蛛網(wǎng)膜下腔出血后線粒體鈣超載形成機制的研究進展

張彤宇，李俞辰，戴家興，吳培，王永朋，史懷璋

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種常見且危及生命的腦血管疾病，發(fā)病率占全部卒中的5%，死亡率超過50%[1]。目前，臨床尚無完全有效的治療方案可確保SAH臨床預后良好。傳統(tǒng)觀點認為遲發(fā)性腦血管痙攣（delayed cerebral vasospasm，CVS）是導致SAH后預后不良的主要原因，然而，新近研究表明，早期腦損害（early brain injury，EBI）才是導致SAH患者死亡率居高不下的關鍵因素[1]，但EBI的產(chǎn)生機制尚未明確。鈣超載（calcium overloaded）在線粒體內(nèi)可引起氧化磷酸化過程障礙，線粒體膜電位降低，三磷腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）分解加速，氧化應激水平提升，進而導致細胞的不可逆性損傷[2]。在SAH過程中產(chǎn)生的顱內(nèi)壓增高、腦血管痙攣、血腦屏障破壞等EBI癥狀均是引起線粒體鈣超載的重要因素[1]。因此，研究線粒體鈣超載的機制對于減輕EBI后神經(jīng)系統(tǒng)損害便顯得尤為重要。線粒體和與之偶聯(lián)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞中兩個主要的Ca2+儲存場所，其膜上不同受體和配體的結合調(diào)控著細胞Ca2+的攝取與釋放，從而維持著細胞內(nèi)Ca2+平衡的穩(wěn)態(tài)。隨著顯微技術的發(fā)展，各細胞器膜的分子層面結構已日漸清晰，其膜上各受體與配體結合產(chǎn)生的生物學效應也在不斷被探知[3]。本文就有關線粒體及其偶聯(lián)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上不同膜受體在SAH后形成線粒體鈣超載過程中有關作用機制的研究進展做一綜述。

1 線粒體內(nèi)膜受體對Ca2+的攝取

相比能夠透過離子和小分子的線粒體外膜，線粒體內(nèi)膜有著高度選擇透過性，離子在通過線粒體基質(zhì)與胞質(zhì)時需要特定的轉(zhuǎn)運體。Ca2+跨濃度梯度在胞質(zhì)與線粒體基質(zhì)間轉(zhuǎn)運的媒介被稱為線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）。MCU廣泛表達于真核細胞中。研究證實，MCU是Ca2+單向傳遞的通道結構，具有Ca2+電傳導通道活性，而此通道可被釕紅（ruthenium red，RR）抑制，可被精胺激活[4]。García-Rivas Gde等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MCU特異性抑制劑——釕360（ruthenium360，Ru360）能夠通過抑制鈣超載，改善心肌缺血后功能的損傷。Yan等[6]首先發(fā)現(xiàn)，由于SAH后鐵貯存產(chǎn)生的EBI中存在著MCU的作用，SAH模型鼠的顳葉皮質(zhì)中線粒體鈣離子濃度顯著提升。另有研究顯示，應用RR抑制MCU，從而阻斷Ca2+的貯存可以減少氧化應激，增加能量供給，逆轉(zhuǎn)細胞色素C、半胱天冬蛋白酶3（caspase 3）的作用，進而減少細胞凋亡，保持神經(jīng)元的完整性，改善SAH早期的相關損傷[7]。

除了MCU，線粒體Ca2+調(diào)節(jié)同時還受到線粒體Ca2+攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake1，MICU1）和線粒體Ca2+攝入蛋白2（mitochondrial calcium uptake2，MICU2）的雙重調(diào)控。Perocchi等[8]利用比較生理學、進化基因組學和線粒體蛋白質(zhì)組學相結合的方法尋找線粒體鈣攝入相關蛋白時發(fā)現(xiàn)了MICU1。MICU1具有兩個典型的EF手形結構域（EF hand domain），該結構可感知Ca2+濃度的變化。在細胞內(nèi)Ca2+濃度處于低水平時，EF手型結構域提供了一個對Ca2+高親和力的敏感集團，相當于為細胞提供了一個“門控”功能以調(diào)節(jié)MCU的活動，從而防止線粒體鈣超載[9]。Mallilankaraman等[10]則發(fā)現(xiàn)，MICU1表達下降可導致靜息狀態(tài)下單向轉(zhuǎn)運體活動增加，從而引起線粒體鈣超載；而MICU1在細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于低水平（＜3 μmol/L）時發(fā)揮著限制MCU相關Ca2+攝取的機制，而在細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于高水平時反而不發(fā)揮此作用。目前研究表明，SAH等疾病后的腦部功能性障礙可能與MICU1變異導致的鈣信號變化有關[11]。目前在SAH中MICU1作用仍未明確，有待進一步研究。

另一個MCU調(diào)控因子是MICU2，其與MICU1一樣通過EF手型結構域調(diào)節(jié)Ca2+濃度。MICU2一直被認為與MICU1一同作用于MCU，使得Ca2+濃度呈S形分布。然而，Patron等[12]研究發(fā)現(xiàn)MICU1在低濃度Ca2+條件下對MCU的“門控”作用是依靠MICU2完成的，在細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+處于低濃度時，MICU2起主導作用，抑制MCU的活動，減少細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+向線粒體內(nèi)流，抑制MICU2后MICU1可顯著促進線粒體Ca2+濃度的提升；而在細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+呈高濃度時，MICU1則促進細胞質(zhì)內(nèi)線粒體鈣信號的生成，使Ca2+向線粒體鈣庫內(nèi)流，以保證胞內(nèi)Ca2+的平衡，誘發(fā)線粒體鈣超載。因此，這一相互作用將有望應用于臨床，在SAH中通過降低相應MICU的表達來調(diào)控Ca2+濃度，從而抑制線粒體鈣超載造成的EBI。

2013年，Sancak等[13]發(fā)現(xiàn)了MCU重要調(diào)節(jié)因子（essential MCU regulator，EMRE），EMRE是一個10 kD大小，擁有獨立跨膜結構的多細胞動物特有蛋白；敲除EMRE后，盡管MCU仍可以被激活并寡聚化，但Ca2+單向轉(zhuǎn)運體的功能無法完全發(fā)揮甚至喪失，證實EMRE在MCU介導的鈣超載過程中起到關鍵溝通作用；同時，EMRE的表達也需要MCU及MICU1的相互作用，是MICU1和MICU2以及MCU傳導Ca2+的中間環(huán)節(jié)。不同于這3種鈣通道相關蛋白的是，植物及原核生物中不存在EMRE，因此，EMRE在哺乳動物Ca2+調(diào)節(jié)中的特異性越來越得到重視[12]。在SAH導致的鈣超載過程中，MICU1作為門控通道聯(lián)合MICU2及EMRE共同調(diào)節(jié)此過程的發(fā)生發(fā)展[14]。這也使這幾種受體成為SAH鈣超載研究的熱點之一。

2 線粒體外膜受體對Ca2+的攝取

線粒體基質(zhì)內(nèi)儲存和蓄積Ca2+需要跨越內(nèi)外兩層膜，而線粒體外膜是其攝取的第一道屏障。線粒體外膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是一種具有電壓依賴性、環(huán)孢素敏感性以及高傳導性的膜通道。相關研究認為，mPTP主要由腺苷酸轉(zhuǎn)位子（adenine nucleotide translocator，ANT）、電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channels，VDACs）和親環(huán)素結合蛋白D（cyclophilin-D，CyP-D）組成[15]。如果線粒體基質(zhì)與細胞質(zhì)或外界溶液之間存在濃度梯度，Ca2+可以通過mPTP而釋放。因此，mPTP被認為是線粒體介導的細胞凋亡的重要結構。

mPTP組成成分VDACs是一類小分子親水集團，是ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、細胞色素C、丙酮酸鹽、蘋果酸鹽以及其他代謝產(chǎn)物的主要擴散孔道。盡管VDACs在調(diào)節(jié)線粒體鈣活動中的具體作用仍有爭議，但在線粒體相關的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，VDACs與IP3R3偶聯(lián)并經(jīng)由GRP75介導，可控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+信號進入線粒體的過程已經(jīng)被證實[16]。Li等[17]在研究線粒體自噬的腦保護機制時發(fā)現(xiàn)SAH早期即有VDACs表達升高，分別在出血后24 h及48 h表達顯著升高，而兩者無顯著差異，從而證實了VDACs可能與SAH引起的EBI有關。同時，Martin等[18]研究顯示，VDACs在神經(jīng)元中能夠介導mPTP攝取Ca2+，并誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放，進而誘導神經(jīng)細胞凋亡。因此，VDACs在SAH中很可能是引起鈣超載的重要因素。

目前，有關mPTP另外兩種組成成分ANT和CyP-D在SAH鈣超載中作用的相關研究少見。但在腦損傷過程中，二者均有參與：ANT1是ANT的其中一種異構體形式，其可通過上調(diào)轉(zhuǎn)移生長因子β1（transforming growth factor，TGF-β1），誘導星型膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后形成膠質(zhì)瘢痕[19]；而CyP-D在腦缺血時參與了由于細胞氧化應激導致的凋亡過程[20]。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體膜偶聯(lián)組分對Ca2+的攝取

線粒體外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）膜緊密接觸。Vance等[21]分離得到ER與線粒體相互偶聯(lián)的膜組分，并命名為線粒體相關的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondria associated ER membrane，MAM）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，MAM在某些磷脂代謝中也具有重要作用[22-23]。Rizzuto等[24-25]通過顯微鏡技術發(fā)現(xiàn)，線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間物理偶聯(lián)的部位可形成高濃度的Ca2+微區(qū)，證實了MAM可以影響細胞Ca2+信號調(diào)控。MAM與鈣信號相關的受體很多，有三磷酸肌醇受體（inositol 1，4，5-triphate receptors，IP3Rs）和蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RYRs）等[26]。

IP3Rs受3個基因編碼，每個基因均有各自不同程度的IP3親和力。研究顯示，通過敲除IP3R1和IP3R3基因可以誘導Ca2+攝取降低[27]。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn)，IP3Rs可介導Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，從而導致神經(jīng)元的損傷。Kasseckert等[29]在研究SAH后星型膠質(zhì)細胞能量危機機制時發(fā)現(xiàn)，通過抑制IP3Rs可以限制胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的升高，從而降低細胞壞死率；證實了血性腦脊液可以使IP3Rs受體激活，mPTP開放，瞬時提升Ca2+濃度，從而促進線粒體鈣超載形成以及神經(jīng)細胞的壞死。

另一種Ca2+攝取和釋放通道是RyRs，RyRs亦由三個基因編碼，在神經(jīng)細胞中有一定表達，雖然表達程度不及IP3Rs，但其在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)組分Ca2+釋放中有重要作用。RyRs能夠促進細胞內(nèi)Ca2+向線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等Ca2+貯存單位內(nèi)流動，其每次開放孔道通過Ca2+量是IP3Rs的約20倍[24]。在SAH中，RyRs起著介導細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體膜偶聯(lián)組分鈣超載的作用。Koide等[30]發(fā)現(xiàn)，SAH中存在細胞內(nèi)Ca2+釋放的減少，可導致細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的降低和RyR2表達的下降，這證實了SAH后Ca2+在線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)內(nèi)大量蓄積導致鈣超載的過程。另外，RyR1的遺傳變異可能與SAH后的血管痙攣癥狀有關[31]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體偶聯(lián)部位還有許多Ca2+調(diào)節(jié)受體，如肌漿網(wǎng)鈣泵（sarco-endoplasmic reticulum calcium atpase，SERCA）、磷酸集群分類蛋白-2（phosphoacidic cluster sorting protein-2，PACS-2）等。研究認為，這些Ca2+調(diào)節(jié)受體在腦損傷中也起著重要作用[32-33]。然而它們在SAH中的作用仍研究甚少。

綜上所述，Ca2+濃度變化是由多種線粒體Ca2+相關受體共同作用的結果，這些受體的表達在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成了一個信號轉(zhuǎn)導和功能協(xié)調(diào)的細胞生命過程。各種受體表達的相互作用共同調(diào)控著細胞的Ca2+信號通路和細胞凋亡過程。它們?yōu)镾AH等疾病導致的線粒體鈣超載提供了依據(jù)。在SAH誘發(fā)的線粒體鈣超載過程中，待解決的問題仍有很多。首先，位于線粒體不同位置的受體在鈣信號傳遞過程的分工合作機制還有待進一步研究。另外，一些Ca2+相關受體在SAH進程中表達的變化仍不是很明確，尤其是MICU1、MICU2和EMRE這些已明確與SAH相關的MCU密切關聯(lián)的受體，有待更深一步去探究。最后，我們需要一個更加系統(tǒng)的，定量描述相關蛋白如何募集、組合并隨環(huán)境不同變化的鈣超載網(wǎng)絡模型，以更好地研究SAH治療的新策略。

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