自擬強心湯對心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的實驗研究

高占義 魏月娟 王彥敏 李二娟 張 姍 王慶海

(1 河北醫(yī)科大學附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學院心內(nèi)科，滄州，061000； 2 河北醫(yī)科大學附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學院超聲科，滄州，061000； 3 河北醫(yī)科大學附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學院科教科，滄州，061000)

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自擬強心湯對心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的實驗研究

高占義1魏月娟1王彥敏2李二娟1張 姍1王慶海3

(1 河北醫(yī)科大學附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學院心內(nèi)科，滄州，061000； 2 河北醫(yī)科大學附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學院超聲科，滄州，061000； 3 河北醫(yī)科大學附屬滄州中西醫(yī)結(jié)合臨床學院科教科，滄州，061000)

目的：探討自擬強心湯對心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的作用機制。方法：采用結(jié)扎左冠狀動脈法制備大鼠心梗后慢性心力衰竭動物模型；8周后，給予藥物灌胃治療；經(jīng)治療4周后，采用通過頸動脈插管測定大鼠血流動力學狀態(tài)，通過實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法和Western Bolt法檢測心肌鈣調(diào)控蛋白肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)、雷尼丁受體2(RYR2)mRNA水平及其蛋白表達量。結(jié)果：模型組大鼠的心功能顯著下降，主要表現(xiàn)在血流動力學參數(shù)改變，其中左室舒張末期壓(LVEDP)明顯升高(P<0.01)，左室收縮壓(LVSP)、左室上升最大速率(+LVdp/dtmax)及左室下降最大速率(-LVdp/dtmax)絕對值均降低(P<0.05)；心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA水平及其蛋白表達量均明顯下降(P<0.05)。給予自擬強心湯干預后，能夠有效的降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高LVSP、+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax水平(P<0.01)；能夠升高心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA及其蛋白表達量的水平(P<0.05)。結(jié)論：自擬強心湯能夠有效的改善心力衰竭大鼠的心功能，其機制可能與升高心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2的蛋白表達量，改善鈣循環(huán)有關。

自擬強心湯；慢性心力衰竭；心肌舒縮功能；血流動力學

自擬強心湯是由附子、白術(shù)、茯苓等溫陽、利水中藥組成的復方制劑，臨證治療心腎陽虛型心力衰竭病。RyR2是肌漿網(wǎng)上的鈣離子釋放通道，負責使Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)中釋放出來，促進Ca2+與肌鈣蛋白C結(jié)合，使肌動蛋白和肌球蛋白結(jié)合，形成橫橋，啟動心肌收縮[1]；SERCA2a為肌漿網(wǎng)鈣泵，負責將胞質(zhì)內(nèi)大部分Ca2+回攝入肌漿網(wǎng)內(nèi)并儲存，使Ca2+濃度迅速下降，并與肌鈣蛋白C解離，橫橋解除，使心肌細胞舒張[2]。二者分別負責Ca2+的釋放和攝取，進而保證正常的鈣循環(huán)，而鈣循環(huán)的紊亂可導致心肌舒縮功能的障礙。本實驗旨在研究自擬強心湯對心力衰竭大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RyR2含量的影響，進而探討自擬強心湯改善心梗后心力衰竭大鼠心肌舒縮功能的作用機制及干預環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動物 正常雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200±10)g，清潔級。

1.2 藥物與試劑 自擬強心湯由附子、白術(shù)、茯苓等11味中藥組成，均由滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供，并于此院中藥房完成制劑；纈沙坦膠囊(代文)由施維雅(天津)制藥有限公司生產(chǎn)；PCR試劑盒；cDNA合成試劑盒；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒；

1.3 儀器 PowerLab/4SP生物信號處理分析系統(tǒng)(澳大利亞ADI公司生產(chǎn))；MLT1050/D型高精度壓力換能器(澳大利亞ADI公司生產(chǎn))；Chart v 5.0記錄和分析軟件(澳大利亞ADI公司生產(chǎn))；ALC-V8S小動物呼吸機(奧爾科特科技生物有限公司生產(chǎn))。

1.4 分組與給藥 將清潔級SD大鼠常規(guī)飼料飼養(yǎng)，自由飲水。適應性飼養(yǎng)1周后，按照完全隨機分為假手術(shù)組10只，模型組、纈沙坦組、自擬強心湯組各18只。對除假手術(shù)組外的其他各組行左冠脈結(jié)扎術(shù)，10只假手術(shù)組動物除穿線不結(jié)扎外，其余操作同模型組。術(shù)后8周開始灌胃給藥，根據(jù)“實驗動物與人按體表面積等效量換算比率”折算[3]，模型組和對照組予同體積的蒸餾水灌胃；纈沙坦組予代文懸濁液灌胃，給藥劑量為8 mg/kg；自擬強心湯組予自擬強心湯水溶液灌胃，給藥劑量為0.9 g/kg。連續(xù)給藥4周，給藥1次/d。

1.5 大鼠模型制作 根據(jù)徐淑云[3]的《藥理實驗方法學》采用冠狀動脈結(jié)扎法(LAD)制備大鼠慢性心力衰竭模型，將雄性SD大鼠喂養(yǎng)一周，術(shù)前禁食12 h，用3%的戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，按照每公斤35 mg注射，麻醉好后將大鼠于手術(shù)臺上固定，于手術(shù)部位備皮，經(jīng)口氣管插管，連接呼吸機保證呼吸功能，在大鼠四肢皮下連接心電監(jiān)護。沿左側(cè)胸前第3、4肋間部位將皮膚切開并逐層分離，打開胸腔，沿肋間切開，向上推開胸腺，扯開胸膜及心包膜，找到左心耳，在左心耳下方2～3 mm處用5.0號絲線穿過左冠狀動脈前降支進行結(jié)扎。結(jié)扎后左室壁的顏色由紅變白，同時會出現(xiàn)心室壁運動減弱等表現(xiàn)。同時，心電監(jiān)護顯示II導聯(lián)R波振幅明顯升高，隨后出現(xiàn)的ST段亦明顯抬高，證實結(jié)扎手術(shù)成功。待穩(wěn)定后，關閉胸腔并逐層縫合。對照組大鼠穿線后不行結(jié)扎術(shù)，術(shù)后均用青霉素(40萬U/只)連續(xù)抗感染治療2 d[4]。

1.6 血流動力學的測定[5]在灌胃給藥4周后，采用生物信號處理分析系統(tǒng)測定大鼠血流動力學，術(shù)前予禁食不禁水，稱重后先用肝素鈉抗凝30 min，按照每公斤體重1200 μ/kg注射，之后用戊巴比妥鈉行腹腔麻醉。將麻醉好的大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，從右側(cè)頸部分離右側(cè)頸總動脈，固定切口，用一根線結(jié)扎動脈遠心端，在另一端插入心導管，通過生物信號處理和分析系統(tǒng)記錄血流動力學參數(shù)；首先，將心導管在頸總動脈中觀測心率，待心率穩(wěn)定后，將心導管推入左心室，待穩(wěn)定后，記錄大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室壓力上升和下降變化最大速度的參數(shù)值(±LVdp/dtmax)。

1.7 心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA表達及其蛋白相對表達量的測定 提取心肌組織，采用實時熒光定量FQ-PCR法檢測SERCA2a、RYR2 mRNA水平，采用Western blotting法測定鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2的蛋白相對表達量(SERCA2a/GAPDH、RyR2/GAPDH)。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學測定結(jié)果 與對照組相比，模型組大鼠LVEDP水平明顯升高，LVSP水平明顯降低(P<0.01)，+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax絕對值亦均降低(P<0.05)；提示心力衰竭時，大鼠心肌舒張和收縮功能減退。經(jīng)治療后，各用藥組與模型組相比，纈沙坦組能降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高+LVdp/dtmax及-LVdp/dtmax水平(P<0.01)；自擬強心湯組能降低心力衰竭大鼠LVEDP水平(P<0.05)，升高LVSP、+LVdp/dtmax水平(P<0.01)，亦能升高大鼠-LVdp/dtmax水平(P<0.05)。各組間心率差異無統(tǒng)計學意義。見表1、2。

2.2 各組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的測定 采用FQ-PCR法檢測心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的相對表達量(SERCA2a/GAPDH、RyR2/GAPDH)。結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2 mRNA的表達量均下降(P<0.01)，提示心力衰竭時心肌舒縮功能下降。經(jīng)治療后，與模型組比較，僅有自擬強心湯組心肌鈣調(diào)蛋白SERCA2a和RYR2 mRNA水平均升高(P<0.05)；而纈沙坦組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 各組大鼠心率及左室內(nèi)壓測定結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表2 各組大鼠+LVdp/dtmax測定結(jié)果

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表3 各組大鼠SERCA2a、RYR2 mRNA的測定結(jié)果

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

表4 各組大鼠SERCA2a、RYR2蛋白相對表達量的測定結(jié)果

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，◆P<0.05，◆◆P<0.01。

2.3 各組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達量的測定 與空白對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達量均下降(P<0.01)，提示心力衰竭時心肌舒縮功能下降。經(jīng)治療后，與模型組比較，僅有自擬強心湯組心肌鈣調(diào)蛋白SERCA2a、RYR2蛋白相對表達量水平升高(P<0.05)；而纈沙坦組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

3 討論

心力衰竭是最常見的心血管疾病之一，心功能的異常體現(xiàn)在舒張與收縮功能2個方面，在導致心肌舒縮功能異常的眾多因素中，心肌興奮收縮耦聯(lián)障礙占有重要地位，其中，鈣循環(huán)的異常是導致興奮收縮耦聯(lián)障礙發(fā)生的重要原因之一[6]。研究顯示，心肌細胞的舒張功能與胞質(zhì)內(nèi)Ca2+清除相關，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+消除主要是經(jīng)SERCA2a再攝取[7]，心肌細胞收縮性的強弱是由胞質(zhì)內(nèi)LTCC、RyR2的狀態(tài)以及肌漿網(wǎng)鈣含量等因素決定[8]?？傊{網(wǎng)中鈣離子循環(huán)是心肌收縮和舒張的重要環(huán)節(jié)，而鈣循環(huán)包括鈣回攝、鈣釋放及鈣儲存3個過程，任一過程的異常都將導致心肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的破壞，這種破壞是心力衰竭心肌細胞舒縮功能下降的主要原因[9]。

目前強心藥物的主要作用機制是通過增加Ca2+的濃度來增加心肌收縮力。而研究表明長期使用會產(chǎn)生鈣超載現(xiàn)象，早期心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，使心肌收縮力的加強，但是Ca2+的持續(xù)增高使Ca2+與肌鈣蛋白解離過程發(fā)生障礙，造成心肌舒張功能的異常[10]。再者，Ca2+急驟增多能夠誘發(fā)持久而嚴重的肌絲攣縮，形成收縮帶甚至發(fā)生肌絲斷裂；在其過程中會消耗大量等能量物質(zhì)，最終導致細肌絲橫橋擺動無力，進而阻礙心肌收縮[11]。此外，鈣循環(huán)的異還可激活由Ca2+為上游的信號分子，如蛋白激酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶等，而這些信號分子能誘導心肌細胞肥厚和細胞死亡，最終導致心肌重構(gòu)，此為發(fā)生心力衰竭的最基本機制[12]。新型的強心藥即鈣離子敏感藥(如左西孟旦)，是通過增加肌鈣蛋白對Ca2+的敏感性而增加心肌收縮力。其過程不增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，所以不會引起Ca2+超載所致的心律失常的問題，也不需要增強Ca2+轉(zhuǎn)運時的能量消耗，不良反應較少[13]。目前，許多臨床試驗已證實了左西孟旦的安全性和有效性，短期使用可以明顯改善心力衰竭癥狀，但是對長期生存率的影響還有待進一步研究，而且亦沒有提示改善心室重構(gòu)的問題。因此，本實驗從中醫(yī)藥角度探討中醫(yī)中藥改善鈣循環(huán)，進而改善心肌舒縮功能的作用機制。

本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠心肌鈣調(diào)控蛋SERCA2a的相對表達量下降，提示心力衰竭時大鼠鈣回攝能力減弱，影響了胞質(zhì)內(nèi)的鈣清除，使舒張功能受損；RyR2 mRNA及其蛋白表達亦下降，影響了鈣釋放，導致鈣儲存量減少，影響了心肌細胞的收縮，2者共同導致心肌興奮收縮耦聯(lián)過程障礙，導致心肌舒縮功能的下降。研究中血流動力學參數(shù)也發(fā)生改變，心力衰竭大鼠LVEDP水平上升、-dp/dt max水平的下降，可反映心肌舒張功能的減退；LVSP、+LVdp/dtmax的下降可反映心肌收縮功能的障礙；與前者相符。從中醫(yī)角度說明，在心力衰竭時，因心氣推動無力，導致心輸出量、心肌收縮力和心室順應性明顯下降，進而舒縮功能減退。經(jīng)治療后，采用溫補心腎法可以增加SERCA2a、RyR2 mRNA及其蛋白表達量，增加鈣回攝、鈣釋放能力，提高心肌細胞的收縮和舒張速率，改善鈣循環(huán)，進而改善心肌舒縮功能。血流動力學測定結(jié)果亦顯示，采用溫補心腎法亦能降低LVEDP水平，升高-LVdp/dtmax、LVSP、+LVdp/dtmax水平，進而改善心肌舒縮功能。

近年來，在治療CHF的治法中，90%左右采用益氣溫陽、活血利水之法，臨床效果顯著[14-15]。自擬強心湯是通過采用溫補心腎，溫陽利水的方法改善心肌SERCA2a、RyR2的表達，進而改善鈣循環(huán)。其治療方式不是單純以增加心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度為目的，而是通過改善心肌細胞的舒張和收縮速率，進而改善心功能，為臨床治療提供新的思路。

[1]楊泉,蓋魯粵,何昆侖.Ryanodine受體與心力衰竭[J].現(xiàn)代診斷與治療,2008,19(1):41-43,50.

[2]Bers DM.Cardiac excitation-contraction coupling[J].Nature,2002,415(6868):198-205.

[3]徐淑云.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:276.

[4]喻斌,周靜,呂高紅,等.心梗所致心衰大鼠模型復制的改良初探及評價[J].中國藥理學通報,2011,27(4):577-580.

[5]呂汝西,黃家卓,劉強.冠狀動脈結(jié)扎制備大鼠心肌梗死模型及血流動力學檢測[J].廣東醫(yī)學院學報,2011,29(1):5-8,12.

[6]Thomas R.Shannon,Wilbur Y.W.Lew.Diastolic Release of Calcium From the Sarcoplasmic Reticulum[J].Journal of the American College of Cardiology，2009,53(21):2006-2008.

[7]Periasamy M，Kalyanasundaram A.SERCA pump isoforms：their role in calcium transport and disease[J].Muscle Nerve，2007,35(4):430-442.

[8]Yano M，Ikeda Y，Matsuzaki M.Altered intracellular Ca2+handling in heart failure[J].J Clin Invest，2005,115(3):556-564.

[9]胡淑婷.慢性心衰大鼠心肌細胞鈣調(diào)控異常及藥物干預的研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學,2011.

[10]朱愨,黃晶.舒張性心力衰竭的發(fā)病機理與治療進展[J].心血管病學進展,2006,27(2):170-172.

[11]王娜,張建平,徐華洲,等.補中益氣湯對阿霉素誘導心衰大鼠的保護作用[J].中國中藥雜志,2011,36(4):508-510.

[12]史君,王靜,王星,等.腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6在高血壓心肌肥厚大鼠實驗中的意義[J].中國醫(yī)藥導報,2012,9(6):23-25.

[13]杜賀,史承勇,陳少萍.左西孟旦的研究新進展[J].中國循環(huán)雜志,2014,29(7):555-557.

[14]瑪依努爾.斯買拉洪,遲新棟,等.益氣溫陽活血利水方治療慢性充血性心力衰竭的療效及對神經(jīng)內(nèi)分泌、炎性因子的影響研究[J].陜西中醫(yī),2015,36(7):804-805.

[15]沈淑靜,冼紹祥,黃衍壽,等.益氣溫陽活血利水中藥對心力衰竭兔的血流動力學影響和配伍研究[J].中國實驗方劑學雜志,2013(5):195-199.

(2016-01-14收稿 責任編輯：張文婷)

Study on myocardial systolic and diastolic function of Qiangxin Tang on heart failure after myocardial infarction in rats

Gao Zhanyi1，Wei Yuejuan1,Wang Yanmin2,Li Erjuan1,Zhang Shan1,Wang Qinghai3

(1DepartmentofCardiology,CangzhouintegratedtraditionalChineseandWesternMedicineClinicalCollege,HebeiMedicalUniversity,Cangzhou061000,China; 2Departmentofultrasound,CangzhouintegratedtraditionalChinesemedicineandWesternmedicine,HebeiMedicalUniversity,Cangzhou061000,China; 3HebeiMedicalUniversityaffiliatedCangzhouintegratedtraditionalChineseandWesternMedicineCollegeofscienceandeducation,Cangzhou061000,China)

Objective:To clarify myocardial systolic and diastolic function and possible mechanism of Qiangxin Tang on the model of heart failure.Methods:Model of heart failure after myocardial infarction was prepared by left coronary artery ligation.After 8 weeks，take a lavage treatment every day；After 4 weeks of continuous administration，cardiac hemodynamics parameters were recorded and SERCA2a，RYR2 mRNA level were detected by PCR(FQ-PCR)and SERCA2a，RYR2 protein expression were detected by Western bolt.Results:compared with control group，cardiac function of model group is lower：hemodynamic parameters LVEDP is increased obviously(P<0.01),LVSP，+LVdp/dtmax and-LVdp/dtmax absolute values were all lower(P<0.05)，and the calmodulin SERCA2a and RYR2 mRNA and protein relative expression of model group rats was decreased(P<0.05).Compared with model group，Qiangxin Tang group could reduce LVEDP levels(P<0.05),increase LVSP，+LVdp/dtmax and-LVdp/dtmax levels(P<0.01),and the calmodulin SERCA2a and RYR2 mRNA and protein relative expression of Qiangxin Tang were higher.Conclusion:Qiangxin Tang can effectively improves cardiac function in heart failure rats; Its mechanism is related with improving calmodulin SERCA2a、RYR2 and improving calcium cycle.

Qiangxin Tang；Chronic Heart Failure；Myocardial systolic and diastolic function；hemodynamic

河北省中醫(yī)藥管理局“自擬強心湯調(diào)控CaN-NFAT信號通路干預慢性心力衰竭的臨床研究”(編號：2015287)

高占義(1977.06—)，男，學士，主治醫(yī)師，研究方向：主要從事心血管疾病的臨床、科研、教學及介入治療工作，Tel：(0317)2179083，E-mail:gaozhanyi1977@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.042