基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信號通路與糖尿病足免疫表達關(guān)系的研究

吳標良，唐乾利，覃曉潔，馮 烈，王民登，何明杰，呂 震

(1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院外科，廣西百色 533000；3.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西百色 533000；4.暨南大學第一臨床醫(yī)學院內(nèi)分泌科，廣州 510632；5.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院外科,南寧 530023)

基于MEBT/MEBO的ERK1/2和p38信號通路與糖尿病足免疫表達關(guān)系的研究

目的 觀察燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù)[濕潤暴露療法(MEBT)/濕潤燒傷膏(MEBO)]對糖尿病足部創(chuàng)面組織細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2 和p38信號通路分子及免疫表達的調(diào)控作用及關(guān)系，探討MEBT/MEBO對糖尿病足潰瘍的修復機制。方法 糖尿病足患者40例予MEBT/MEBO干預治療，留取治療前后創(chuàng)面組織行免疫組化檢測ERK1/2和p38信號通路關(guān)鍵分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK6)、原癌基因(c-myc)、Akt、活化復制因子2抗體(ATF2)及免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c表達情況，并觀察二者間關(guān)系。結(jié)果 經(jīng)MEBT/MEBO治療后，39例患者足部創(chuàng)面面積有不同程度縮小，僅1例患者無明顯變化，顯效14例(35.00%)，有效25例(62.50%)，無效1例(2.50%)。治療前后信號通路分子全陽性表達、免疫陽性表達(任一指標)及免疫陽性表達(具體指標)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在創(chuàng)面信號通路分子表達陽性率升高的同時，免疫因子陽性表達率亦升高。治療前創(chuàng)面組織可見免疫因子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c呈廣泛、彌漫分布。治療前創(chuàng)面組織可見信號分子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織信號通路分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2呈廣泛、彌漫分布。結(jié)論MEBT/MEBO可能促進了糖尿病足創(chuàng)面ERK1/2 和p38信號通路分子及免疫表達，ERK1/2和p38信號通路及其交互作用可能通過增加創(chuàng)面組織免疫表達而促進了糖尿病足創(chuàng)面的愈合。

糖尿病足；燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù)；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；p38；免疫

糖尿病足已成為糖尿病的主要嚴重并發(fā)癥之一，臨床上尚無特效治療方法，最終有較高比例患者需要截肢[1-2]。目前已有多項研究表明，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2和p38信號通路及其交互作用在促進傷口愈合中起著非常關(guān)鍵的作用[3-4]，基于免疫機制推測，在潰瘍創(chuàng)面形成及愈合過程中，免疫可能發(fā)揮重要的防御、保護作用。本研究擬通過觀察濕潤暴露療法(MEBT)/濕潤燒傷膏(MEBO)對糖尿病足創(chuàng)面ERK1/2和p38信號通路分子及免疫因子的表達調(diào)控與二者間的關(guān)系，從而探討MEBT/MEBO促進糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的修復機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2014年6月于右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院和廣西中醫(yī)藥大學一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科確診2型糖尿病(T2DM)并糖尿病足患者40例，男24例，女16例，年齡33～72歲，平均(52.83±10.95)歲。符合WHO 1999 T2DM及糖尿病足診斷標準[5]。臨床上具有嚴重心臟、肝臟、腎臟疾病患者或急性腦血管意外、創(chuàng)傷、免疫系統(tǒng)疾病及腫瘤、精神病史及近1年內(nèi)有服用類固醇激素、抗生素等用藥史的患者予以排除，治療過程中死亡患者亦予不能入選。研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準且經(jīng)患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本取材 采用常規(guī)方法清理創(chuàng)面，然后在治療前取創(chuàng)面肌肉肉芽組織。按MEBT/MEBO操作規(guī)程處理創(chuàng)面：依據(jù)創(chuàng)面大小取適量MEBO(汕頭經(jīng)濟特區(qū)美寶制藥廠生產(chǎn)，國藥準字Z20000004)，作成MEBO紗條，均勻覆蓋在潰瘍面上，2次/天換藥，一直到潰瘍創(chuàng)面愈合；若創(chuàng)面有較多壞死組織時，先清理，經(jīng)10～14 d治療后再次取創(chuàng)面組織。同時予常規(guī)血糖、血壓和血脂控制，并酌情予以改善循環(huán)、抗感染等處理。

1.2.2 療效判定

1.2.2.1 創(chuàng)面面積變化評估 痊愈：創(chuàng)面完全愈合，臨床癥狀消失；顯效：創(chuàng)面縮小大于或等于75%，臨床癥狀消失；有效：創(chuàng)面縮小大于或等于25%，臨床癥狀改善；無效：創(chuàng)面縮小不足25%，臨床癥狀無改善。

1.2.2.2 療效指數(shù)評估 參考《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002年)相關(guān)標準進行綜合評價。見表1。

1.2.3 生化項目檢測 清晨空腹采血3～5 mL，靜置30 min，然后進行離心(3 000 r/min)5 min，取血清檢測糖化血紅蛋白(HbA1c，高效液相色譜分析法)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，IFCC推薦修正法)、三酰甘油(TG，GPO-PAP法)等生化指標，由專人使用美國貝克曼COULTER LX20全自動生化分析系統(tǒng)測定。

1.2.4 免疫組化檢測 創(chuàng)面組織標本行免疫組化染色，采用多聚合物酶EliVision法測定通路信號分子ERK1/2、p38、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK6)及其底物分子原癌基因(c-myc)、Akt、活化復制因子2抗體(ATF2)和免疫指標IgA、IgM、IgG、C3c、C4c的表達情況，先取材，然后行石蠟切片，并按試劑盒(immunoway試劑盒)說明書免疫組化操作。細胞膜、細胞質(zhì)、細胞間質(zhì)等部位出現(xiàn)褐色沉著為免疫組化陽性反應，可為連續(xù)線狀、不連續(xù)點狀彌漫分布。

2 結(jié) 果

2.1 生化指標及臨床療效觀察 40例患者糖尿病病程(8.03±3.68)年，收縮壓(135.38±12.45)mmHg，舒張壓(78.15±8.42)mmHg，HbA1c(8.05±2.49)%，TC(5.29±2.49)mmol/L，LDL(2.60±1.19)mmol/L，TG(2.23±2.15)mmol/L，無因各種原因而中途退出研究患者。經(jīng)MEBT/MEBO治療后，39例患者足部創(chuàng)面面積有不同程度縮小，僅1例患者無明顯變化，顯效14例(35.00%)，有效25例(62.50%)，無效1例(2.50%)。

表1 臨床創(chuàng)面療效評價表

2.2 治療前后ERK1/2和p38信號通路分子陽性表達及免疫表達變化 治療前后信號通路分子全陽性表達、免疫陽性表達(任一指標)及免疫陽性表達(具體指標)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在創(chuàng)面信號通路分子表達陽性率升高的同時，免疫因子陽性表達率亦升高。見表2。

A:治療前；B：治療后IgA(+);C:治療后IgM(+);D：治療后IgG(+)；E:治療后C3c(+);F：治療后C4c(+)。

圖1 治療前后免疫因子的表達

A:治療前；B：治療后ERK1/2(+);C:治療后p38(+);D：治療后MAPKK6(+)；E:治療后c-myc(+);F：治療后Akt(+);G:治療后ATF2(+)。

圖2 治療前后信號分子的表達

2.3 免疫組化檢測 治療前創(chuàng)面組織可見免疫因子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c呈廣泛、彌漫分布。治療前創(chuàng)面組織可見信號分子極少量分布，治療后創(chuàng)面組織信號通路分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2呈廣泛、彌漫分布。見圖1、2。

表2 創(chuàng)面信號通路分子與免疫表達變化

3 討 論

由于其復雜的發(fā)病機制，糖尿病足是一種目前機制尚未完全闡明的糖尿病嚴重并發(fā)癥，同時臨床上也還沒有確切、有效的治療手段[6-8]。目前臨床上對糖尿病足的治療多采用在代謝控制的基礎(chǔ)上予改善循環(huán)、創(chuàng)面局部換藥等手段進行綜合的治療，其中創(chuàng)面處理是糖尿病足治療的重要手段。在臨床中，可有多種方法對糖尿病足創(chuàng)面進行處理，但長期臨床實踐表明，傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥療法通過去腐生肌等作用機制，在促進潰瘍創(chuàng)面愈合方面有其較為突出的治療效果。MEBO組方均為傳統(tǒng)中醫(yī)中藥，MEBT/MEBO由MEBO發(fā)展而來，其以MEBO為主要的治療藥物，中醫(yī)機制上采用MEBT為治則，簡稱MEBT/MEBO，臨床上已經(jīng)有20余年的實踐歷史，被認為是中醫(yī)藥外治治療潰瘍創(chuàng)面的較好方法之一[9]。目前有多項臨床研究表明，MEBT/MEBO對糖尿病足創(chuàng)面的治療亦有較好的臨床效果[10-11]，本研究結(jié)果顯示，采用MEBT/MEBO治療糖尿病足創(chuàng)面，創(chuàng)面面積明顯縮小，顯效率達35%，有效率達62.5%，再次證實了MEBT/MEBO對糖尿病足創(chuàng)面的較好療效。

作為MAPK類激酶，已有研究表明，ERK1/2和p38信號通路在傷口創(chuàng)面修復中起著較為關(guān)鍵的作用[3-4]，同時研究表明抑制p38及ERK1/2信號通路或者過度激活p38信號通路可以致使創(chuàng)面愈合時間延遲或?qū)е掠虾篑：坌纬蒣12-13]。還有研究表明，ERK1/2及p38可發(fā)生交互作用，致使c-myc、Akt及ATF2(下游重要目標分子)被調(diào)控，進一步對潰瘍創(chuàng)面愈合的生理過程發(fā)揮調(diào)控作用[14]。從免疫學機制上得知，免疫在維持機體健康和穩(wěn)定過程中發(fā)揮著重要的防御及保護作用，糖尿病足形成是一種機體健康組織受破壞的生理過程，在糖尿病患者足部受到外來感染等不良侵蝕時，機體可通過增強局部免疫，清除局部壞死腐敗組織，維護健康組織的穩(wěn)定，從而參與潰瘍創(chuàng)面的修復過程。本研究顯示，經(jīng)MEBT/MEBO治療后，創(chuàng)面組織ERK1/2和p38信號通路關(guān)鍵分子ERK1/2、p38、MAPKK6、c-myc、Akt、ATF2陽性表達明顯升高，且與此同時，免疫因子IgA、IgM、IgG、C3c、C4c的陽性表達率亦明顯上升，表明MEBT/MEBO可能促進了糖尿病足創(chuàng)面ERK1/2和p38信號通路分子及免疫表達，ERK1/2和p38信號通路及其交互作用可能通過增加創(chuàng)面組織免疫表達而促進了糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的愈合。

受醫(yī)學倫理及科研條件所限，尚還無法建立空白對照組進行對比研究，ERK1/2和p38信號通路的研究還沒有足夠深入，研究缺陷擬在后續(xù)建立動物模型研究中進一步深入探討及完善。

[1]王學偉．生肌膏治療糖尿病足的療效觀察[J]．中醫(yī)藥學報，2013，41(1)：114-115．

[2]YangWY,LuJM,WengJP,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina[J].NEnglJMed,2010,362(12):1090-1101.

[3]LoughlinDT,ArtlettCM.Modificationofcollagenby3-deoxyglucosonealterswoundhealingthroughdifferentialregulationofp38MAPkinase[J].PLoSOne,2011,6(5):e18676.

[4]ChiuWC,LinJY,LeeTS,etal.β-glycoproteinIinhibitsVEGF-inducedendothelialcellgrowthandmigrationviasuppressingphosphorylationofVEGFR2,ERK1/2,andAkt[J].MolCellBiochem,2013,372(1/2):9-15.

[5]陳灝珠，鐘南山，陸再英．內(nèi)科學[M]．8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：739．

[6]OliveiraAF,DeMarchiAC,LeguisamoCP,etal.Estimateofcostfordiabeticfoottreatment;howtopreventitandsavefunds[J].CienSaudeColet,2014,19(6):1663-1671.

[7]HassanMI,HammadKM,FoudaMA,etal.TheusingofLuciliacuprinamaggotsinthetreatmentofdiabeticfootwounds[J].JEgyptSocParasitol,2014,44(1):125-129.

[8]FüesslHS.Fulminantinfectionindiabeticfootsyndrome[J].MMWFortschrMed,2014,156(7):34.

[9]盧棟，郭璐，唐乾利，等．MEBT/MEBO治療慢性難愈合創(chuàng)面60例臨床療效觀察[J]．中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2010，22(5)：346-350．

[10]李杰輝，張力，唐乾利，等．濕潤燒傷膏治療神經(jīng)性潰瘍臨床療效觀察[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2012，39(6)：1095-1096．

[11]唐乾利，韓珊珊，付軍，等．MEBT/MEBO對皮膚創(chuàng)面愈合過程中VEGF、bFGF、EGFmRNA表達影響的研究[J]．右江民族醫(yī)學院學報，2012，34(5)：597-601．

[12]ChenWL,LinCT,LiJW,etal.ERK1/2activationregulatesthewoundhealingprocessofrabbitcornealendothelialcells[J].CurrEyeRes,2009,34(2):103-111.

[13]HuhJE,NamDW,BaekYH,etal.Formononetinaccelerateswoundrepairbytheregulationofearlygrowthresponsefactor-1transcriptionfactorthroughthephosphorylationoftheERKandp38MAPKpathways[J].IntImmunopharmacol,2011,11(1):46-54.

[14]ChiacchieraF,GrossiV,CappellariM,etal.Blockingp38/ERKcrosstalkaffectscolorectalcancergrowthbyinducingapoptosisinvitroandinpreclinicalmousemodels[J].CancerLett,2012,324(1):98-108.

The relationship between ERK1/2 and p38 signaling pathway with the immune expression of diabetic based on MEBT/MEBO*

WuBiaoliang1，TangQianli2△，QinXiaojie3▲,FengLie4,WangMingdeng1,HEMingjie1,LvZhen5

(1.DepartmentofEndocrine,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalitis，Baise,Guangxi533000，China;2.DepartmentofSurgery,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalitis，Baise,Guangxi533000，China;3.DepartmentofICU,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalitis，Baise,Guangxi533000，China;4.DepartmentofEndocrine,theFirstClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Guanzhou,Guangdong510632,China;5.DepartmentofSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning,Guangxi530023,China)

Objective To investigate the regulation on extracellular signal regulated kinase(ERK)1/2 and p38 signaling pathways and immune expression by moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment(MEBT/MEBO)in diabetic foot and their relationship,to explore the repair mechanism of MEBT/MEBO on diabetic foot ulcers.Methods Totally 40 diabetic foot patients were treated by MEBT/MEBO,to take wound tissue before and after treatment and detect the expression of ERK1/2,p38,MAPKK6,c-myc,Akt,ATF2,IgA,IgM,IgG,C3c and C4c by immunohistochemistry,to investigate their relationship.Results After treatment with MEBT/MEBO,the area of foot wounds in 39 patients was reduced in different degree.Only one patient had no obvious change.14 patients(35.00%) were markedly effective,25 patients(62.50%) and 1 patient(2.50%) were ineffective.Before and after treatment, all positive expression, positive immunoreactivity(any index) and positive expression(specific index) of signal pathway molecules were statistically significant(P<0.05).While the positive rate of molecular expression in wound pathway increased,the positive expression rate of immune factor increased.Before treatment,a small amount of immune factors were found in the wound tissue.After treatment, the immune factors IgA,IgM,IgG,C3c,C4c were distributed widely and diffusely.Before treatment,the wound tissue showed a very small number of signal molecules.After treatment, the signal pathway molecules MEBT/MEBO and p38,MAPKK6,c-myc,Akt,ATF2 showed broad and diffuse distribution.Conclusion MEBT/MEBO may promote the expression of ERK1/2 and p38 signaling molecules and immune in diabetic foot,p38 and ERK1/2 signaling pathway may promote the healing of diabetic foot wound by increasing the expression of immune.

diabetic foot;burn skin regenerative medical technique;extracellular signal regulated kinase1/2;p38;immune

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.009

國家自然科學基金資助項目(81360547)；2013年廣西自然科學基金重點項目(2013GXNSFDA019020)。 作者簡介：吳標良(1978-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事內(nèi)分泌代謝性疾病研究?！?/p>

E-mail：htmgx@163.com?！ㄓ嵶髡?，E-mail：yyqinxj@163.com。

吳標良1，唐乾利2△，覃曉潔3▲，馮 烈4，王民登1，何明杰1，呂 震5

(1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院外科，廣西百色 533000；3.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣西百色 533000；4.暨南大學第一臨床醫(yī)學院內(nèi)分泌科，廣州 510632；5.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院外科,南寧 530023)

R

A

1671-8348(2016)36-5069-03

2016-07-16

2016-10-03)