人尿源性干細(xì)胞在口腔組織工程中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

章茜茹 綜述 陳林 王帥 審校

人尿源性干細(xì)胞在口腔組織工程中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

章茜茹 綜述 陳林 王帥 審校

人尿源性干細(xì)胞（Human urine derived stem cells，hUSC）作為一種新的干細(xì)胞來(lái)源，具有旺盛的增殖能力、高度自我更新能力、良好的多向分化潛能和旁分泌能力，取材無(wú)創(chuàng)且無(wú)免疫和倫理問(wèn)題。作為一種理想的干細(xì)胞來(lái)源，人尿源性干細(xì)胞在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)展示了廣闊的應(yīng)用前景，在泌尿系統(tǒng)疾病、骨組織工程等方面的相關(guān)研究，也揭示了hUSC在口腔組織工程中具有應(yīng)用潛能。本文就尿源干細(xì)胞的最新研究成果，及其在口腔組織工程中的應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

人尿源性干細(xì)胞 口腔組織工程 細(xì)胞治療 類器官

口腔頜面部腫瘤、損傷、炎癥等導(dǎo)致的骨折，以及頜面部后天畸形與組織缺損等，嚴(yán)重影響了口腔頜面部的功能和患者的面部外觀。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，可以分化成多種功能細(xì)胞，已被廣泛應(yīng)用于組織工程的研究[1]。理想的細(xì)胞來(lái)源應(yīng)該具有取材非侵入性、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，并且無(wú)年齡、性別、族裔或身體情況限制。近年來(lái)，一種新型干細(xì)胞——人尿源性干細(xì)胞（Human urine derived stem cells，hUSC）被發(fā)現(xiàn)，hUSC具有良好的多向分化潛能、高度自我更新能力[2]，并且取材無(wú)創(chuàng)，無(wú)免疫和倫理方面的問(wèn)題，較之目前運(yùn)用于口腔組織工程的干細(xì)胞，如牙周膜干細(xì)胞 （Periodontal ligament cell，PDLC）、 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal cell，BMSC）、牙囊干細(xì)胞（Dental follicle stem cell，DFSC）、牙乳頭干細(xì)胞（Stem cell from the apical papilla，SCAP）和脂肪細(xì)胞（Adipose-derived stem cell，ADSC）等[3]，是一種更為理想的干細(xì)胞來(lái)源，有望成為口腔再生醫(yī)學(xué)研究的可靠的細(xì)胞來(lái)源，以修復(fù)和重建口腔關(guān)節(jié)、骨、軟骨、黏膜、涎腺等組織器官結(jié)構(gòu)和功能。

1 尿源干細(xì)胞

將人體新鮮尿液離心，保留離心管底部1 mL液體，并用培養(yǎng)液重懸后種植于培養(yǎng)板，反復(fù)擴(kuò)增后可得到hUSC[4]。hUSC的優(yōu)點(diǎn)：①取材簡(jiǎn)單、成本低廉、無(wú)創(chuàng)，每100 mL人新鮮尿液約含有干細(xì)胞2.5個(gè)[5]。②hUSC具有更高的端粒酶活性和更長(zhǎng)的端粒序列，擴(kuò)增能力強(qiáng)，3~4周即可擴(kuò)增到1×106個(gè)，6~7周能傳至第 4代，數(shù)量可達(dá) 1×108個(gè)[5-6]。③具有

2 尿源干細(xì)胞在口腔組織中的應(yīng)用與研究

目前，hUSC已經(jīng)顯示了其蘊(yùn)藏的廣闊的應(yīng)用前景，在泌尿系統(tǒng)疾病、骨組織工程，以及腦損傷修復(fù)等方面，均有相關(guān)研究與報(bào)道，而在口腔組織工程中的研究與運(yùn)用尚處于起步階段。

2.1 牙再生方面的應(yīng)用

近年來(lái)，組織工程和干細(xì)胞的研究進(jìn)展為牙列缺損的修復(fù)提供了更具吸引力的方法。誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPS）在牙再生領(lǐng)域有極大的運(yùn)用潛能，但受到細(xì)胞來(lái)源、增殖能力、分化潛能等限制，仍缺乏合適的種子細(xì)胞[14]。Cai等[15]將誘導(dǎo)分化的hUSC注入小鼠腎包膜下，3周后觀察到小鼠腎包膜下長(zhǎng)出牙齒樣結(jié)構(gòu)，含有與人體正常牙齒一致的牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙髓，并含有成釉細(xì)胞樣細(xì)胞，新生組織的化學(xué)組份、物理性質(zhì)與人正常牙齒高度相似。該研究結(jié)果表明，hUSC可用于再生特定的牙組織，是牙再生種子細(xì)胞的候選來(lái)源。

2.2 口腔頜面部骨組織缺損修復(fù)方面的應(yīng)用

骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展[16]。hUSC可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化， 其各方面的特性優(yōu)于BMSC，為骨組織工程提供了新的細(xì)胞來(lái)源。Guan等[17]分析了hUSC分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的能力，發(fā)現(xiàn)hUSC分化3周后，茜素紅S和von Kossa染色顯示出無(wú)定形鈣礦物沉積的直接證據(jù)；免疫熒光顯示，成骨相關(guān)蛋白OCN和Runx2的表達(dá)在hUSC誘導(dǎo)組中上調(diào)。進(jìn)一步評(píng)估hUSC的軟骨形成分化潛能，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)Sox9和Ⅱ型膠原的表達(dá)，結(jié)果表明hUSC有著顯著的軟骨形成分化能力；將誘導(dǎo)后的細(xì)胞接種裸鼠皮下，4周后可見(jiàn)骨樣包塊，組織學(xué)證實(shí)為骨組織。Bharadwaj等[7]提出通過(guò)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）轉(zhuǎn)染可提高h(yuǎn)USCs的成骨能力。Guan等[18]證明BMP2能誘導(dǎo)hUSC加速向成骨方向分化，且轉(zhuǎn)染BMP后hUSC無(wú)需其他輔助條件即可向成骨細(xì)胞分化，組織學(xué)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后hUSC在裸鼠皮下形成了新骨。Qin等[19]的研究顯示，適宜濃度的納米銀（AgNP）可以促進(jìn)hUSC的成骨分化。上述研究均表明hUSC的成骨能力是值得肯定的。hUSC可作為牙周組織再生、修復(fù)種植后骨缺損，以及治療顳下頜關(guān)節(jié)疾病的良好干細(xì)胞來(lái)源。

2.3 口腔頜面部神經(jīng)損傷修復(fù)方面的應(yīng)用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)可通過(guò)自身內(nèi)源性干細(xì)胞來(lái)修復(fù)[20]，提示了外源性移植干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷的可能性。目前，對(duì)于干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化研究多采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等，Guan等[17]研究了hUSC向神經(jīng)譜系的分化潛能，顯示了其在體外分化成神經(jīng)祖細(xì)胞的潛力。他們?cè)谏窠?jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中觀察到顯著的折射性細(xì)胞體，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性蛋白Sox2和巢蛋白的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明hUSC可以分化成神經(jīng)樣細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，hUSCs經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞呈現(xiàn)混合細(xì)胞群狀態(tài)，其中包括神經(jīng)干細(xì)胞、成熟神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；將hUSC移植于小鼠腦內(nèi)，3周后大鼠腦組織冰凍切片顯示細(xì)胞可從腦損傷移植區(qū)遷移至海馬區(qū)，說(shuō)明移植細(xì)胞能夠于宿主腦內(nèi)成功存活、遷移，并分化為神經(jīng)細(xì)胞[21]。因此，hUSC具有分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的潛能，對(duì)修復(fù)頜面部神經(jīng)損傷具有重要意義。

2.4 口腔頜面部軟組織缺損修復(fù)方面的應(yīng)用

新生血管的生成對(duì)傷口愈合具有重要作用。Wu等[22]將含有小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染hUSC，然后將細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞混合植入裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)移植區(qū)形成致密的微血管網(wǎng)，且表達(dá)了更多的內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，證明轉(zhuǎn)染后的hUSC能夠更有效地促進(jìn)血管生成。Liu等[23]的研究證實(shí)，用含有人VEGF165和綠色熒光的腺病毒轉(zhuǎn)染hUSC，植入裸鼠皮下，觀察到了廣泛血管化，并表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原CD31和von Willebrand's因子。將hUSC與復(fù)合聚己內(nèi)酯/明膠電紡納米支架（PCL/GT）結(jié)合，移植到體內(nèi)14 d后，傷口愈合率高于對(duì)照組，且皮膚結(jié)構(gòu)完整，上皮化程度高，新生膠原纖排列整齊，新生膠原纖維明顯多于對(duì)照組，并可見(jiàn)新生致密毛囊；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn) hUSC可通過(guò)旁分泌作用，在傷口處募集內(nèi)皮細(xì)胞，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)血管新生[24]。Yuan等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，hUSC分泌的外泌體可通過(guò)促進(jìn)大鼠血管生成而加速傷口愈合。綜上所述，hUSC可作為修復(fù)皮膚組織損傷的種子細(xì)胞，通過(guò)與其他誘導(dǎo)因子及支架材料結(jié)合加快皮膚創(chuàng)面愈合，可用于口腔頜面部損傷的修復(fù)及促進(jìn)皮瓣轉(zhuǎn)移的成功率。

2.5 類器官方面的應(yīng)用

類器官是利用多能干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞，在體外采用3D培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，包含目標(biāo)器官中至少一種細(xì)胞類型，能夠自組裝為器官樣結(jié)構(gòu)，且具有其生理結(jié)構(gòu)和功能特征，是研究疾病發(fā)病相關(guān)機(jī)制、藥物篩選和疾病治療的工具[26]。hUSC可分化為膀胱相關(guān)的細(xì)胞類型，包括功能性尿路上皮和平滑肌細(xì)胞譜系[27]。Wu等[28]將hUSC誘導(dǎo)分化的尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞接種在改良的3D多孔小腸黏膜下層支架上，得到了類似于天然尿道組織的多層黏膜結(jié)構(gòu)。Liu等[29]將hUSC種植在小腸黏膜下層，成功修復(fù)了兔尿道缺損，表明hUSC具有構(gòu)建類器官的潛力，可用于尿道修復(fù)及膀胱再造等。而類器官在口腔方面的運(yùn)用，目前主要集中在涎腺類器官。頭頸部惡性腫瘤的放射治療、舍格倫綜合征或其他原因?qū)е碌南严俜置诠δ苷系K，可導(dǎo)致口干、繼發(fā)性齲、吞咽困難等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[30]。涎腺類器官構(gòu)建應(yīng)用的干細(xì)胞主要有涎腺來(lái)源的干細(xì)胞和其他組織來(lái)源的干細(xì)胞兩大類，而hUSC在膀胱及尿道組織再生方面的研究成果，及其多向分化潛能、取材無(wú)創(chuàng)性、無(wú)致瘤性等優(yōu)點(diǎn)，為三維腺涎類器官的構(gòu)建提供了新的思路和種子細(xì)胞的選擇。

3 展望

hUSC作為一個(gè)新的理想干細(xì)胞來(lái)源，在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用報(bào)道還較少，其組織來(lái)源及其作用機(jī)制尚不明確，仍有不少問(wèn)題需要進(jìn)一步探索。已有的研究已經(jīng)顯示了hUSC的諸多優(yōu)點(diǎn)，在口腔再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在著廣闊的應(yīng)用前景，相信隨著研究的深入，hUSC有望在口腔組織工程領(lǐng)域獲得重要地位。

[1] Jafarzadeh N,Javeri A,Khaleghi M,et al.Oxytocin improves proliferation and neural differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].Neurosci Lett,2014,564(2):105-110.

[2] Shi L,Cui Y,Luan J,et al.Urine-derived induced pluripotent stem cells as a modeling tool to study rare human diseases[J].Intractable Rare Dis Res,2016,5(3):192-201.

[3] 姜蘇,郭淑娟,陳家俊,等.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在口腔組織再生中的可能性和進(jìn)展[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2012,47(5):318-320.

[4] Bodin A,Bharadwaj S,Wu S,et al.Tissue-engineered conduit using urine-derived stem cells seeded bacterial cellulose polymer in urinary reconstruction and diversion[J].Biomaterials,2010,31(34):8889-8901.

[5] Lang R,Liu G,Shi Y,et al.Self-renewal and differentiation capacity of urine-derived stem cells after urine preservation for 24 hours[J].PLoS One,2013,8(1):e53980.

[6] Chun SY,Kim HT,Lee JS,et al.Characterization of urinederived cells from upper urinary tract in patients with bladder cancer[J].Urology,2012,79(5):306-309.

[7] Bharadwaj S,Liu G,Shi Y,et al.Multipotential differentiation of human urine-derived stem cells:Potentialfortherapeutic applications in urology[J].Stem Cells,2013,31(9):1840-1856.

[8] Shi YA,Liu GH,Bharadwaj S,et al.Urine derived stem cells with high telomerase activity for cell based therapy in urology[J].J Urol,2012,187(4):e302

[9] Qin D,Long T,Deng J,et al.Urine-derived stem cells for potential use in bladder repair[J].Stem Cell Res Ther,2014,5(3):69.

[10] Ewers H,Romer W,Smith AE,et al.GM1 structure determines SV40-induced membrane invagination and infection[J].Nat Cell Biol,2009,12(1):11-18.

[11] 溫晟.人尿源性干細(xì)胞的永生化及其誘導(dǎo)分化研究[D].重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2014.

[12] 溫晟,沈煉桔,林濤,等.SV40T抗原基因介導(dǎo)尿源性干細(xì)胞永生化[J].中華小兒外科雜志,2016,37(3):220-225.

[13] Zhou T,Benda C,Duzinger S,et al.Generation of induced pluripotent stem cells from urine[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(7):1221-1228.

[14] Otsu K,Kumakami-Sakano M,Fujiwara N,et al.Stem cell sources for tooth regeneration:current status and future prospects[J].Front Physiol,2014,5:36.

[15] Cai J,Zhang Y,Liu P,et al.Generation of tooth-like structures from integration-free human urine induced pluripotent stem cells[J].Cell Regen(Lond),2013,2(1):6.

[16] Caplan AI.Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine[J].J Cell Physiol,2007,213(2):341-347.

[17] Guan JJ,Niu X,Gong FX,et al.Biological characteristics of human-urine-derived stem cells:potential for cell-based therapy in neurology[J].Tissue Eng Part A,2014,20(13-14):1794-1806.

[18] Guan J,Zhang J,Zhu Z,et al.Bone morphogenetic protein 2 gene transduction enhances the osteogenic potential of human urine-derived stem cells[J].Stem Cell Res Ther,2015,6:5.

[19] Qin H,Zhu C,An Z,et al.Silver nanoparticles promote osteogenic differentiation of human urine-derived stem cells at noncytotoxic concentrations[J].Int J Nanomedicine,2014,9:2469-2478.

[20] Feliciano DM,Zhang S,Nasrallah CM,et al.Embryonic cerebrospinal fluid nanovesicles carry evolutionarily conserved molecules and promote neural stem cell amplification[J].PLoS One,2014,9(2):e88810.

[21] 龔飛翔.人尿源性干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[D].南昌:南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院,2013.

[22] Wu S,Wang Z,Bharadwaj S,et al.Implantation of autologous urine derived stem cells expressing vascular endothelial growth factor for potential use in genitourinary reconstruction[J].J Urol,2011,186(2):640-647.

[23] Liu G,Wang X,Sun X,et al.The effect of urine-derived stem cells expressing VEGF loaded in collagen hydrogels on myogenesis and innervation following after subcutaneous implantation in nude mice[J].Biomaterials,2013,34(34):8617-8629.

[24] Fu Y,Guan J,Guo S,et al.Human urine-derived stem cells in combination with polycaprolactone/gelatin nanofibrous membranes enhance wound healing by promoting angiogenesis[J].J Transl Med,2014,12:274.

[25] Yuan H,Guan J,Zhang J,et al.Exosomes secreted by human urine-derived stem cells accelerate skin wound healing by promoting angiogenesis in rat[J].Cell Biol Int,2017,41(8):933.

[26] Lancaster MA,Knoblich JA.Organogenesis in a dish:modeling development and disease using organoid technologies[J].Science,2014,345(6194):1247125.

[27] Zhang Y,Mcneill E,Tian H,et al.Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction[J].J Urol,2008,180(5):2226-2233.

[28] Wu S,Liu Y,Bharadwaj S,et al.Human urine-derived stem cells seeded in a modified 3D porous small intestinal submucosa scaffold for urethral tissue engineering[J].Biomaterials,2011,32(5):1317-1326.

[29] Liu Y,Ma W,Liu B,et al.Urethral reconstruction with autologous urine-derived stem cells seeded in three-dimensional porous small intestinal submucosa in a rabbit model[J].Stem Cell Res Ther,2017,8(1):63.

[30] Coppes RP,Stokman MA.Stem cells and the repair of radiationinduced salivary gland damage[J].Oral Dis,2011,17(2):143-153.

The Research Progress and Application of Human Urine Derived Stem Cells in Oral Tissue Engineering

ZHANG Qianru,CHEN Lin,WANG Shuai．School of Stomatology,Zunyi Medical University;Guizhou Province Key Laboratory of Oral Diseases Research,Zunyi 563000,China.Corresponding author:WANG Shuai(E-mail:nanwangshuai639@126.com).

【Summary】Human urine-derived stem cells (hUSC)have been reported,and regarded as a candidate for seed cells in tissue engineering,which are highly expandable,and have self-renewal capacity,multi-differentiation potential and paracrine properties.More importantly,hUSC can be obtained via a non-invasive,simple way,and are low immunogenic without medical ethics restrictions.hUSC as an ideal source of stem cells,have demonstrated a prosperous progress in scientific research and potential application in the field of tissue engineering and regenerative medicine.The research achievement in urinary system,bone tissue engineering also implies potential applications of hUSC in oral maxillofacial tissue regeneration.In this paper,the application of hUSC in oral tissue engineering and regeneration were reviewed by summarizing domestic and overseas research progress on hUSC.

Human urine derived stem cells;Oral tissue engineering;Cell therapy;Organoids

Q813.1+1

B

1673－0364（2017）06－0340－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.011

貴州省科技廳科學(xué)技術(shù)基金計(jì)劃（黔教合基礎(chǔ)[2016]1170）；遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金。

563000 貴州省遵義市 遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州省高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

王帥（E-mail：nanwangshuai639@126.com）。良好的多向分化潛能，可分化為尿路上皮細(xì)胞、尿道平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞等。④不存在醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題[7]。⑤安全性高，目前尚未發(fā)現(xiàn)具有致瘤性，實(shí)驗(yàn)證明將細(xì)胞植入腎內(nèi)3個(gè)月未形成畸胎瘤[6，8]。⑥具有免疫調(diào)節(jié)能力，降低炎癥免疫反應(yīng)，抑制外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的增殖，并分泌IL-6和IL-8[9]。利用猿病毒 40大T抗原 （SV40Tag）[10]，溫晟等[11-12]成功構(gòu)建了SV40Tag永生化hUSC，且證實(shí)永生化后的hUSC保持了干細(xì)胞的分化潛能，仍能向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞分化，為組織工程研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。目前，對(duì)于hUSC的組織來(lái)源尚不明確，該細(xì)胞可能來(lái)源于腎上皮細(xì)胞，或來(lái)源于血液中干細(xì)胞通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)時(shí)漏出到尿液中形成的干細(xì)胞[13]。

2017年10月6日；

2017年10月29日）