二補(bǔ)助育湯對(duì)胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響

江 媚 劉雁峰 王鐵楓 石 玥

(1 北京市鼓樓中醫(yī)院，北京，100009； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700)

?

二補(bǔ)助育湯對(duì)胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響

江 媚1劉雁峰2王鐵楓2石 玥2

(1 北京市鼓樓中醫(yī)院，北京，100009； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100700)

目的：探討補(bǔ)腎活血中藥方二補(bǔ)助育湯對(duì)胚泡著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。方法：制備小鼠胚泡著床障礙模型，研究其子宮內(nèi)膜SCFmRNA、HOXA-10 mRNA、LIF、ER、PR、整合素(αvβ3)表達(dá)的改變。結(jié)果：GnRHa+HMG+HCG超促排方案能降低子宮內(nèi)膜容受性，而二補(bǔ)助育湯能夠調(diào)控小鼠子宮內(nèi)膜調(diào)控鏈間的相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，從而改善子宮內(nèi)膜容受性。結(jié)論：二補(bǔ)助育湯改善子宮內(nèi)膜容受性的作用是肯定的，并且其作用途徑是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的。

二補(bǔ)助育湯；體外授精-胚胎移植；子宮內(nèi)膜容受性；干細(xì)胞因子；同源盒基因

子宮內(nèi)膜容受性是影響胚泡種植率的關(guān)鍵因素之一，所以它越來(lái)越受到重視。中醫(yī)藥調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是其作用機(jī)制尚不明確。胚胎著床是胚胎植入子宮內(nèi)膜的復(fù)雜生理過(guò)程，通過(guò)一系列過(guò)程完成胚胎與子宮內(nèi)膜的對(duì)話，此過(guò)程受諸多因素調(diào)節(jié)。我們?cè)谥嗅t(yī)理論基礎(chǔ)和臨床研究基礎(chǔ)上，采用GnRHa+HMG+HCG超促排方案制備動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組化法、Real-time PCR等方法和技術(shù)，利用所建立的動(dòng)物模型，研究二補(bǔ)助育湯調(diào)控子宮容受性的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)昆明雌性小鼠60只，8～12周齡，體重24～30 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 二補(bǔ)助育湯：補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、桑寄生、川斷、川牛膝、巴戟天、制首烏、郁金、雞血藤、葛根、升麻，顆粒制劑購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院門診藥房；達(dá)菲林(GnRHa)(規(guī)格0.1 mg)，IPSEN PHARMA BIOTECH制藥，進(jìn)口藥品H20080638，購(gòu)自東直門醫(yī)院藥房；補(bǔ)佳樂(lè)(戊酸雌二醇)(規(guī)格1 mg/片)DELPHARM Lille S.A.S.制藥，進(jìn)口藥品H20080108，購(gòu)自東直門醫(yī)院藥房；阿司匹林腸溶片(規(guī)格100 mg/片)拜耳制藥，進(jìn)口藥品H20090078，購(gòu)自東直門醫(yī)院門醫(yī)藥房。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為7組，分別為：空白組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組1(補(bǔ)佳樂(lè)組)、西藥組2(阿司匹林組)。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立 造模方法：模型組、西藥組1、西藥組2、中藥低、中、高劑量組，觀察小鼠陰道涂片，從動(dòng)情日開(kāi)始，于每日9時(shí)腹腔內(nèi)注射達(dá)菲林(GnRHa)40IU/100 g體重，連續(xù)9 d，至第9天聯(lián)合腹腔注射人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)1U/100 g體重促排卵，48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10IU/100 g體重，從而造成胚泡著床障礙模型。

1.3.3 給藥方法 本研究采用中藥顆粒劑二補(bǔ)助育湯干涉治療，同時(shí)以西藥補(bǔ)佳樂(lè)及阿司匹林作為對(duì)照。方法：于造模同時(shí)，空白組和模型組每日灌服0.9%氯化鈉溶液0.2 mL，中藥低、中、高劑量組每日分別按0.213 g/20 g體重、0.427 g/20 g體重、0.853 g/20 g體重的濃度灌服二補(bǔ)助育湯，西藥組1每日灌服補(bǔ)佳樂(lè)0.006 mg/20 g體重，西藥組2每日灌服阿司匹林0.225 mg/20 g體重，連續(xù)10 d。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第11天，斷頸處死小鼠，無(wú)菌條件下取子宮，將其中一角子宮縱向剖開(kāi)，迅速放入液氮中，然后于-80 ℃冰箱保存；另外一角子宮縱向剖開(kāi)，立即放在4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片備用。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 1)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)：采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)技術(shù)對(duì)比檢測(cè)不同劑量二補(bǔ)助育湯、補(bǔ)佳樂(lè)、阿司匹林作用下子宮內(nèi)膜干細(xì)胞因子(SCFmRNA)及同源盒基因(HOXA-10 mRNA)表達(dá)的改變。2)免疫組化：采用免疫組化法對(duì)比檢測(cè)不同劑量二補(bǔ)助育湯、補(bǔ)佳樂(lè)、阿司匹林作用下小鼠子宮內(nèi)膜白血病抑制因子(LIF)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、整合素(ανβ3)表達(dá)的改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，定義P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間比較采用方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，具有顯著性后，再采用LSD法或SNK法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠子宮內(nèi)膜SCFmRNA表達(dá)情況 空白組小鼠子宮內(nèi)膜SCFmRNA的表達(dá)明顯高于模型組；西藥各組及中藥各治療組小鼠子宮內(nèi)膜SCFmRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)；中藥低劑量組明顯低于中藥高、中劑量組子宮內(nèi)膜SCFmRNA的表達(dá)(P<0.05)，但中藥中劑量與高劑量組子宮內(nèi)膜SCFmRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；阿司匹林組子宮內(nèi)膜SCFmRNA表達(dá)明顯低于中藥各劑量組(P<0.05)，補(bǔ)佳樂(lè)組子宮內(nèi)膜SCFmRNA表達(dá)明顯低于中藥高、中劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)情況 空白組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA的表達(dá)明顯高于模型組；西藥各組及中藥中、低劑量組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)；阿司匹林組及補(bǔ)佳樂(lè)組小鼠子宮內(nèi)膜HOXA-10 mRNA表達(dá)明顯低于中藥中、低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠子宮內(nèi)膜SCFmRNA及HOXA-10 mRNA表達(dá)情況

注：與模型組比較*P<0.05，與空白組比較△P<0.05，與西藥1組比較▲P<0.05，與西藥2組比較□P<0.05。

2.3 各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)情況 空白組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3的表達(dá)明顯高于模型組；中藥各劑量組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)；補(bǔ)佳樂(lè)組及阿司匹林組子宮內(nèi)膜整合素ανβ3表達(dá)明顯低于中藥各劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)情況 空白組小鼠子宮內(nèi)膜LIF的表達(dá)明顯高于模型組；中藥中、低劑量組及補(bǔ)佳樂(lè)組小鼠子宮內(nèi)膜LIF表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)；補(bǔ)佳樂(lè)組子宮內(nèi)膜LIF的表達(dá)明顯低于中藥低劑量組(P<0.05)，阿司匹林組子宮內(nèi)膜LIF的表達(dá)明顯低于中藥中、低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素ανβ3及LIF表達(dá)情況

注：與模型組比較*P<0.05，與空白組比較△P<0.05，與西藥1組比較▲P<0.05，與西藥2組比較□P<0.05。

2.5 各組小鼠子宮內(nèi)膜ER表達(dá)情況 空白組小鼠子宮內(nèi)膜ER的表達(dá)明顯高于模型組；中藥中、低劑量組小鼠子宮內(nèi)膜ER表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)；阿司匹林組及補(bǔ)佳樂(lè)組子宮內(nèi)膜ER表達(dá)明顯低于中藥中、低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.6 各組小鼠子宮內(nèi)膜PR表達(dá)情況 空白組小鼠子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)明顯高于模型組；中藥各劑量組小鼠子宮內(nèi)膜PR表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠子宮內(nèi)膜ER及PR表達(dá)情況

注：與模型組比較*P<0.05，與空白組比較△P<0.05，與西藥1組比較▲P<0.05，與西藥2組比較□P<0.05。

3 討論

IVF-ET的最終妊娠率與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)，而子宮內(nèi)膜容受性受多個(gè)調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。其中，整合素ανβ3是重要的細(xì)胞黏附因子，其在胚胎植入過(guò)程中介導(dǎo)胚泡與子宮內(nèi)膜的對(duì)話，其可能參與胚泡植入的黏附過(guò)程，被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)記分子之一[1-2]；張煒等[3]證實(shí)了LIF在小鼠孕期的表達(dá)明顯高于非孕期(P<0.05)；潘一紅等[4]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)患者種植窗期的子宮內(nèi)膜、取卵日卵泡液中LIF表達(dá)均下降，可能與EMS導(dǎo)致不孕有相關(guān)性。這些都表明LIF與子宮內(nèi)膜容受性關(guān)系密切，并且是預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜容受性的金標(biāo)準(zhǔn)；ER、PR與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系基本明確，雌、孕激素可通過(guò)ER、PR對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行調(diào)節(jié)，在月經(jīng)周期的第19天，子宮內(nèi)膜腺上皮的ER、PR突然消失，并且其降調(diào)與胞飲突同時(shí)發(fā)生[5-7]。適當(dāng)濃度的孕酮水平和子宮內(nèi)膜PR的表達(dá)，是子宮內(nèi)膜蛻膜化的必備條件。

HOXA-10屬于腹部B組HOX基因，能參與女性生殖系統(tǒng)的發(fā)育以及正常子宮內(nèi)膜形態(tài)的建立，并對(duì)子宮內(nèi)膜的增殖與分化、子宮內(nèi)膜容受性的建立、胚胎植入的黏附、子宮內(nèi)膜的蛻膜化發(fā)揮至關(guān)重要的作用,所以HOXA-10是子宮內(nèi)膜容受性建立的必備因子[8-9]；SCF與IVF-ET的妊娠結(jié)局關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，SCF可能是中醫(yī)藥調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的新靶點(diǎn)。另外，雌、孕激素可能通過(guò)ER和PR來(lái)調(diào)節(jié)其下游的HOXA-l0的表達(dá)，而HOXA-l0又可能調(diào)節(jié)下游的COX2、EP3以及EP等PG信號(hào)系統(tǒng)使子宮內(nèi)膜進(jìn)入著床窗口期，從而利于胚泡的著床。

東直門醫(yī)院肖承悰教授經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)接受IVF-ET失敗的患者主要病機(jī)是腎氣不足，胞脈不暢，其獨(dú)創(chuàng)的二補(bǔ)助育湯能使子宮內(nèi)膜環(huán)境與卵泡發(fā)育同步，從而利于胚胎的著床及發(fā)育[13]。我們前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)其有顯著的臨床療效，現(xiàn)在通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究得出結(jié)論：補(bǔ)腎氣，通胞脈中藥能顯著提高子宮內(nèi)膜ER、PR、LIF、ανβ3的表達(dá)，此四者是子宮內(nèi)膜容受性建立的標(biāo)志物，提示二補(bǔ)助育湯改善子宮內(nèi)膜容受性的作用是肯定的；另外，其能提高子宮內(nèi)膜SCFmRNA及HOXA-10 mRNA的表達(dá)，提示二補(bǔ)助育湯可能是通過(guò)調(diào)控子宮內(nèi)膜SCF及HOXA-10的表達(dá)來(lái)改善子宮內(nèi)膜容受性，從而使卵泡發(fā)育與子宮內(nèi)膜同步，利于胚泡著床。綜上，我們推測(cè)這些調(diào)控因子相互作用形成調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而補(bǔ)腎氣，通胞脈中藥通過(guò)多方面、多通路作用于子宮內(nèi)膜，從而改善子宮內(nèi)膜微環(huán)境、調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，而其具體作用機(jī)制是多層次、多靶點(diǎn)的。

研究過(guò)程中我們采用了長(zhǎng)方案(GnRHa+HMG+HCG方案)制備動(dòng)物模型，但是未建立腎虛血瘀證動(dòng)物模型，下一步將深入對(duì)病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究；另外，該方案制備的動(dòng)物模型不能進(jìn)行胚泡著床計(jì)數(shù)，希望在下一步的研究中改進(jìn)。

[1]隋曉倩,于德欽,張冬梅.子宮內(nèi)膜容受性各相關(guān)標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].生殖與避孕,2015,35(3):185-190.

[2]王公道,韓旭,黃夢(mèng)琪,等.子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2015,34(2):332-336.

[3]張煒,周劍萍,劉銀坤,等.白血病抑制因子在小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2000,9(2):100-103.

[4]潘一紅,陶德友,牛志宏,等.子宮內(nèi)膜異位癥患者體外受精治療周期子宮內(nèi)膜及卵泡液中LIF表達(dá)與妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究[J].中國(guó)婦幼保健,2010,25(21):3025-3028.

[5]王公道,韓旭,黃夢(mèng)琪,等.子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2015,34(2):332-336.

[6]仉燕,郝天羽,劉海萍.種植窗期子宮內(nèi)膜厚度、類型和宮腔沖洗液中LIF水平與IVF-ET妊娠結(jié)局的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥,2014,54(24):4-6,9.

[7]林娜,馬艷萍,武澤,等.超排卵周期中高雌、孕激素水平對(duì)著床期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3、骨橋蛋白表達(dá)及子宮內(nèi)膜容受性的影響[J].中國(guó)婦幼保健,2015,30(9):1438-1442.

[8]李麗娜.HOXA 10在子宮內(nèi)膜異位癥不孕患者血清中的表達(dá)及意義[J].吉林醫(yī)學(xué),2014,35(1):15-17.

[9]符免艾,黃林,冼梅蘭,等.HOXA10啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)性研究[J].海南醫(yī)學(xué),2015,26(15):2221-2223.

[10]陳世榮,胡志華,馮智君.SCF/C-Kit在子宮腺肌瘤和子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜中的表達(dá)和意義[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版,2015,9(8):1331-1334.

[11]孫旸,梁婧,蘭曉霞,等.改善子宮內(nèi)膜發(fā)育不良的藥物治療[J].國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志,2015,34(3):251-254.

[12]陳婕,談?dòng)?干細(xì)胞因子在女性生殖系統(tǒng)疾病診療中的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,32(19):3254-3255.

[13]江媚,劉雁峰,呂艷瑩.淺談肖承悰教授中藥治療子宮內(nèi)膜容受性低之經(jīng)驗(yàn)[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2013,6(1):22-24.

(2015-12-21收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Erbu Zhuyu Decoction on Endometrium Receptivity of Rats Model with Embryo Implantation Dysfunction

Jiang Mei1, Liu Yanfeng2, Wang Tiefeng2, Shi Yue2

(1BeijingDrumTowerHospitalofTCM,Beijing100009,China; 2DongzhimenHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective:To investigate the effects of Erbuzhuyu Decoction on endometrium receptivity of rats model with embryo implantation dysfunction. Methods:Rats model with embryo implantation dysfunction was prepared for the study on expression changes of endometrial SCFmRNA, HOXA-10 mRNA, LIF, ER, PR and ανβ3. Results: GnRHa+, HMG+, HCG scheme may reduce the endometrium receptivity, and Erbu Zhuyu Decoction may regulate regulate the expression of relevant regulating factors in networks of rat endometrial microenvironment to improve endometrium receptivity. Conclusion: Erbu Zhuyu Decoction is bound to have the effect on endometrium receptivity and its activity pathway is multi-targeted and multi-linked.

Erbuzhuyu Decoction; IVF-ET; Endometrium receptivity; SCF; HOXA-10

2012國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81273789)——二補(bǔ)助育湯調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的效應(yīng)機(jī)制及其與SCFmRNA表達(dá)相關(guān)性研究；2014國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81473721)——基于NK/M-CSF/NO通路的二補(bǔ)助育湯調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性效應(yīng)機(jī)制相關(guān)性研究

江媚(1986.07—)女，博士，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療女性不孕癥、內(nèi)分泌疾病等，E-mail：18001337209@163.com

劉雁峰(1963.04—)，女，博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥治療女性不孕癥、內(nèi)分泌疾病等，E-mail：liuyaf8888@sina.com

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.043