腎虛血瘀證樹鼩動物模型構建初探

郭爾楚 黃金蘭 陳 奔 郭茜茜 馮曉桃 鐘振國

(1 廣西中醫(yī)藥大學新藥研究開發(fā)中心，南寧，530001； 2 徐州醫(yī)科大學藥學院，徐州，221004； 3 廣西中醫(yī)藥大學廣西中醫(yī)藥科學實驗中心，南寧，530001)

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腎虛血瘀證樹鼩動物模型構建初探

郭爾楚1黃金蘭2陳 奔1郭茜茜1馮曉桃3鐘振國1

(1 廣西中醫(yī)藥大學新藥研究開發(fā)中心，南寧，530001； 2 徐州醫(yī)科大學藥學院，徐州，221004； 3 廣西中醫(yī)藥大學廣西中醫(yī)藥科學實驗中心，南寧，530001)

目的：探索腎虛血瘀證樹鼩動物模型的制做方法。方法：將樹鼩隨機分為對照組、模型1組(腹腔注射氫化可的松結合腎上腺素)和模型2組(腹腔注射氫化可的松結合角叉菜膠)，5只/組，通過觀察樹鼩表征、臟器指數、血液流變學、下丘腦-垂體-靶腺軸(甲狀腺軸、性腺軸)激素水平的變化情況評判腎虛血瘀證模型是否建立。結果：造模后動物均出現(xiàn)“耗竭”現(xiàn)象，腎、前列腺、脾、睪丸不同程度腫大，模型2組甲狀腺萎縮；模型1組血清中雌二醇(E2)和睪酮(T)水平及模型2組中甲狀腺激素(FT3、FT4)、E2水平顯著下降；血液流變學結果顯示模型2組血液黏度和紅細胞壓積增高，而模型1組無顯著變化。結論：腹腔注射氫化可的松與腎上腺素的方法能夠較好地模擬腎虛血瘀證樹鼩動物模型。

腎虛血瘀；樹鼩；動物模型

樹鼩(學名：Tupaia belangeri，tree shrew)，樹鼩科樹鼩屬的動物，分布在東南亞各國。樹鼩是一種新型實驗動物，由于其解剖特征近似于人類，已成功建立了多種人類疾病的動物模型，并在病毒學、神經生物學、生殖生物學和社會心理學等方面有相當廣泛的應用和研究[1-2]。腎虛血瘀是目前中醫(yī)較為常見的證候，腎虛導致血瘀，血瘀所致腎虛，即腎虛與血瘀并見。研究發(fā)現(xiàn)，腎虛血瘀與糖尿病[3]、冠心病[4]、高血壓[5]、慢性炎性反應[6]等的發(fā)病有明顯關系，是各種慢性疾病某一特定階段的共同病理變化和致病原因。目前，對于腎虛血瘀證動物模型的較多是由多個中醫(yī)證候或病證結合引起的研究。因此，建立穩(wěn)定、重復性強的腎虛血瘀證動物模型，能夠為相關疾病治療藥物的研發(fā)提供強有力載體。研究表明，樹鼩因其許多分子與細胞結構近似人類，具有與人相似的腦神經和視覺神經，目前已成功用于多種人類病毒感染的動物模型的建立，而利用樹鼩構建腎虛血瘀證動物模型尚未有探索，我們以樹鼩為研究對象，初步探索建立腎虛血瘀證動物模型的方法，為各種慢性疾病的科研研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10～12個月齡中緬樹鼩滇西亞種，雄性，體重120～140 g，由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供(動物許可證號：SCXK(滇)K2013-0002)。1.2 主要試劑與儀器 鹽酸腎上腺素注射液(遠大醫(yī)藥(中國)有限公司，批號：131204)；氫化可的松注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，批號：1312071)；角叉菜膠(Sigma公司，批號：CAS9000-07-1)；水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號：20130513)?；瘜W發(fā)光儀(UniCel DxI，型號800)；血流變快測儀(重慶維多科技有限公司，F(xiàn)ASCO系列-2050A)。

1.3 分組與造模 將樹鼩隨機分對照組、腎虛血瘀證樹鼩動物模型1組(以下簡稱模型1組)和腎虛血瘀證樹鼩動物模型2組(以下簡稱模型2組)，5只/組。模型1、2組在第1～3天每天腹腔注射氫化可的松(1 mg/100 g)；第4～5天繼續(xù)腹腔注射氫化可的松(1.5 mg/100 g)；第6～8天，模型1組每天腹腔注射腎上腺素(1 mg/100 g)，模型2組每天腹腔注射角叉菜膠(7.5 mg/100 g)，對照組每天注射等量的生理鹽水。

1.4 觀察指標

1.4.1 樹鼩表征變化 包括樹鼩行為、體征觀察及體重變化。

1.4.2 樹鼩血液流變學變化 第7天，腹主動脈抽血，血液流變儀檢測各組動物全血黏度、還原黏度、血漿黏度、紅細胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應力以及纖維蛋白原的變化。

1.4.3 樹鼩下丘腦-垂體-靶腺軸(甲狀腺軸、性腺軸)變化 血液流變學檢測后，將血液以3 000 r/min速度離心5 min，取上清液，化學發(fā)光法測定檢測各組動物血液三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、雌二醇(E2)、睪酮(T)的含量。

1.4.4 樹鼩臟器指數比較 動物稱重、取血后，稱取各組動物腎、前列腺、脾、甲狀腺、睪丸重量，按公式[臟器指數=臟器濕重(g)/樹鼩體重(100 g)]計算其相關指數。

2 結果

2.1 樹鼩行為、表征觀察及體重變化 對照組樹鼩反應靈敏、喜動、動作靈活、皮毛光澤，大便正常。模型1組和模型2組樹鼩均出現(xiàn)明顯的精神萎靡、倦怠、身體蜷縮、豎毛、少動、喜臥、皮毛蓬亂無光澤，大便干結癥狀。體重增加，模型1組樹鼩體重變化明顯高于對照組[(123.25±4.99)g，(109.60±6.58)g，P=0.024]，模型2組樹鼩體重變化與對照組相似[(111.20±10.20)g，(109.60±6.58)g，P=0.751]。

2.2 血液流變學變化

2.2.1 不同切變率狀態(tài)下血液黏度的比較 與對照組比較，模型1組和模型2組樹鼩還原黏度和全血黏度在不同切變率狀態(tài)下均有不同程度升高，其中模型1組樹鼩還原高切(100/s)黏度和全血黏度(100/s、40/s、10/s)顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2.2 血漿黏度、紅細胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應力級纖維蛋白原的比較 由表2可知，與對照組比較，模型1組和模型2組的血漿黏度、紅細胞壓積、卡松黏度、卡松屈服應力及纖維蛋白原均有不同程度升高，其中模型1組的各項指標差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同切變率狀態(tài)下還原黏度、全血黏度比較

注:與對照組比較*P<0.05。

表2 各組血漿黏度、紅細胞壓積、還原黏度、卡松黏度、卡松屈服應力及纖維蛋白原的比較

注:與對照組比較*P<0.05。

表3 各組樹鼩臟器指數的比較

注:與對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2.3 臟器指數比較 與對照組比較，模型1組和模型2組的腎指數、脾指數、前列腺指數和睪丸指數數值均升高，其中模型2組的腎指數、模型1組與模型2組的前列腺指數差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，而模型1組和模型2組的甲狀腺指數數值偏低，數模型2組降低顯著(P<0.05)。

2.2.4 血清中FT3、FT4、E2、T的比較 與對照組比較，模型1組的FT3、E2和T及模型2組的FT3、FT4、E2均有所下降，其中模型1組的E2、T水平，模型2組中的FT3、FT4、E2的變化差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 各組樹鼩血清中FT3、FT4、E2、T的變化

注:與對照組比較*P<0.05。

3 討論

腎上腺皮質激素法是最早用于制造腎虛動物模型的方法[7]，通過大劑量外源性皮質激素早期能使機體呈煩躁等腎陰虛表現(xiàn)，但由于腎上腺皮質激素可使促腎上腺皮質激素釋放受抑制，而使類固醇激素分泌減少，所以出現(xiàn)一系列如體溫下降、活動減少、反應遲鈍、弓背蜷縮、畏寒、體毛稀疏無光澤等一系列“耗竭”現(xiàn)象，即出現(xiàn)“陰損及陽”的轉變。根據《中醫(yī)虛證辨證參考標準》[8]中對虛證動物模型的診斷標準，我們觀察到模型1組和模型2組樹鼩精神萎靡、倦怠、身體蜷縮、豎毛、少動、喜臥、皮毛蓬亂無光澤，大便干結癥狀及體重增加癥狀，因此，本實驗由氫化可的松誘導的腎虛證模型是符合要求的。

中醫(yī)認為腎為先天之本，腎虛與下丘腦-垂體-靶腺軸(腎上腺軸、甲狀腺軸、性腺軸)的紊亂[9]、免疫功能下降有關。藥物干預后，我們比較了對照組、模型組樹鼩腎臟、脾、甲狀腺、前列腺和睪丸的重量，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型1組和模型2組的腎指數、脾指數、前列腺指數和睪丸指數數值均有不同程度的升高，說明模型動物的腎臟、脾、甲狀腺、前列腺和睪丸均有不同程度的腫大，而模型1組和模型2組的甲狀腺指數數值偏低，數模型2組降低顯著(P<0.05)，提示模型2組的甲狀腺有一定的萎縮現(xiàn)象。針對激素水平的變化，我們主要對下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸進行相關生化指標的測定。數據顯示，與對照組比較，模型1組的FT3水平有下降趨勢，模型2組FT3和FT4的變化下降明顯(P<0.05)。模型1組雌二醇和睪酮水平均明顯下降(P<0.05)，模型2組中的雌二醇水平均明顯下降(P<0.05)，但睪酮水平差異無統(tǒng)計學意義。因此，從甲狀腺功能和生殖系統(tǒng)功能指標上評判，模型1組和模型2組在一定程度上均符合腎虛模型的要求。

李積敏在《腎虛血瘀論》認為久病則虛，虛則氣血運行不暢，氣血運行不暢則易產生瘀滯。瘀滯形成，則阻礙機體氣血生新不順，則機體虛弱更甚。可見腎虛與血瘀是相輔相成的。本研究過量使用氫化可的松制成腎陽虛模型的基礎上分別加用腎上腺素[10]和角叉菜膠[11]建立血瘀模型，血液流變學考證血瘀模型的建立與否。在血液流變學檢測中，全血黏度是反映血液流變學特性的直觀指標，而影響全血黏度的因素有紅細胞壓積、血漿黏度、紅細胞聚集性、紅細胞變形性、血小板的凝聚性和黏附性等。實驗結果顯示，除了中、低切還原黏度外，模型1組樹鼩的血液流變學指標與對照組比較，均明顯升高(P<0.05)，提示模型1組樹鼩的血液黏度和紅細胞壓積增高，變形性降低等血流緩慢、循環(huán)障礙特點，血液呈現(xiàn)濃、黏、聚、凝的狀態(tài)，符合中醫(yī)血瘀證血液流變學之共性，而模型2組各項血液流變學指標與對照組比較均無差異。由此可知，模型1組造模方法能較好初步建立血瘀證樹鼩模型。

綜上實驗結果，模型1組表現(xiàn)出良好的腎虛和血瘀征象，證實腹腔注射氫化可的松結合皮下注射腎上腺素的方法可較好地模擬腎虛血瘀證樹鼩動物模型。

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(2016-10-17收稿 責任編輯：洪志強)

Study on Tree Shrews Model of Kidney Deficiency and Blood Stasis

Guo Erchu1, Huang Jinlan2, Chen Ben1, Guo Xixi1, Feng Xiaotiao3, Zhong Zhenguo1

(1CenterofResearch&DevelopmentofNewDrugs,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China; 2DepartmentofPharmacology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China; 3Scienceexperimentcenter,GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530001,China)

Objective:To explore the way to establish the kidney and blood stasis model in tree shrew. Methods: Tree shrews were randomly divided into 3 groups: normal group, model group 1 (injection of Hydrocortisone and Adrenaline) and model group 2 (injection of Hydrocortisone and Carrageenan). The kidney deficiency and blood stasis model was evaluated by observation of representation of tree shrews, detecting visceral index, hemorheology parameters and the level of hypothalamus-pituitary-target gland axis (thyroid axis, gonad axis). Results: The animal been treated all appeared “exhausted” phenomenon, the kidney, prostate, spleen, testis of the model groups were swelling, but the thyroid in model group 2 was atrophied. The levels of E2 and T in model group 1, levels of FT3、FT4 and E2 in model group 2 declined remarkably. The results of hemorheology showed that the blood viscosity and hematocrit increased in model group 1. Conclusion: The tree shrews model of kidney deficiency and blood stagnation can be established by injection of hydrocortisone and adrenaline.

Kidney deficiency and blood stasis; Tree shrew; Model

廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(編號：桂科攻1347003-1)

郭爾楚，男，助教，碩士學位，研究方向：新藥研究與開發(fā)，E-mail：1050457662@qq.com

鐘振國，男，醫(yī)學博士，研究方向：新藥研究與開發(fā)，單位：廣西中醫(yī)藥大學新藥研究開發(fā)中心，地址：廣西南寧市明秀東路179號廣西中醫(yī)藥大學，郵編：530001，E-mail：gxtcmuzzg@163.com

R228

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.003