)氨基酸、跨膜區(qū)21個(gè)氨基酸和細(xì)胞質(zhì)區(qū)383個(gè)氨基酸組成[8]。OPG可以通過競爭性地結(jié)合RANKL，阻礙RANKL與RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞活性，阻礙骨吸收。因此OPG/RANK/RANKL調(diào)節(jié)軸對(duì)于破骨細(xì)胞分化及骨重建的耦聯(lián)作用非常關(guān)鍵。

2.2 力學(xué)刺激與OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路 力學(xué)刺激作用于細(xì)胞后，細(xì)胞可通過細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架系統(tǒng)、鈣離子通道、G 蛋白與酪氨酸激酶等多種途徑將細(xì)胞外物理性的應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)的相關(guān)基因被活化，調(diào)控合成一些細(xì)胞因子，起到調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的作用。大量研究表明，OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路是力學(xué)敏感通路[9]。在OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)中，骨髓基質(zhì)及成骨細(xì)胞在分泌RANKL使破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)骨吸收的同時(shí)也會(huì)分泌一定量的OPG 以防止骨過度吸收。OPG/RANKL比值下降時(shí)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨吸收增加[10]。適宜的機(jī)械應(yīng)力刺激和運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)OPG的表達(dá)，提高OPG/RANKL比例，有利于促進(jìn)骨骼生長[11]。Boreham等[12]發(fā)現(xiàn)，有規(guī)律的耐力運(yùn)動(dòng)能使骨量明顯增加1%～6%，提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成；而過度運(yùn)動(dòng)則抑制OPG 的表達(dá)，上調(diào)RANKL表達(dá)，OPG/RANKL比例下降，增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致骨微損傷[13]。這些實(shí)驗(yàn)都說明中等強(qiáng)度的應(yīng)力刺激可引起OPG/RANKL比值升高，有利于促進(jìn)骨形成；而大強(qiáng)度的應(yīng)力刺激則引起OPG/RANKL比值下降，不利于骨骼發(fā)展。

3 力學(xué)刺激對(duì)破骨細(xì)胞的作用

3.1 機(jī)械應(yīng)力抑制破骨細(xì)胞分化 骨骼處于動(dòng)態(tài)發(fā)展?fàn)顟B(tài)，骨重建與修復(fù)均與生理或外加力學(xué)刺激相關(guān)，其中由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成和骨吸收在整個(gè)過程中保持動(dòng)態(tài)平衡[14-15]。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)[16]，利用成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)出更多的破骨細(xì)胞和高水平的Notch2表達(dá)，為進(jìn)一步破骨細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。大量研究證實(shí)[17-19]，機(jī)械應(yīng)力可直接抑制破骨細(xì)胞分化，并通過下調(diào)ODF及RANKL、MMP-9、組織蛋白酶-K、降鈣素受體等骨吸收標(biāo)志物的mRNA表達(dá)，上調(diào)內(nèi)源性一氧化氮合酶(Endogenous Nitric Oxide Synthase，eNOS)mRNA表達(dá)，起到抑制骨吸收的作用。研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，應(yīng)力刺激可抑制破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而防止軟骨及軟骨下骨的退化，起到治療關(guān)節(jié)炎的作用。力學(xué)刺激能通過骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞間接調(diào)控破骨細(xì)胞的增殖及活性，且能直接作用于破骨細(xì)胞并產(chǎn)生生物效應(yīng)，1000μs大小的循環(huán)壓力可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，同時(shí)促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并抑制破骨前體細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化。力學(xué)刺激會(huì)改變RANK與RANKL的結(jié)合度，從而抑制破骨細(xì)胞成熟、分化，減少骨吸收，其是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞增殖與分化的主要因子。巫松輝等[22]發(fā)現(xiàn)復(fù)合振動(dòng)能通過抑制RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，下調(diào)破骨細(xì)胞特異基因組織蛋白酶K，MMP-9和TRAP的表達(dá)，達(dá)到抑制骨吸收的作用。應(yīng)力刺激還可通過下調(diào)IL-1、TNF-α等炎性因子及TRAP、ODF、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、RANKL等骨吸收因子的表達(dá)，降低破骨細(xì)胞的增殖及分化能力，進(jìn)而抑制骨吸收。Nagatomi等[23]發(fā)現(xiàn)周期性機(jī)械壓力能下調(diào)IL-1及TNF-α等促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子的基因表達(dá)，顯著抑制骨吸收。但是，在目前環(huán)境下研究成骨細(xì)胞的相關(guān)量化條件是否適用于破骨細(xì)胞，仍有待進(jìn)一步觀察。

3.2 不同大小的力學(xué)刺激對(duì)破骨細(xì)胞的不同作用 骨的修復(fù)與重建需要力學(xué)刺激的參與，不同大小的力學(xué)刺激對(duì)于破骨細(xì)胞的作用不同。陳國仙等[24]觀察不同頻率振蕩應(yīng)力(3～10Hz、15～35Hz、35～45Hz、50～70Hz 和70～90Hz)分別作用于體外誘導(dǎo)分化的RAW264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同振動(dòng)頻率組破骨細(xì)胞特異性基因(TRAP、MMP-9和CATK)表達(dá)水平逐漸減低，而B、C、D組中OPG基因表達(dá)逐漸上調(diào)，同時(shí)RANKL基因的表達(dá)逐漸下調(diào)，說明RAW264.7細(xì)胞不同程度地被抑制向成熟破骨細(xì)胞增殖分化。劉應(yīng)芬等[25]研究發(fā)現(xiàn)， 16.08dyne/cm2的剪切力作用30min可使TRAP活性最強(qiáng)，同時(shí)通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)吸收陷窩的面積和數(shù)量均有較為明顯的提升，促進(jìn)了破骨細(xì)胞的吸收活性。力學(xué)環(huán)境是影響骨組織細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要因素，許多學(xué)者在骨的生物學(xué)和力學(xué)方面做了大量研究工作。2500 με被認(rèn)為是生理范圍內(nèi)的應(yīng)變，3000～5000με是生理性過載應(yīng)變，生理性過載應(yīng)變水平下長期循環(huán)加載或超過5000με為病理過載，會(huì)引起病理性骨重塑與重建。在一定的作用時(shí)間內(nèi)，較高強(qiáng)度的生理載荷促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和功能，低強(qiáng)度載荷抑制破骨細(xì)胞分化，病理性載荷抑制破骨細(xì)胞分化[26]。研究還發(fā)現(xiàn)，不同強(qiáng)度周期性應(yīng)變力對(duì)分化初期破骨前體細(xì)胞和已分化的破骨前體細(xì)胞的破骨分化和功能狀態(tài)的影響有明顯差異，2500με的周期性應(yīng)變力可顯著抑制成骨細(xì)胞+破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的分化功能，減少骨吸收[27]。

4 展望

力學(xué)刺激改善骨修復(fù)的可能途徑為一定大小及頻率的應(yīng)力上調(diào)OPG、IFN等成骨因子的表達(dá)以促進(jìn)骨形成，同時(shí)下調(diào)RANKL等骨吸收因子的表達(dá)抑制骨吸收。有關(guān)應(yīng)力信號(hào)如何分別影響和交互影響骨形成和骨吸收過程從而影響軟骨下骨的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的探索和研究。因此，研究通過適宜應(yīng)力刺激調(diào)節(jié)或直接靶向干預(yù)破骨細(xì)胞及OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)來治療骨關(guān)節(jié)炎既是機(jī)遇又是挑戰(zhàn)。

[1] Castaneda S,Roman-Blas JA, Largo R, et al. Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment. Biochem Pharmacol, 2012, 83(3): 315-323.

[2] Durand M, Komarova SV, Bhargava A,et al. Monocytes from patients with osteoarthritis display increased osteoclastogenesis and bone resorption: the In Vitro Osteoclast Differentiation in Arthritis study [J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(1): 148-158.

[3] Sanchez C, Pesesse L, Gabay O, et al. Regulation of subchondral bone osteoblast metabolism by cyclic compression [J]. Arthritis Rheum, 2012, 64(4):1193-1203.

[4] 田雪飛.破骨細(xì)胞的來源[J].國外醫(yī)學(xué): 口腔醫(yī)學(xué)分冊,2002,29(4): 354-356.

[5] Harada S, Takahashi N. Control of bone resorption by RANKL-RANKsystem [J]. Clinical calcium,2011, 21(8): 1121-1130.

[6] Dempster DW, Lambing CL, Kostenuik PJ, et al. Role of RANK ligand and denosumab, a targeted RANK ligand inhibitor, in bone health and osteoporosis: a review of preclinical and clinical data [J]. Clin Ther, 2012, 34(3): 521-536.

[7] Ryser MD,Qu Y, Komarova SV. Osteoprotegerin in bone metastases: mathematical solution to the puzzle [J]. PLoS computational biology, 2012, 8(10):1-12.

[8] Anastasia P, Ioannis P, Kelly M, et al. High levels of synovial fluid osteoprotegerin(OPG) and increased serum ratio of receptor activator of nuclear factor- kB ligand (RANKL) to OPG correlate with disease severity in patients with primary knee osteoarbritis [J]. Clin Biochem,2008, 41(9): 746-749.

[9] Zhang Y, Paul EM, Sathyendra V, et al. Enhanced osteoclastic resorption and responsiveness to mechanical load in gap junction deficient bone [J]. PLoS One, 2011, 6(8): 1-12.

[10]Novack DV. Role of NF-kappaB in the skeleton[J]. Cell Res,2011, 21(1) : 169-182.

[11]Thompson WR, Rubin CT, Rubin J. Mechanical regulation of signaling pathways in bone[J]. Gene, 2012, 503(2) : 179-193.

[12]Boreham CA,Mckay HA. Physical activity in childhood and bone health [J]. British journal of sports medicine, 2011,45(11) : 877-879.

[13]Mulcahy LE, Taylor D, Lee TC, et al.RANKL and OPG activity is regulated by injury size in networks of osteocyte-like cells[J].Bone,2011,48(2) : 182-188.

[14]廖乃順,陳文列,黃云梅,等.成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國骨傷,2013,26(4):349-353.

[15]Takano Yamamoto T.Osteocyte function under compressive mechanical force[J].Jap Dental Sci Rev,2014,50(2):29-39.

[16]段莉,鄭根建.兩種不同細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)破骨細(xì)胞分化及Notch2基因表達(dá)的影響[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012,18 (8) :1009-1012.

[17]Rubin J, Murphy T, Nanes MS, et al. Mechanical strain inhibits expression of osteoclast differentiation factor by murine stromal cells [J]. AmeJ Physiol Cell Physiol, 2000, 278(6) : 1126-1132.

[18]Rubin J, Murphy TC, Zhu L, et al. Mechanical strain differentially regulates endothelial nitric-oxide synthase and receptor activator of nuclear kappa B ligand expression via ERK1 /2 MAPK[J].J Biol Chem,2003,278(36) : 34018-34025.

[19]Suzuki N, Yoshimura Y, Deyama Y, et al. Mechanical stress directly suppresses osteoclast differentiation in RAW264. 7 cells[J].Int J Mol Med, 2008, 21(3) : 291-296.

[20]Xinle Li, Jing Yang, Daquan Liu, et al. Knee loading inhibits osteoclast lineage in a mouse model of osteoarthritis[J].Scientific reports,2016,20(6):24668-24672.

[21]Guo Y, Wang Y, Liu Y,et al.Effect of the same mechanical loading on osteogenesis and osteoclastogenesis in vitro[J].Chin J Traumatol,2015,18(3):150-156.

[22]巫松輝,鐘招明,查丁勝,等.復(fù)合振動(dòng)抑制RAW264.7 細(xì)胞分化成熟[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2011,17(7): 564-567.

[23]Nagatomi J, Arulanandam BP, Metzger DW, et al. Effects of cyclic pressure on bone marrow cell cultures [J]. J Biomechan Eng, 2002, 124(3) : 308-314.

[24]陳國仙,陳建庭,黃文華,等.不同頻率振動(dòng)應(yīng)力對(duì)破骨細(xì)胞特異性基因及骨保護(hù)素/核因子κB 受體活化因子配體表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(2):99-103.

[25]劉應(yīng)芬,李紅,吳江,等.流體剪應(yīng)力對(duì)大鼠破骨細(xì)胞骨吸收活性的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2007,24(3) :544-548.

[26]郭勇,郭春,閆玉仙,等. 周期性張應(yīng)變對(duì)破骨前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞增殖和抗酒石酸酸性磷酸酶的影響[J]. 醫(yī)用生物力學(xué),2012,27(3):29-304.

[27]YAN YX,GONG YW,Guo Y,et al.Mechanical strain regulates osteoblast proliferation through integrin mediated ERK activation[J].PLoS ONE,2012,7(4):35709-35715.