RP-HPLC法同時(shí)測定山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的含量

李 佳，蒲曉，宗蘭蘭，袁 琦，楊 浩

河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004

RP-HPLC法同時(shí)測定山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的含量

河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475004

〔目的〕 建立同時(shí)測定山茱萸中莫諾苷和馬錢苷含量的方法?！卜椒ā?采用反相HPLC法和依利特ODS-BP(250 mm×4.6 mm)色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長為237 nm。〔結(jié)果〕 莫諾苷和馬錢苷質(zhì)量濃度分別在0.099 0～0.495 0 mg/mL、0.040 0～0.240 0 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別是0.999 9、0.999 8，平均回收率分別為97.4%(RSD=1.68%，n=9)、98.6%(RSD=1.30%，n=9)?！步Y(jié)論〕HPLC法測定山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的含量，線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好，可作為該藥品的質(zhì)量控制方法。

HPLC法；山茱萸；莫諾苷；馬錢苷；含量測定

中藥山茱萸(Fructus corni)為山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果肉，別名蜀棗、鼠矢、雞足、山英肉、實(shí)棗兒、棗皮、英肉等。該藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，味酸、澀，入肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)肝腎、澀精固脫之功效。臨床上既可治療腎虛之遺精滑泄、腰膝酸軟、頭暈耳鳴等癥，又可用于大汗欲脫或久病虛脫之急證，是中醫(yī)常用的滋補(bǔ)良藥。山茱萸具有免疫調(diào)節(jié)、抗休克和強(qiáng)心、抗心律失常、降低血糖、抗癌、抗炎和殺菌、抗衰老、治療不育癥等活性，對艾滋病及癌癥等也有一定療效，同時(shí)又是常用中成藥“六味地黃丸”“桃豆地黃湯”等的原料，中藥生產(chǎn)用量和市場需求量大，具有廣闊的開發(fā)前景[1]。

山茱萸的化學(xué)成分主要含有環(huán)烯醚萜苷類、皂苷、多糖、熊果酸、齊墩果酸、鞣質(zhì)等。其中具有療效的成分主要是齊墩果烷系皂苷(其水解后的苷元為齊墩果酸和熊果酸)、馬錢甘苷及莫諾苷等苦味素物質(zhì)[2-6]?！吨腥A人民共和國藥典》2000版、2005版和2010版分別以熊果酸和馬錢苷作為山茱萸質(zhì)量控制指標(biāo)。水溶性成分馬錢苷和莫諾苷為山茱萸的主要活性成分。莫諾苷具有保護(hù)細(xì)胞免于H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的作用，可作為一種神經(jīng)保護(hù)類藥物，馬錢苷為環(huán)烯醚萜苷類，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗休克作用。因此，我們采用甲醇超聲提取法對山茱萸中的莫諾苷和馬錢苷進(jìn)行提取，并用HPLC測定其含量，為山茱萸的質(zhì)量控制提供一種可行的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，BP-211D電子天平(德國Sartorius公司)，AS3120型超聲波清洗器(天津奧特塞恩儀器有限公司)。

1.2 試劑

莫諾苷對照品(中國食品藥品檢定研究所，批號：111640-201005)，純度98.5%；馬錢苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111640-201005)，純度99.2%；山茱萸飲片(河南南陽)；甲醇(天津四友)，色譜純；水(自制)，重蒸水。其余試劑(市售)，分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

圖1 混合對照品及山茱萸樣品的HPLC圖譜

色譜柱：依利特C18色譜柱(SinoChrom ODS-BP 250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：A為去離子純凈水，B為甲醇。梯度洗脫：0～8 min，32% A；15～30 min，36% A。柱溫：25 ℃。流速：1 mL/min。檢測波長：237 nm。理論塔板數(shù)：按馬錢苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在此色譜條件下，得到馬錢苷和莫諾苷空白溶劑、對照品及供試品溶液的HPLC圖譜，見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的莫諾苷對照品9.9 mg、馬錢苷對照品10.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，混合均勻，作為對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

取山茱萸樣品粗粉0.45 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，按1∶30的料液比加入甲醇；超聲(40 kHz，100 W)1 h，取出，放置至室溫，定容，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾。取其續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取莫諾苷儲備液和馬錢苷儲備液各6份。將莫諾苷稀釋到0.099 0 、0.198、0.257、0.297、0.396、0.495 mg/mL，將馬錢苷稀釋到0.040 0、0.080 0、0.120、0.160、0.200 mg/mL、0.240 mg/mL，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。按外標(biāo)法，以峰面積Y對進(jìn)樣濃度X進(jìn)行線性回歸，得：莫諾苷的回歸方程，Y=1.70×10-7X-6.14×104(r=0.999 9)；馬錢苷的回歸方程，Y=2.01×10-6X-3.87×105(r=0.999 8)。結(jié)果表明，莫諾苷在0.099 0～0.495 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，馬錢苷在0.040 0～0.240 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取線性項(xiàng)下含莫諾苷和馬錢苷為0.198、0.200 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。計(jì)算得，莫諾苷和馬錢苷峰面積積分值的RSD分別為0.93%、0.26%，表明在此條件下儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

供試品溶液配置后放置于室溫，于2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。計(jì)算得，莫諾苷和馬錢苷峰面積積分值的RSD分別為1.93%、1.40%，表明供試品在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次(120325)供試品，按上述方法配制供試品溶液6份，每份溶液進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。計(jì)算得，莫諾苷和馬錢苷含量的RSD分別為1.12%、1.30%，表明該法重復(fù)性較好。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批次(120325)已測定含量的供試品約0.2 g，精密稱定，共9份。按照樣品中所含莫諾苷和馬錢苷含量的80%、100%、120%分別加入莫諾苷和馬錢苷對照品適量，按2.2節(jié)所述方法制備9份供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。計(jì)算得，莫諾苷和馬錢苷的平均加樣回收率分別為97.4%、98.6%，其RSD值分別為1.68%、1.30%。

2.9 供試品含量測定

按擬定的含量測定方法，分別測定三批供試品中莫諾苷和馬錢苷的含量。每批取3份供試品制成供試品溶液，每份溶液進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算莫諾苷和馬錢苷的含量，結(jié)果見表1。

表1 供試品含量測試

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)報(bào)道中，同時(shí)測定山茱萸中馬錢苷和莫諾苷的含量大多采用雙波長、波長轉(zhuǎn)換或二極管陣列等多波長的檢測方法[7-9]。我們對馬錢苷和莫諾苷對照品的甲醇溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果(見圖2)發(fā)現(xiàn)：馬錢苷在236.19 nm波長處有最大吸收，莫諾苷在238.42 nm波長處有最大吸收。因此，嘗試對檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，采用237 nm的單波長進(jìn)行檢測。

圖2 馬錢苷和莫諾苷的紫外吸收圖

我們分別嘗試采用文獻(xiàn)報(bào)道中的磷酸-甲醇-水、乙腈-水，以及不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相，對樣品組分的分離情況進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入酸后，出現(xiàn)峰不對稱現(xiàn)象。因此，考慮采用甲醇-水為流動(dòng)相。在保證樣品中莫諾苷和馬錢苷組分色譜峰的分離度及峰純度的情況下，采用梯度洗脫，從而縮短了樣品的分析時(shí)間，在最大程度上簡化了山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的含量測定方法。

3.2 提取方法的選擇

馬錢苷和莫諾苷為環(huán)烯醚萜苷類化合物，化學(xué)性質(zhì)活潑，易水解，因此對提取條件要求較嚴(yán)格。我們通過對山茱萸的提取溶劑、提取方式和時(shí)間及料液比等進(jìn)行了考察，經(jīng)過正交試驗(yàn)，考慮到樣品中莫諾苷和馬錢苷的色譜峰形，最終確定以甲醇為提取溶劑，采用超聲提取。提取時(shí)間1 h，料液比1∶30。這樣既有效地保護(hù)了被測成分，又可以使樣品組分很好地分離，且峰形較好，故采用甲醇為提取溶劑。

結(jié)果顯示，我們的測定方法線性關(guān)系良好、精密度和準(zhǔn)確度高、重復(fù)性較好，在最大程度上優(yōu)化了山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的含量測定方法，為山茱萸的質(zhì)量控制提供了簡便、快速的含量測定方法。

[1] 李雅梅,李華,李春榮． 山茱萸化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]． 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 19(6):500-502.

[2] Wang Yue, Li Zhengquan, Chen Lirong, et al. Antiviral compounds and one new iridoid glycoside from Comus officinalis[J]. Progress in natural science, 2006,16(2):142-146.

[3] 胡榮,陳小虎,鄧君,等． RP-HPLC-ELSD同時(shí)測定山茱萸中馬錢苷、齊墩果酸與熊果酸的含量[J]． 中藥材, 2010, 33(1):70-71.

[4] 趙永席,馬國營,梁恒． 中藥山茱萸的高效液相色譜指紋圖譜及其聚類分析[J]． 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 40(2):239-242.

[5] 皮文霞,許桂玲,郭戎,等． 山茱萸HPLC指紋圖譜研究[J]． 中藥材, 2010, 33(4):530-532.

[6] 劉華亮,袁珂,陳年者,等． 山茱萸炮制前后的HPLC指紋圖譜研究[J]． 中國藥房,2012,23(3):234-236.

[7] 龔衛(wèi)紅,趙希賢. 雙波長高效液相色譜法測定山茱萸中多種成分的含量[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(14):58-60.

[8] 趙平,閆潤紅,劉養(yǎng)清,等. 栽培與野生山茱萸中馬錢苷和莫諾苷含量分析[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009,15(4):7-9.

[9] 王秀文,劉養(yǎng)清,閆潤紅,等. 山茱萸中莫諾苷和馬錢苷的相關(guān)性研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2009,22(6):65-67.

[責(zé)任編輯 段金卯]

Determination of the Morroniside and Loganin in Cornus officinalis by HPLC

Institute of Materia Medica, Henan University, Kaifeng 475004, China

〔Objective〕To establish a method for the determination of morroniside and loganin in Cornus officinalis.〔Methods〕The sample was analyzed on a Hypersil-ODS chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), with a gradient elution of methanol-water at the flow rate of 1.0 mL/min, and the detection wavelength was set at 237 nm. 〔Results〕The calibration curves were linear within the range of 0.099 0～0.495 mg/mL for morroniside, and 0.040 0～0.240 mg/mL for loganin, respectively. The average recoveries of morroniside and loganin acid were 97.4% and 98.6%，and RSDs were 1.68% and 1.30%，respectively.〔Conclusion〕It showed that the HPLC method for determination of morroniside and loganin in Cornus officinalis has the following advantages: good linearity, high accuracy, good stability and good reproducibility. It was very significant for the quality control of the drug.

HPLC; Cornus officinalis; Morroniside; Loganin; Content determination

1672-7606(2016)04-0249-03

2016-10-09

基金項(xiàng)目：NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金(U1304826)

李佳(1990-)，女，河南駐馬店人，碩士研究生，從事藥物新劑型及其質(zhì)量研究工作。

蒲曉輝(1980-)，男，河南商丘人，博士，副教授，從事藥物新劑型研究工作。

R927.2

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