栗木水解單寧對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用及對(duì)壞死性腸炎腸道損傷的影響

■劉 洋 張亞峰 張 宇

(廣州施華科技有限公司，廣東廣州 510800)

隨著抗生素在全球范圍內(nèi)的限用，雞壞死性腸炎的發(fā)病率明顯升高，造成養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)，通過(guò)雞肉制品引起人感染，也給人類食品安全提出嚴(yán)峻的考驗(yàn)。因此開(kāi)發(fā)利用天然物質(zhì)替代抗生素就成為近年的熱點(diǎn)之一。

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens),又稱韋氏梭菌(Clostridium welchii),是一種梭狀芽孢菌屬條件性致病菌,在自然界分布非常廣,可引起各種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥,同時(shí)也是人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽及人類食物中毒的主要病原菌之一。該菌分為A、B、C、D、E 5個(gè)型，通常A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起家禽的壞死性腸炎。

壞死性腸炎是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種條件性疾病，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的小腸黏膜壞死，從而導(dǎo)致家禽急性死亡和高死亡率，對(duì)全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。研究表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌正常情況下棲息于畜禽盲腸，不會(huì)引起發(fā)病，但當(dāng)腸黏膜受到損傷或腸道菌群發(fā)生變化時(shí)，它就會(huì)在消化道前段大量增殖，從而導(dǎo)致壞死性腸炎的發(fā)生。

單寧酸是一種水溶性多酚混合物，分子量在500～3 000之間。盡管幾乎所有植物都含有少量的單寧酸,但根據(jù)不同分子量、植物源種類、植物年份、生長(zhǎng)地理位置、提取工藝、不同來(lái)源，并不是所有單寧酸都可以被動(dòng)物消化及利用。單寧酸的應(yīng)用也是多方面的，涵蓋了皮革、食品、釀酒和精細(xì)化工等，在歐洲通過(guò)長(zhǎng)期深入的研究發(fā)現(xiàn)單寧酸在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的良好效果，使其在飼料添加劑方面得到廣泛的應(yīng)用。意大利施華公司生產(chǎn)的栗木水解單寧提取的單寧酸有很強(qiáng)的收斂、抗氧化效果，高效抑菌和殺滅病毒作用，有效的抑制許多植物源和動(dòng)物源病原體，從而提高了動(dòng)物體的健康水平及食品的安全程度，也得到的良好的投入回報(bào)率。

本文旨在探討栗木水解單寧對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌體外抑制作用的試驗(yàn)驗(yàn)證，并進(jìn)一步證明栗木水解單寧對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中由產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的壞死性腸炎腸道疾病問(wèn)題的改善作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 栗木水解單寧

試驗(yàn)用栗木水解單寧產(chǎn)自意大利施華公司，提取來(lái)源為意大利北部公司自有的栗木森林，主要成分單寧酸含量75%以上。

1.1.2 指示菌

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌株A是在隨機(jī)抽取健康動(dòng)物的糞便中提取。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株D來(lái)自于隨機(jī)抽取患有腸道疾病動(dòng)物的糞便中提取。

1.1.3 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基、庖肉培養(yǎng)基、厭氧蛋白胨水、增菌厭氧湯。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

糞便樣品采集：在試驗(yàn)地區(qū)每個(gè)雞場(chǎng)分別隨機(jī)采集健康和患有腸道疾病雞的新鮮糞便各20份。共采集新鮮糞便200份。新鮮樣品采集后放入樣品采集袋中，再將采集袋放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室待檢。

動(dòng)物腸道采集：對(duì)15日齡的家禽試驗(yàn)動(dòng)物飼喂添加0.05%栗木單寧，分別在19日和30日進(jìn)行安樂(lè)死后，并對(duì)其解剖檢測(cè)腸道（小腸、空腸和回腸）的損傷狀況。取各部腸道4 cm，縱向剖開(kāi)，用冰凍生理鹽水清洗多次，觀察后切成1 cm長(zhǎng)小段，用錫箔紙包裹迅速放入液氮中，速凍后取出放-70℃凍存。

1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)

試驗(yàn)前一晚將產(chǎn)氣莢膜梭菌置于皰肉培養(yǎng)基(CMM)培養(yǎng)，使菌株培養(yǎng)在皰肉培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)后置于滅菌離心管內(nèi)于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行倍比稀釋

每次取1 ml菌液進(jìn)行稀釋，使用10 ml高壓滅菌后的離心管，用滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，每次稀釋10倍。

1.2.4 體外抑菌分析

將分離保存的產(chǎn)氣莢膜梭菌稀釋液（0.1 ml）在皰肉培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h進(jìn)行復(fù)蘇備用。取復(fù)蘇后的稀釋液在添有栗木單寧（0.1 mg/ml）的瓊脂板上培養(yǎng)18 h后菌落開(kāi)始生長(zhǎng)并開(kāi)始計(jì)數(shù)。

1.2.5 栗木單寧的殺菌分析

栗木單寧對(duì)于菌株生長(zhǎng)的作用取決于不同的濃度。產(chǎn)氣莢膜梭菌經(jīng)過(guò)一晚的培養(yǎng)后，接種0.2 ml到瓊脂板培養(yǎng)基。對(duì)比分析產(chǎn)氣莢膜梭菌A（提取于健康動(dòng)物）和D（提取于患有腸道疾病動(dòng)物），在含有栗木單寧溶液的培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)。用無(wú)栗木單寧溶液的皰肉培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每組兩個(gè)重復(fù)。然后定時(shí)對(duì)比試驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)菌濃度。

1.2.6 栗木單寧最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

將栗木單寧進(jìn)行一系列的稀釋處理，在厭氧條件下將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種到混有不同濃度的栗木單寧的皰肉培養(yǎng)基試管中，在37℃中培養(yǎng)12 h，通過(guò)對(duì)試管進(jìn)行肉眼觀察，是否變渾濁有細(xì)菌生長(zhǎng)。通過(guò)是否在不同濃度培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)判斷栗木單寧是否對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用，從而根據(jù)哪個(gè)濃度培養(yǎng)基有細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)判斷最小抑菌濃度（MIC）。10個(gè)試管中的栗木單寧濃度分別為0、0.000 5、0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 栗木單寧抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低濃度(見(jiàn)表1)

表1 栗木單寧最低的抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的濃度

通過(guò)對(duì)比分析，由表1可知栗木單寧可抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌A和D的作用。當(dāng)栗木單寧的濃度在0.003～0.15 mg/ml時(shí)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A和D產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)栗木單寧的濃度在0.01 mg/ml開(kāi)始對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌A起抑制作用，當(dāng)栗木單寧的濃度在0.003 mg/kg開(kāi)始對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌D起抑制作用，產(chǎn)氣莢膜梭菌D對(duì)于栗木單寧的敏感程度強(qiáng)于產(chǎn)氣莢膜梭菌A。

2.2 栗木單寧對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用(見(jiàn)圖1)

圖1 不同濃度的栗木單寧對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素活性的影響

栗木單寧對(duì)于分離自健康動(dòng)物的產(chǎn)氣莢膜梭菌A和分離自患有腸道疾病的動(dòng)物的產(chǎn)氣莢膜梭菌D毒素活性的影響做了對(duì)比。隨著栗木單寧濃度增加，兩種菌株的毒素活性明顯降低了。栗木單寧濃度為0.2 mg/ml可有效減少產(chǎn)氣莢膜梭菌A50%的毒素活性，濃度為0.3 mg/ml時(shí)可減少產(chǎn)氣莢膜梭菌D50%毒素活性。因此，栗木單寧到達(dá)一定濃度時(shí)，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌起到有效的抑制作用。

2.3 栗木單寧的殺菌活性(見(jiàn)圖2)

圖2 栗木單寧（Nutri.P）對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌A和D的殺菌活性影響作用

栗木單寧在抑制提取自健康動(dòng)物的產(chǎn)氣莢膜梭菌A和提取自患有腸道疾病的動(dòng)物的產(chǎn)氣莢膜梭菌D活性方面都表現(xiàn)出了明顯的作用。由圖2可知，使用栗木單寧殺菌0.5 h后就在產(chǎn)氣莢膜梭菌D上面有明顯體現(xiàn)，在使用2～4 h后殺菌效果體現(xiàn)在產(chǎn)氣莢膜梭菌A上面。在5 h之后，就可以看到在兩種菌株上，栗木單寧完全體現(xiàn)了殺菌活性的效果。

2.4 栗木單寧對(duì)于壞死性腸炎攻毒狀況下的腸道損傷的影響（見(jiàn)圖3）

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小腸、空腸和回腸的損傷評(píng)分明顯高于試驗(yàn)組。對(duì)照組小腸、空腸和回腸的損傷頻率也明顯高于試驗(yàn)組。所以添加栗木單寧對(duì)于因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌造成的壞死性腸炎對(duì)于腸道損傷的改善效果非常顯著。

圖3 栗木單寧對(duì)于壞死性腸炎攻毒狀況下的腸道損傷的影響

2.5 栗木單寧對(duì)于壞死性腸炎攻毒狀況下肉禽增重的影響(見(jiàn)圖4)

圖4 栗木單寧對(duì)于壞死性腸炎攻毒狀況下肉禽增重的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)5 d內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)組的增重會(huì)略低于對(duì)照組，但在9 d后慢慢上升直到14 d時(shí)試驗(yàn)組的增重明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明添加栗木單寧對(duì)于通過(guò)改善因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌造成的壞死性腸炎對(duì)于腸道損傷的影響可以明顯提升動(dòng)物的生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)說(shuō)明栗木單寧對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)速率有明顯的抑制作用，降低了由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的壞死性腸炎對(duì)腸道的影響，對(duì)提高家禽的增重隨時(shí)間的增加有顯著效果。試驗(yàn)所用栗木水解單寧是一種水溶性天然植物提取物，成分包括水解單寧酸、糖、纖維素、半纖維素及一些有機(jī)鹽等，具有收斂性，可調(diào)控腸道蠕動(dòng)，提升消化酶的活性和日糧在腸道中的消化利用率，能有效地改善腸道健康，抑制病毒以及有害菌的繁殖，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，是很好的抗生素替代產(chǎn)品。