鄰苯二甲酸為背景吸收電解質(zhì)的毛細(xì)管電泳法測定低分子量肝素中的陰離子

張明瑜, 康經(jīng)武(生命有機化學(xué)國家重點實驗室, 中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所, 上海 200032)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究論文

鄰苯二甲酸為背景吸收電解質(zhì)的毛細(xì)管電泳法測定低分子量肝素中的陰離子

張明瑜, 康經(jīng)武*
(生命有機化學(xué)國家重點實驗室, 中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所, 上海 200032)

毛細(xì)管電泳;陰離子分析;低分子量肝素;穩(wěn)定性監(jiān)測

肝素是最早應(yīng)用于臨床的生物大分子藥物之一,目前仍然被廣泛用于抗凝血、治療血栓栓塞性疾病以及心血管手術(shù)、心臟導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)和血液透析等過程中儀器表面的抗凝處理。低分子量肝素(low molecular weight heparins,LMWHs)是由普通肝素(unfractioned heparin,UFH)通過物理化學(xué)或酶解的方法分級或解聚而得[1]。與UFH相比,LMWHs抗凝血作用更易預(yù)測,生物利用度更高,半衰期更長,清除率為非濃度依賴性[2],在臨床應(yīng)用中更加方便且治療成本更低,LMWHs也因此成為制藥界和學(xué)術(shù)界的研究熱點。UFH和LMWHs主要通過糖鏈中一種特殊的五糖序列,即AGA*IA(A為GlcNAc6SO3或GlcNSO36SO3,G為GlcA,A*為GlcNSO33SO36SO3,I為IdoA2SO3;其中GlcN表示氨基葡萄糖,GlcA表示葡糖醛酸,IdoA表示艾杜糖醛酸,Ac表示乙酰化,SO3表示硫酸化,數(shù)字表示呋喃環(huán)上的取代位置)與抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ,ATⅢ)專一性結(jié)合而發(fā)揮抗凝血作用。同時,糖鏈與ATⅢ通過非專一性的靜電結(jié)合形成復(fù)合物對于肝素的抗凝血活性也具有非常重要的作用[3]。LMWHs糖鏈上硫酸化程度的改變會影響這兩方面的作用,進(jìn)而影響其生物活性[3,4]。然而,UFH和LMWHs糖鏈上的硫酸基團并不穩(wěn)定,在生產(chǎn)及儲存過程中易解離成游離的硫酸根[5,6]。因此,美國藥典要求必須測定LMWHs中游離硫酸根的含量[6]。同時,在肝素類藥物的生產(chǎn)過程中也會引入氯離子和乙酸根離子等,對于這些離子的檢測也很有必要。

離子色譜(ion chromatography,IC)廣泛應(yīng)用于無機和有機離子的分析[7]。自2012年開始,美國藥典規(guī)定采用IC測定LMWHs之一的依諾肝素鈉中硫酸根的含量[8]。最近,Liu等[6]進(jìn)一步發(fā)展了IC方法,研究了不同儲存條件下UFH和LMWHs中多種無機陰離子的變化,可用于監(jiān)測肝素類藥物的穩(wěn)定性。然而,IC柱成本較高且離子色譜抑制器極易被肝素這樣具有大相對分子質(zhì)量的樣品污染。因此,發(fā)展操作簡便、成本低廉的肝素類藥物中游離硫酸根離子含量測定方法非常必要。毛細(xì)管電泳(CE)因為具有分離效率高、速度快、所需樣品少、樣品前處理簡單、抗污染能力強等特點,已經(jīng)成為與液相色譜互補的一種液相分離技術(shù),尤其適用于分析含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品[9]。與IC相比,CE操作更加簡便,分析時間更短,成本更低,是一種非常有效的有機或無機陰陽離子測定方法[10-12]。遺憾的是,CE仍然存在不足,CE-間接紫外檢測法的檢出限(LOD)通常只能達(dá)到10-4～10-5mol/L。為了改善CE的檢測靈敏度,Wojtusik等[13]、Doble等[14]及Quirino等[15]都對CE-間接紫外檢測法中檢測靈敏度的影響因素進(jìn)行了詳盡的研究,并提出了多種提高靈敏度的方法。

本文的目的是發(fā)展一種更簡便的CE方法以提高低分子量肝素中陰離子的檢測靈敏度。選擇鄰苯二甲酸作為間接紫外吸收法的背景吸收電解質(zhì)。與常用的鉻酸根相比,鄰苯二甲酸具有較高的摩爾吸光系數(shù),電泳淌度與待研究的陰離子更加匹配,可以獲得較窄的峰形,檢測靈敏度更高。本文利用這一方法測定了依諾肝素鈉中多個陰離子的含量,并用于研究依諾肝素鈉的穩(wěn)定性與游離硫酸根含量的相關(guān)性。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

P/ACE MDQ CE系統(tǒng)配UV檢測器(美國Beckman Coulter公司)。熔融石英毛細(xì)管柱(75 μm i.d., 363 μm o.d.,邯鄲鑫諾公司)。無水硫酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、氟化銨、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)、鄰苯二甲酸、鉬酸和二乙醇胺均為分析純,購自上海阿拉丁公司。三水磷酸銨、乙酸鈉、水楊酸、重鉻酸鈉均為分析純,購自上海國藥集團。依諾肝素鈉樣品由杭州九源基因工程有限公司贈送。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為18 MΩ5cm超純水(Millipore UV超純水系統(tǒng),美國Millipore公司)。

1.2 緩沖溶液和樣品的配制

CE的背景吸收電解質(zhì)溶液為10 mmol/L鄰苯二甲酸和二乙醇胺組成的緩沖溶液(含0.08 mmol/L CTAB,用二乙醇胺調(diào)節(jié)pH為9.2)。所有緩沖溶液使用前用0.45 μm濾膜過濾。分別配制0.1 mol/L的鄰苯二甲酸(用二乙醇胺調(diào)節(jié)pH至8.0左右)、50 mmol/L的CTAB及50%(v/v)二乙醇胺儲備液。優(yōu)化CE分離條件時,由儲備液稀釋配制不同濃度或不同pH的背景吸收電解質(zhì)溶液。分別配制1 mol/L氯化鈉、硫酸鈉、氟化銨、乙酸鈉和0.5 mol/L磷酸銨作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的儲備液。配制好的溶液置于4 ℃冰箱存放。

1.3 CE條件

所有的CE實驗均在配有UV檢測器的P/ACE MDQ CE系統(tǒng)上進(jìn)行。數(shù)據(jù)的采集和處理均采用Beckman公司CE工作站系統(tǒng)。

進(jìn)樣條件為3 447.5 Pa×15 s。熔融石英毛細(xì)管柱總柱長為40 cm(有效長度為29.5 cm);柱溫為25 ℃。新毛細(xì)管柱用0.1 mol/L NaOH溶液活化30 min(207 kPa),再用超純水和背景吸收電解質(zhì)溶液分別沖洗2 min(207 kPa)。每一次分析前用0.1 mol/L NaOH、超純水和背景吸收電解質(zhì)溶液分別沖洗2 min(207 kPa)。分離電壓為-18 kV。采用間接紫外檢測,檢測波長為230 nm。

1.4 依諾肝素鈉穩(wěn)定性實驗

取一定量粉末狀依諾肝素鈉,分別放置于30、60及80 ℃,于0、5、12、24和48 h時取樣,用超純水溶解至質(zhì)量濃度為1.0 g/L后直接用CE分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的建立和優(yōu)化

根據(jù)間接紫外吸收的原理[13,16],影響被分析物檢測靈敏度(Clod)的因素如公式(1)所示：

(1)

其中,Cp是背景吸收電解質(zhì)的濃度;DR是背景吸收與噪聲的比例;TR是置換系數(shù),即一個被分析離子替代背景吸收電解質(zhì)離子的個數(shù);NBL是基線噪聲,ε和l分別為背景吸收電解質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)和光程。因此,尋找具有高摩爾吸光系數(shù)、高TR值的背景電解質(zhì)離子以降低背景吸收可以獲得高的檢測靈敏度。背景吸收電解質(zhì)離子的選擇需滿足以下條件:電泳淌度與陰離子匹配、在毛細(xì)管壁沒有吸附、毒性小、價格低廉以及容易獲得等[16,17]。從圖1可知,鉬酸根和鄰苯二甲酸根的電泳淌度與所有待測定陰離子電泳淌度更為匹配,能夠使大部分待測離子的峰形得到改善,增加檢測靈敏度[18],因此,這兩種離子適合作為背景吸收電解質(zhì)。

圖1 各種背景離子和被分析陰離子電泳淌度的對比Fig. 1 Comparison of the electrophoretic mobilities of probe ions and analyte anions

經(jīng)過測定,鄰苯二甲酸根在230 nm的表觀摩爾吸光系數(shù)(4 754 L/(mol5cm))高于鉬酸根(4 157 L/(mol5cm)),而且鄰苯二甲酸根為背景吸收電解質(zhì)的TR值比鉬酸根高,即同樣的一個陰離子可以替代鄰苯二甲酸根離子的個數(shù)多于鉬酸根。根據(jù)公式(1),以鄰苯二甲酸根作為背景吸收電解質(zhì)可以獲得較高的檢測靈敏度。綜合考慮,鄰苯二甲酸是用于毛細(xì)管電泳分析肝素類藥物中陰離子較理想的背景吸收電解質(zhì)。

圖2 鄰苯二甲酸濃度對分離的影響Fig. 2 Effects of the concentrations of phthalate on the separation Conditions: a fused-silica capillary of 75 μm i.d. (363 μm o.d.)×40 cm (effective length 29.5 cm from the inlet to the detection window); the CE background electrolyte was consisted of 0.08 mmol/L CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide, pH 9.2); the applied voltage was -15 kV; the capillary was thermostated at 25 ℃; all analytes were detected at 230 nm with indirect UV detection; the samples were injected by pressure of 3 447.5 Pa for 5 s. The concentrations of the anions were all 0.1 mmol/L.

用毛細(xì)管電泳分析陰離子時,需加入陽離子表面活性劑CTAB作為電滲流改性劑反轉(zhuǎn)電滲流,從而使電滲流與陰離子發(fā)生共遷移縮短分析時間[14]?？疾炝薈TAB濃度在0.02～0.20 mmol/L范圍內(nèi)變化時,陰離子遷移時間的變化。如圖3所示,當(dāng)CTAB濃度增加到0.08 mmol/L時,繼續(xù)增加CTAB的濃度,遷移時間無明顯減小,因此選擇CTAB的濃度為0.08 mmol/L。還考察了分離電壓對遷移時間的影響。當(dāng)毛細(xì)管長度一定時,分離電壓決定電場強度,而電場強度影響電滲流速度和荷電物質(zhì)遷移率,繼而決定了分析物的遷移時間。分離電壓越高,組分遷移時間越短,但過高的電壓會引起焦耳熱增加,基線噪聲增大,導(dǎo)致靈敏度降低。在考察了分離電壓為-12～-24 kV后,選用-18 kV為分離電壓以取得最優(yōu)的分離度和分析時間。

圖3 CTAB濃度對分離的影響(n=3)Fig. 3 Effects of the concentrations of CTAB on the separation (n=3) The concentration of phthalate was 10 mmol/L, and the other conditions were the same as those in Fig. 2 except for the concentrations of CTAB.

最后,為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度,對進(jìn)樣量進(jìn)行了優(yōu)化。在固定進(jìn)樣壓力為3 447.5 Pa的情況下,改變進(jìn)樣時間。隨著進(jìn)樣時間的增加,樣品峰面積逐漸增加,當(dāng)進(jìn)樣時間為18 s時,磷酸根與溶解在水中的二氧化碳形成的碳酸根分離度降低。因此進(jìn)樣條件選擇3 447.5 Pa×15 s較為合適。

通過方法優(yōu)化,最終采用的實驗條件為:采用熔融石英毛細(xì)管柱(75 μm i.d., 363 μm o.d.),總柱長為40 cm(有效長度為29.5 cm),柱溫為25 ℃,背景吸收電解質(zhì)溶液為含0.08 mmol/L CTAB的10 mmol/L鄰苯二甲酸(二乙醇胺調(diào)節(jié)pH至9.2),間接紫外吸收檢測,檢測波長為230 nm,進(jìn)樣條件為3 447.5 Pa×15 s,分離電壓為-18 kV。

2.2 方法驗證

依諾肝素鈉酸性較強,在溶液中帶有較多的負(fù)電荷,容易和涂覆CTAB動態(tài)涂層的毛細(xì)管壁作用,導(dǎo)致各個離子遷移變慢,因此首先通過加入標(biāo)準(zhǔn)品確定了樣品中各個陰離子的遷移峰(見圖4)。

表2 各離子的柱效(N)、檢出限、定量限、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)及線性范圍Table 2 Column efficiencies (N), LODs, LOQs, linear equations, correlation coefficients (R2) and linear ranges of the ions

y: peak area;x: concentration (mmol/L).

圖4 實際樣品中各陰離子遷移峰的確認(rèn)Fig. 4 Identification of the anions in the real sample All the separations were performed under the optimized conditions.

表1 遷移時間和峰面積的重復(fù)性驗證數(shù)據(jù)Table 1 Validation data of the migration time and peak area repeatabilities

2.3 依諾肝素鈉的穩(wěn)定性研究

利用發(fā)展的CE方法研究了儲存溫度對依諾肝素鈉穩(wěn)定性的影響。分別將固體依諾肝素鈉置于不同溫度下,并在不同時間點取出適量樣品,溶解后直接分析,每個樣品連續(xù)分析3次,并以陰離子濃度隨溫度和時間的變化作圖。未檢測出乙酸根、磷酸根和氟離子,氯離子的含量沒有變化,只有硫酸根離子含量有所增加。如圖5所示,在同一溫度下(即使低至30 ℃),隨著放置時間的延長,依諾肝素鈉中水解出的游離硫酸根也會越來越多,證明依諾肝素鈉在常溫放置時不穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高時,游離硫酸根水解速率變大,證明溫度升高會使依諾肝素鈉不穩(wěn)定性增加。

表3 各離子在實際樣品中的回收率(n=3)Table 3 Recoveries of the ions in real samples (n=3)

圖5 溫度對依諾肝素鈉穩(wěn)定性的影響(n=3)Fig. 5 Effects of the temperature on the stabilities of enoxaparin sodium (n=3) All the separations were performed under the optimized conditions.

3 總結(jié)

發(fā)展了采用鄰苯二甲酸作為背景吸收電解質(zhì)的CE-間接紫外吸收檢測方法,用于測定低分子量肝素中的游離無機陰離子。該方法比目前常用的以鉻酸根為背景吸收電解質(zhì)的毛細(xì)管電泳離子分析方法更靈敏,幾乎可以達(dá)到離子色譜的檢出限。與離子色譜法相比,該方法所需樣品量少、操作簡便、分析快速、成本更低。因此,該方法有望應(yīng)用于肝素類藥物的生產(chǎn)和保存過程中的質(zhì)量監(jiān)測。

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Determination of anions in low molecular weight heparin bycapillary electrophoresis with phthalateas the background electrolyte

ZHANG Mingyu, KANG Jingwu*
(StateKeyLaboratoryofBioorganicChemistry,ShanghaiInstituteofOrganicChemistry,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China)

The sulfate ester groups of low molecular weight heparins (LMWHs) are labile and easily hydrolyzed to produce free sulfate ions during the process of manufacture and storage. In addition, other anions such as chloride and acetylate are often introduced in the products. For monitoring the stability of the products, ion chromatography is the commonly used technique for determining the free anions in LMWHs. However, the column and the suppressor of ion chromatography are easily contaminated by LMWHs due to their relatively large molecules. Therefore, we developed a capillary electrophoresis (CE) method with indirect ultraviolet (UV) detection for determining the free anions in LMWHs, including sulfate, chloride, fluoride, phosphate and acetate. Unlike the commonly used anion separation CE method which uses chromate as the background absorption electrolyte, phthalate was used as the probe anion because its electrophoretic mobility matches better to all of the anions than chromate so that more narrow peaks could be obtained. Moreover, the molar absorptivity of phthalate at 230 nm (4 754 L/(mol5cm)) was higher than that of chromate at 254 nm (2 400 L/(mol5cm)). The combination of the narrow peak shape with the high molar absorptivity of the probe ion improves the detection sensitivity nearly to the lever of ion chromatography. Effects of various CE parameters on the separation of the anions were investigated and optimized. The method displayed excellent linearity in the concentration range from 0.002 to 1 mmol/L. The relative standard deviations (RSDs) for intraday (n=6) and interday (n=3) repeatabilities in terms of migration times and peak areas were all less than 3%. The limits of detection (S/N=3) and limits of quantitation (S/N=10) were determined as 0.4-0.8 μmol/L and 2-4 μmol/L for the above anions, respectively. The method was successfully applied for the stability monitoring of LMWHs.

capillary electrophoresis (CE); anions analysis; low molecular weight heparin (LMWHs); stability monitoring

10.3724/SP.J.1123.2016.08034

2016-08-29

國家自然科學(xué)基金項目(21375140,21175146).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21375140, 21175146).

O658

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