戶太八號葡萄酒發(fā)酵過程中菌群種類研究

黨 歡，葛含靜，張慧敏，安萌原，張 梅，李璟琦

(陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院， 陜西西安 710100)

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戶太八號葡萄酒發(fā)酵過程中菌群種類研究

黨 歡，葛含靜，張慧敏，安萌原，張 梅，李璟琦

(陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院， 陜西西安 710100)

本研究對西安地區(qū)特有葡萄品種——戶太八號在自然發(fā)酵釀制葡萄酒的不同時期分離出的酵母菌種類進行研究。利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，對分離出的339株酵母菌進行初步鑒定。結果表明，在發(fā)酵前期，分離出的酵母菌數(shù)量最少，種類最多，可歸入6個屬8個種，即葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母、美極梅奇酵母、膜璞畢赤酵母、季也蒙有孢漢遜酵母、釀酒酵母、畢赤克魯維酵母及紅冬孢酵母，分別占發(fā)酵前期酵母菌總數(shù)的48.8%，20.9 %，11.6%，7.0%，4.7%，2.3% ，2.3%和2.3%；在發(fā)酵中期，分離出的酵母菌種類僅有4種，即釀酒酵母、東方伊薩酵母、畢赤克魯維酵母及葡萄汁有孢漢遜酵母，分別占發(fā)酵中期酵母菌總數(shù)的67.1%，26.0%，5.5%和1.4%；而發(fā)酵末期，只有釀酒酵母。戶太八號在自然發(fā)酵釀制葡萄酒的不同時期菌群種類不盡相同，為戶太八號葡萄酒發(fā)酵過程中菌群種類動態(tài)變化的研究及優(yōu)勢菌種的篩選奠定了基礎。

戶太八號；自然發(fā)酵；WL培養(yǎng)基；菌群

PDF獲?。?http://sxxqsfxy.ijournal.cn/ch/index.aspx doi： 10.11995/j.issn.2095-770X.2016.12.033

目前，許多葡萄酒生產企業(yè)面臨的一個突出問題是，大量使用進口活性釀酒酵母，雖保證了發(fā)酵速率和產品質量的穩(wěn)定性，卻導致葡萄酒品質嚴重同質化，從而降低了本土釀酒酵母對葡萄酒香氣的貢獻[1-2]。葡萄酒自然發(fā)酵則是利用葡萄果皮、果?；蚩諝庵械奶烊灰吧湍竿瓿傻木凭l(fā)酵過程。在此復雜的生態(tài)生化過程中，不同酵母屬種此消彼長，處于動態(tài)變化之中；多種酵母在發(fā)酵過程中的協(xié)同作用，可以有效地增加葡萄酒風味的多樣性，但也可能影響葡萄酒質量的穩(wěn)定性[3]。探究葡萄酒在自然發(fā)酵過程中酵母菌種類及動態(tài)變化，揭示其變化規(guī)律，有利于控制葡萄酒自然發(fā)酵過程中的微生物，也可為酵母菌對葡萄酒風味的影響提供理論依據(jù)。

本研究利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對西安地區(qū)特有葡萄品種——戶太八號在自然發(fā)酵過程中的葡萄酒相關酵母進行了初步鑒定，旨在揭示戶太八號自然發(fā)酵過程中酵母菌種類及動態(tài)變化規(guī)律。

1 實驗材料

1.1 實驗原料

2013年9月中旬從西安產區(qū)采集成熟戶太八號葡萄果實，于陜西學前師范學院生物科學與技術系創(chuàng)新實驗室壓榨釀造成酒，在釀造的不同階段分離得到酵母菌。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[4]：葡萄糖5%，(NH4)2SO40.2%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，滅菌后加Na2SO430mg/L。如制固體培養(yǎng)基，加瓊脂2%。

分離培養(yǎng)基(YEPD培養(yǎng)基)：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。如制固體培養(yǎng)基，加瓊脂2%。保藏培養(yǎng)基同分離培養(yǎng)基。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方[5]：酵母浸粉0.4%，蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%。無機鹽類：KH2PO40.055%，KCl 0.0425%，CaCl20.0125%，MgSO40.0125%，F(xiàn)eCl30.0025%，MnSO40.00025%，溴酚綠22mg/L，pH5.5。

2 實驗方法

2.1 酵母菌的篩選

將所采戶太八號葡萄破碎，連皮帶汁一起裝入2個2000 mL滅菌的發(fā)酵瓶中，每瓶裝1200 mL，于25 ℃自然發(fā)酵，并在其中一瓶中按照40 mg/L濃度加入SO2作為對照。同時做2組平行試驗。

分別在戶太八號葡萄酒自然發(fā)酵過程的前期、中期、后期3個時期取樣。前期，即從葡萄破碎進罐至發(fā)酵啟動(此時罐底部有少量氣泡向頂部上升)；中期，即發(fā)酵旺盛期(此時罐內有大量氣泡上升)；后期，即發(fā)酵消退期(此時液面又降至初期，發(fā)酵醪中無明顯氣泡上升)[6]。量取酒樣10 mL，加入到100 mL無菌液體富集培養(yǎng)基中，于25℃、170 rpm培養(yǎng)24 h。將富集液用無菌生理鹽水按10-1，10-2，…，10-6等不同濃度梯度進行稀釋，吸取稀釋液0.2 mL，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板上，于25 ℃培養(yǎng)72 h，選擇菌落生長良好且密度適當?shù)钠桨澹S機挑取10-20個單菌落進行轉接，并多次劃線培養(yǎng)，從而獲得純化菌株。

純化菌株保藏于試管斜面或10%甘油管中，以備用。

2.2 酵母菌的初步鑒定

將保藏的菌種在5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中活化24 h，劃線接種于WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于25 ℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄單菌落特征。

3 結果與分析

3.1 自然發(fā)酵過程中酵母菌的種類

從戶太八號自然發(fā)酵的葡萄醪中共分離到339株酵母菌，利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對其進行分類，結果見表1。

表1 戶太八號自然發(fā)酵的葡萄醪中各菌特征及比例

由表1可知，分離到的339株酵母菌分別屬于6個屬8個種，即葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母、美極梅奇酵母、膜璞畢赤酵母、季也蒙有孢漢遜酵母、釀酒酵母、畢赤克魯維酵母和紅冬孢酵母，分別占分離總菌株數(shù)的6.8%, 13.9%, 1.5%, 0.9%, 0.6%, 73.3%, 2.7%和0.3%，其中，釀酒酵母所占比例最大。

3.2 自然發(fā)酵過程中酵母菌群的變化

在戶太八號葡萄酒自然發(fā)酵過程中，酵母菌的種類會隨發(fā)酵時間有規(guī)律地變化。對自然發(fā)酵各時期出現(xiàn)的酵母菌進行統(tǒng)計，結果見表2。

表2 發(fā)酵各階段酵母菌種類和比例

注：“-”表示未檢出。以下同。

由表2可知，發(fā)酵前期，有8種酵母菌，即葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母、美極梅奇酵母、膜璞畢赤酵母、季也蒙有孢漢遜酵母、釀酒酵母、畢赤克魯維酵母及紅冬孢酵母，分別占發(fā)酵前期酵母菌總數(shù)的48.8%，20.9 %，11.6%，7.0%，4.7%，2.3% ，2.3%和2.3%；葡萄汁有孢漢遜酵母最多，而釀酒酵母、畢赤克魯維酵母和紅冬孢酵母分別僅篩選到1株。隨著發(fā)酵時間的推移，酵母菌的種類逐漸減少。在發(fā)酵中期，有4種酵母菌，即釀酒酵母、東方伊薩酵母、畢赤克魯維酵母及葡萄汁有孢漢遜酵母，分別占發(fā)酵中期酵母菌總數(shù)的67.1%，26.0%，5.5%和1.4%；葡萄汁有孢漢遜酵母所占比例急劇下降，東方伊薩酵母比例有所下降，畢赤克魯維酵母有些許增加，釀酒酵母比例上升幅度頗大。而在發(fā)酵末期，就只有釀酒酵母，最終發(fā)酵過程轉變成釀酒酵母的純種發(fā)酵。

許多研究表明[12-14]，在葡萄果實表面，葡萄汁有孢漢遜酵母、紅冬孢酵母及畢赤克魯維酵母等，占主導地位，由它們來啟動發(fā)酵；非釀酒酵母在發(fā)酵初期生長良好，發(fā)酵中期逐漸消亡，被耐酒精能力更強及在低糖環(huán)境中更具競爭力的釀酒酵母所替代，直到發(fā)酵完成。本研究中分離到的6個屬8個種的酵母菌在發(fā)酵初期都有存在，隨著發(fā)酵時間的推移，發(fā)酵醪中酒精度升高，糖含量逐漸減少，酒精耐性較差的菌株逐漸消亡，而酒精耐性高的釀酒酵母逐漸占據(jù)優(yōu)勢，并最終完成發(fā)酵。這與王澤舉等人的研究結果一致[6]。

3.3 SO2在自然發(fā)酵過程中對酵母菌種類的影響

SO2是一種殺菌劑，能控制各種發(fā)酵微生物的代謝活動，如繁殖、呼吸以及發(fā)酵。發(fā)酵微生物種類不同，抵抗SO2的能力也不同。在自然發(fā)酵的葡萄酒中加入SO2，對酵母菌具有選擇作用[6,15]。在戶太八號葡萄酒自然發(fā)酵的各階段，SO2對酵母菌種類和比例的影響見表3。

表3 發(fā)酵各階段SO2對酵母菌種類和比例的影響

由表3可知，在戶太八號葡萄酒自然發(fā)酵前期，分離出的酵母菌數(shù)量最少，但種類最多；在發(fā)酵中期，分離出的酵母菌種類僅有4種；而發(fā)酵末期，就只有釀酒酵母。發(fā)酵前期，未加SO2的酒樣中由于雜菌生長旺盛，酵母菌難以分離出來，僅分離到7株酵母菌，歸于4個屬5個種，葡萄汁有孢漢遜酵母占絕對優(yōu)勢；而在加入40 mL/L SO2的酒樣中，雜菌生長受到抑制，共分離到36株酵母菌，歸于6個屬8個種，同樣，葡萄汁有孢漢遜酵母占絕對優(yōu)勢，東方伊薩酵母所占比例次之。在發(fā)酵中期，未加SO2的酒樣中共分離到96株酵母菌，歸于4個屬4個種，釀酒酵母成優(yōu)勢菌種，東方伊薩酵母所占比例較發(fā)酵前期顯著提高；而在加入40 mL/L SO2的酒樣中，共分離到50株酵母菌，歸于3個屬3個種，未檢出葡萄汁有孢漢遜酵母，釀酒酵母和東方伊薩酵母變化趨勢與未加SO2的酒樣相同。在發(fā)酵后期，無論加或不加SO2的酒樣中，均只有釀酒酵母。因此，添加SO2對發(fā)酵過程中酵母菌的種類和組成有非常顯著的影響。

4 結論

戶太八號葡萄酒自然發(fā)酵前期分離出的酵母菌數(shù)量最少，但種類最多；發(fā)酵中期分離出的酵母菌種類僅有4種；而發(fā)酵末期只有釀酒酵母。在釀造前期，向醪液中添加適量SO2是篩選野生釀酒酵母的一種有效的方法。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對葡萄酒自然發(fā)酵過程中絕大多數(shù)酵母菌鑒別力極好，是大量酵母菌初步鑒定的最佳方法。

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[學術編輯 趙大洲]

[責任編輯 朱毅然]

Research of Microbiome Species During Wine Fermentation with No.8 Hutai Grape

DANGHuan,GEHan-jing,ZHANGHui-min,ANMeng-yuan,ZHANGMei

(CollegeofLifeScienceandFoodEngineering,ShaanxiXueqianNormalUniversity,Xi’an710100,China)

The study intended to research the species of yeasts isolated from must of spontaneous fermentation with No.8 Hutai—the unique species in Xi’an. 339 isolated yeasts were identified primarily on Wallerstein Laboratory Nutrient Agar(WL agar). The result is that in the initial stage of fermentation, eight species of six genera mainly belonging toHanseniasporauvarum,Issatchenkiaorientalis,Metschnikowiapulcherrima,Pichiamembranefaciens,Hanseniasporaguilliermondii,Saccharomycescerevisiae,PichiakluyverandRhodosporidiummucilaginouswere found among all stains, with proportion of 48.8%, 20.9%, 11.6%, 7.0%, 0.6%, 2.3%, 2.3% and 2.3%, respectively, and the quantity of yeast was the least but the species was the most, while there were 4 species in the middle stage, such asH.uvarum,I.orientalis,S.cerevisiaeandP.kluyver, with proportion of 1.4%, 26.0%, 67.1% and 5.5%, and additionally there was onlyS.cerevisiaeat the end. The microbiome were different during wine spontaneous fermentation with No.8 Hutai. The study lays a foundation of researching microbiome species dynamically and screening dominant bacterial strains during wine fermentation.

No.8 Hutai；spontaneous fermentation；Wallerstein Laboratory Nutrient Agar (WL agar)；microbiome species

2016-06-27;

2016-09-22

陜西學前師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2015DC032)；陜西省教育廳2015年教改項目(15BY120)；陜西學前師范學院博士研究生科研專項(2014DS001)

黨歡，女，陜西西安人，陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院本科生。

葛含靜，女，陜西咸陽人，陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院講師,工學博士，主要研究方向：糧食工程與發(fā)酵技術創(chuàng)新，學前兒童營養(yǎng)與保健。

■自然科學研究

TS201.3

A

2095-770X(2016)12-0145-04