發(fā)酵豆粕產(chǎn)品質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)

■朱 滔 黃小燕 王根虎

（上海亙泰實(shí)業(yè)集團(tuán)，上海201615）

豆粕是世界上應(yīng)用最為廣泛的植物蛋白原料，其具有蛋白含量高、氨基酸較為平衡、動(dòng)物消化吸收利用好等優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物飼料中廣泛使用。然而在使用豆粕飼喂幼齡動(dòng)物時(shí)，其中殘留的抗?fàn)I養(yǎng)因子可以引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)[1]。特別是在仔豬斷奶過程中，由于受到多種應(yīng)激因素的影響，導(dǎo)致斷奶仔豬綜合征，降低養(yǎng)殖效益。豆粕中存在的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子包括抗原蛋白、寡糖、胰蛋白酶抑制因子、脲酶[2]。因此通過技術(shù)手段降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量是提高豆粕應(yīng)用價(jià)值的重要手段。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)高質(zhì)量發(fā)酵豆粕[3]，既可以減少豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，還可以提高飼料適口性，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，受到飼料廠的廣泛歡迎。然而市場(chǎng)上發(fā)酵豆粕產(chǎn)品眾多，品質(zhì)不一，產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)十分重要。因此本文簡(jiǎn)介了如何綜合評(píng)估發(fā)酵豆粕質(zhì)量，以期為選擇合適的發(fā)酵豆粕提供理論依據(jù)。

1 大豆蛋白質(zhì)的組成和溶解性

1.1 大豆蛋白質(zhì)的組成

大豆蛋白質(zhì)的組成及其特性見表1。大豆蛋白質(zhì)主要由球蛋白組成，占總蛋白含量的90%以上，其余還含有部分清蛋白，占總蛋白的含量?jī)H為5%左右。大豆球蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)沉降系數(shù)分類，可分為4個(gè)組分，即2S、7S、11S、15S[4]。其中 15S組分為多聚體大豆球蛋白，占球蛋白總量的9.1%左右。11S組分為大豆球蛋白，占球蛋白總量的41.9%。7S組分占總球蛋白的34.0%左右，包括β-伴大豆球蛋白（占總球蛋白30%左右）、γ-伴大豆球蛋白、α-淀粉酶、脂肪氧化酶、凝集素[5]。2S組分包括α-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、細(xì)胞色素，占總球蛋白含量約15.0%。

表1 大豆中蛋白質(zhì)的組成

1.2 大豆蛋白質(zhì)的溶解性

蛋白質(zhì)是有機(jī)大分子化合物，在水中以分散狀態(tài)存在，其在水中的融溶量稱為蛋白質(zhì)的溶解度。由于溶解度特性對(duì)大豆蛋白質(zhì)的提取、分離和純化影響非常大，所以大豆蛋白質(zhì)的溶解度大小在實(shí)際應(yīng)用中非常重要。同時(shí)大豆熱加工中蛋白質(zhì)變性的程度也可以通過蛋白溶解度的變化來評(píng)判。

大豆蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為4.2～4.6之間，其在水溶液pH值為等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，隨著水溶液pH值的提高或降低蛋白質(zhì)溶解度急劇增長(zhǎng)[6]。圖1為溶液pH值對(duì)大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響。

從圖1可以看出，當(dāng)溶液pH值在大豆蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)（pH4.2左右），蛋白溶解度最低，只有8%左右，溶解的可能為非蛋白氮及清蛋白。隨著pH值的提高，大豆蛋白的溶解度快速提高，在溶液pH值提高到12以上時(shí)，大豆蛋白的溶解度提高至95%以上。大豆蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度不僅受到pH值的影響，熱加工、水溫、水溶液中鹽離子的含量等都會(huì)影響溶解度。

圖1 不同酸堿處理及pH值對(duì)大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響[7]

2 發(fā)酵豆粕的性質(zhì)

發(fā)酵豆粕是以大豆粕為主要原料（≥95%），以麩皮、玉米皮等為輔助原料，使用農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》中批準(zhǔn)使用的微生物菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并經(jīng)干燥制成的蛋白質(zhì)飼料原料產(chǎn)品。從2013年開始實(shí)施的中國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2218-2012規(guī)定的發(fā)酵豆粕技術(shù)指標(biāo)包括：水分≤12.0%、粗蛋白質(zhì)≥45.0%、粗纖維≤5.0%、粗灰分≤7%、尿素酶活性≤0.1 U/g、酸溶蛋白（占蛋白含量）≥8.0%、賴氨酸≥2.5%、水蘇糖≤1.0%[8]。此行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)主要目的是規(guī)范市場(chǎng)，防止假發(fā)酵豆粕進(jìn)入市場(chǎng)。但是僅僅這些指標(biāo)并不能合理評(píng)估不同發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的價(jià)值。

發(fā)酵工藝對(duì)豆粕整體品質(zhì)的影響包括以下4方面：①微生物分泌的酶將大分子物質(zhì)降解為小分子（包括不良寡糖的降解、大分子蛋白降解為小分子肽鏈）；②微生物利用碳水化合物無氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸；③固體發(fā)酵時(shí)水分一般為30%～50%，發(fā)酵完成后將產(chǎn)品干燥，水分控制在5%～10%；④有些廠家在豆粕發(fā)酵前，有蒸煮消毒的前處理工藝。

從發(fā)酵豆粕降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子出發(fā)，國(guó)家制定了發(fā)酵豆粕的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但是卻很少考慮到整個(gè)發(fā)酵工藝對(duì)豆粕質(zhì)量的影響，特別是干燥和/或蒸煮對(duì)豆粕氨基酸利用率的影響。由于過度熱加工對(duì)于豆粕氨基酸的利用率影響很大，因此發(fā)酵豆粕中沿用了豆粕質(zhì)量評(píng)價(jià)體系中的蛋白溶解度這一指標(biāo)，用于衡量豆粕在發(fā)酵過程中是否被過度熱處理。表2、表3表示豆粕和發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)及氨基酸的消化率。

表2 普通豆粕、發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成(%)[9]

表3 普通豆粕、發(fā)酵豆粕的氨基酸含量及其消化率(%)

從表2、表3中可以看出，發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（如粗蛋白、氨基酸含量），顯著高于普通豆粕。但是從日糧配制角度上來說，發(fā)酵豆粕賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸回腸末端標(biāo)準(zhǔn)消化率較浸提豆粕降低了14.77%、12.05%、1.12%，而氨基酸平均消化率從豆粕的87.39%降低至81.11%，平均降低7.19%。據(jù)分析，發(fā)酵豆粕氨基酸消化率降低的原因可能是其在生產(chǎn)過程中受到過度熱加工（蒸煮和/或干燥）的影響，降低了氨基酸的利用率。因此有必要在原有評(píng)估體系中增加對(duì)于熱加工程度的評(píng)估。

3 發(fā)酵豆粕評(píng)估體系

由上分析所知發(fā)酵豆粕的評(píng)估主要分為兩方面：①發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解程度；②發(fā)酵豆粕蛋白受熱加工的影響程度?，F(xiàn)階段行業(yè)內(nèi)用的比較多的主要指標(biāo)有：抗原蛋白、酸溶蛋白、不良寡糖、乳酸含量、蛋白溶解度。其中抗原蛋白和不良寡糖是直接表明抗?fàn)I養(yǎng)因子消除情況，而酸溶蛋白、乳酸含量主要用來判斷發(fā)酵是否充分的兩個(gè)指標(biāo)，蛋白溶解度是指發(fā)酵豆粕是否加熱過度的指標(biāo)。一些飼料廠在使用時(shí)只注重某一項(xiàng)指標(biāo)，比如說抗原蛋白，但是卻忽略了發(fā)酵豆粕的整體質(zhì)量評(píng)估。我們認(rèn)為需要對(duì)發(fā)酵豆粕的質(zhì)量進(jìn)行綜合判斷，改進(jìn)現(xiàn)有檢測(cè)方法，準(zhǔn)確的評(píng)估發(fā)酵豆粕質(zhì)量。

楊玉娟等(2016)和周天驕等(2015)對(duì)總共308個(gè)不同豆粕和發(fā)酵豆粕樣品中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的檢測(cè)結(jié)果（見表4）。從表4中可以看出，不同豆粕樣品和發(fā)酵豆粕樣品的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量差異非常大。楊玉娟等（2016）的檢測(cè)結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖的含量平均值分別為 54.7、37.6、7.5、1.93、5.19 mg/g，較豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量有明顯下降，但是不同發(fā)酵豆粕之間變異非常大，表現(xiàn)在大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖的變異系數(shù)分別為77.7%、95.2%、101.3%、169.4%、150.9%。這兩篇論文表明不同發(fā)酵豆粕對(duì)于抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除率相差很大，因此有必要對(duì)不同發(fā)酵豆粕的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中的蒸煮和干燥等濕熱處理工藝可以使蛋白質(zhì)變性（李巖濤，2013），蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)被破壞，二硫鍵斷裂，肽鏈展開，包埋的疏水基團(tuán)開始暴露，并且與其它化合物的基團(tuán)形成分子間或分子內(nèi)的結(jié)合鍵，從而降低其蛋白溶解度[12]。更為重要的是高溫能使氨基酸的氨基和還原性碳水化合物起反應(yīng)（美拉德反應(yīng)），降低氨基酸的含量和利用率。在所有氨基酸中賴氨酸是最容易發(fā)生美拉德反應(yīng)的氨基酸，其暴露在外的ε-氨基能與還原糖的羧基相結(jié)合。除賴氨酸外，蛋白質(zhì)分子中的其它氨基酸（如精氨酸、組氨酸和色氨酸）也會(huì)受熱加工過度的影響，可以與氨基酸發(fā)生反應(yīng)的還原性化合物還包括醛和酮。美拉德反應(yīng)的后期，會(huì)形成褐色素或類黑素，這也是豆粕經(jīng)過過熱加工后顏色變深的由來。美拉德反應(yīng)程度取決于水分活度、溫度、pH值、加熱時(shí)間，以及底物的種類和可利用程度[13-14]。因此發(fā)酵豆粕受熱損傷的程度可以通過產(chǎn)品顏色、蛋白溶解度、賴氨酸/粗蛋白比值來進(jìn)行綜合評(píng)估。

表4 豆粕與發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量（mg/g）

3.1 發(fā)酵豆粕蛋白溶解度的檢測(cè)

蛋白在溶液中的溶解基本上是所有檢測(cè)手段的前處理方法，因此有必要在檢測(cè)之前，對(duì)蛋白的溶解度有著深入的了解，才能全面認(rèn)識(shí)發(fā)酵豆粕的評(píng)估體系。豆粕中蛋白溶解度、酸溶蛋白以及抗原蛋白檢測(cè)的原理都與大豆蛋白的等電點(diǎn)以及其溶解性高度相關(guān)。大豆蛋白在溶液中的溶解性是檢測(cè)任何指標(biāo)的先決條件。因?yàn)榇蠓肿拥鞍自诘入婞c(diǎn)下溶解度最低而小分子蛋白可以在此pH值溶液中溶解，從而將大分子蛋白沉淀下來，將水溶液中粗蛋白含量認(rèn)定為發(fā)酵豆粕中小肽含量，因此也稱為酸溶蛋白。

測(cè)定豆粕蛋白溶解度所用的溶液為0.2%氫氧化鉀，溶液pH值為12.5，在此條件下大豆的蛋白溶解度在95%左右，而大豆經(jīng)過浸提或壓榨、烘干等熱加工過程后，由于蛋白質(zhì)變性和美拉德反應(yīng)，豆粕的蛋白溶解度降低至70%～85%。豆粕經(jīng)過發(fā)酵后有3大變化：①乳酸的產(chǎn)生；②大分子蛋白的降解；③烘干；這三個(gè)因素都會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵豆粕蛋白溶解度的變化：①發(fā)酵豆粕中酸的存在會(huì)與氫氧化鉀中和，降低溶液的pH值，從而降低蛋白溶解度。方華等（2014）的研究表明，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的2%～4%的有機(jī)酸可以導(dǎo)致蛋白溶解度檢測(cè)值偏低10%～15%；②大分子蛋白降解為小分子蛋白（酸溶蛋白）后，小分子蛋白在堿性環(huán)境條件下溶解度也有下降，見圖2；③隨著烘干溫度的升高和時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵豆粕蛋白溶解度隨之降低。

發(fā)酵豆粕檢測(cè)蛋白溶解度的目的是確認(rèn)熱加工的程度，防止過度烘干，影響發(fā)酵豆粕中氨基酸的消化率。但是因?yàn)槿樗嵋约八崛艿鞍子绊懙鞍兹芙舛?，并且不同廠家發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中乳酸和酸溶蛋白含量完全不同，所以在檢測(cè)發(fā)酵豆粕蛋白溶解度時(shí)，需要改善檢測(cè)方法，消除乳酸及酸溶蛋白對(duì)蛋白溶解度檢測(cè)的影響。從而使蛋白溶解度成為反應(yīng)發(fā)酵豆粕受熱加工影響程度的一項(xiàng)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

豆粕的蛋白溶解度控制在70%～85%之間，近年來隨著油脂加工技術(shù)的改進(jìn)，豆粕的蛋白溶解度有提高的趨勢(shì)。方華等（2014）[15]的研究表明，發(fā)酵過程中蒸煮溫度超過100℃、干燥溫度超過60℃，對(duì)發(fā)酵豆粕的蛋白溶解度影響巨大[15]。結(jié)合實(shí)際檢測(cè)數(shù)據(jù)，我們建議發(fā)酵豆粕蛋白溶解度最好高于70%，最低不低于65%。

3.2 發(fā)酵豆粕抗原蛋白的檢測(cè)

大豆中的抗原蛋白有很多，目前研究比較充分的大豆抗原蛋白主要有大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，其沉降系數(shù)分別為11S和7S，分別占大豆總蛋白的36%和27%左右。而根據(jù)免疫反應(yīng)活性，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別占40%和27.9%左右[17]。因此我們現(xiàn)階段的主要手段就是通過檢測(cè)大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量，間接推斷發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的降解程度。大豆中除大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白外，還有其它的抗原蛋白存在。此外，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的不同亞基致敏能力也不同。Ogawa等（1995）[18]和Fu等（2007）[19]研究表明，β-伴大豆球蛋白的α亞基是大豆致敏蛋白中最重要的一種，而α亞基和β亞基并不是致敏蛋白。大豆球蛋白的總體致敏能力低于7S蛋白。研究表明，11S球蛋白的酸性多肽亞基均為過敏蛋白，而堿性多肽很少與大豆過敏患者血清產(chǎn)生免疫反應(yīng)[20]。

圖2 不同pH值下大豆分離蛋白和大豆水解蛋白的溶解度[16]

加工處理能影響大豆蛋白的致敏性。龍國(guó)徽（2015）的研究表明，120℃濕熱處理能顯著改變大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)，引發(fā)其免疫活性的變化，并且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性更好，結(jié)構(gòu)不易破壞[21]。

在此背景下，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）通過制備抗大豆主要抗原蛋白抗體，建立抗原蛋白定量測(cè)定方法，具有高度專一、高靈敏性等優(yōu)點(diǎn)，近年來是抗原蛋白檢測(cè)的主要手段。ELISA法檢測(cè)抗原蛋白，第一步是將蛋白用提取液進(jìn)行提取，通常提取液的pH值都在堿性偏中性?？紤]到發(fā)酵豆粕一般偏酸性，提取時(shí)溶液pH值可能偏低。并且發(fā)酵豆粕0.2%KOH溶解度低于豆粕，好的發(fā)酵豆粕溶解度在70%左右，很多發(fā)酵豆粕甚至只有50%～60%?？紤]到如上兩個(gè)影響因素，檢測(cè)時(shí)提取出來的蛋白含量可能更低，只有50%不到。在此條件下檢測(cè)出來的抗原蛋白含量?jī)H供參考，只能從一定程度上用來評(píng)估不同發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的質(zhì)量。

發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的降解、蛋白溶解度的降低、產(chǎn)品中的有機(jī)酸都能導(dǎo)致抗原蛋白檢測(cè)結(jié)果低。SDS-page法蛋白條帶顏色淺、ELISA法定量檢測(cè)值低都只能說明提取出來的抗原蛋白含量低，并不能完全說明抗原蛋白已經(jīng)被降解。將抗原蛋白作為準(zhǔn)確反映發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)量的指標(biāo)需要改善檢測(cè)方法（消除酸和熱加工對(duì)溶解度的影響），提高蛋白質(zhì)在緩沖液中的溶解度，充分將發(fā)酵豆粕中的蛋白（特別是大分子蛋白）提取出來。

SDS-PAGE法檢測(cè)抗原蛋白的第一步與ELISA方法相同，都是將發(fā)酵豆粕中的蛋白提取出來。檢測(cè)方法中存在的問題也與ELISA法相同。但是不同的是加熱處理可以使大豆蛋白變性，變性后的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在聚丙烯酰胺凝膠上不能結(jié)合，通過電容檢測(cè)不到抗原蛋白的存在[22]。

3.3 發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白的檢測(cè)

發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白的檢測(cè)方法來源于大豆肽粉國(guó)標(biāo)GB/T 22492-2008[23]。主要原理是利用大豆中的大分子蛋白在酸性條件下易被沉淀，而分子量較小的蛋白質(zhì)（肽、游離氨基酸、非蛋白氮）可以溶于酸性溶液中。因此將樣品用三氯乙酸進(jìn)行處理，將大分子蛋白沉淀下來，檢測(cè)小分子蛋白的含量，以此為指標(biāo)表示豆粕中大分子蛋白的降解程度。然而與大豆肽粉不同的是，發(fā)酵豆粕中含有有機(jī)酸，可以降低溶液中的pH值，從圖1中可以看出來，大豆蛋白的溶解度在pH值低于等電點(diǎn)情況下的溶解度也會(huì)迅速增加。如果產(chǎn)品中有機(jī)酸含量不同，溶液的pH值也不同，對(duì)于酸溶蛋白的檢測(cè)結(jié)果也有影響。因此需要消除有機(jī)酸對(duì)溶液pH值的影響，再對(duì)發(fā)酵豆粕的酸溶蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。

3.4 其他反應(yīng)熱加工程度的指標(biāo)

熱加工對(duì)豆粕的影響可以表現(xiàn)在蛋白溶解度指標(biāo)的變化，但是隨著熱加工程度的逐漸加深，美拉德反應(yīng)的加重，豆粕的很多物質(zhì)（如賴氨酸）含量都會(huì)發(fā)生變化。豆粕受熱損傷，賴氨酸濃度降低，而粗蛋白的濃度不會(huì)發(fā)生變化。隨著熱加工程度的加深（溫度升高、時(shí)間延長(zhǎng)、高壓蒸汽的存在），豆粕中賴氨酸/粗蛋白比值隨之降低。González-Vega等（2015）的研究表明，隨著高壓蒸汽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，賴氨酸/粗蛋白比例從6.29%降低至5.57%[24]。并且Stein等(2009)[25]和Cozannet等（2010）[26]都報(bào)告了熱損傷DDGS中賴氨酸/粗蛋白比值的降低。因此可以通過計(jì)算賴氨酸/粗蛋白值來判斷發(fā)酵豆粕的熱損傷程度。從表2中可以計(jì)算浸提豆粕和發(fā)酵豆粕的賴氨酸/粗蛋白比值分別為6.29%和5.81%，說明發(fā)酵豆粕中熱損傷程度加深，這也與發(fā)酵豆粕氨基酸的消化率低于浸提豆粕的現(xiàn)象相吻合。此外還有報(bào)道表明，可以通過檢測(cè)糠氨酸的量來評(píng)估豆粕熱損傷程度（González-Vega等，2015）。

4 結(jié)語(yǔ)

綜合以上討論，發(fā)酵豆粕作為一種常見的原料，在市場(chǎng)上使用非常普遍，但是現(xiàn)有的檢測(cè)方法均來源于其它產(chǎn)品。發(fā)酵過程中豆粕產(chǎn)生了一系列的變化，包括蒸煮、大分子蛋白和寡糖的降解、酸的產(chǎn)生、進(jìn)一步干燥，使發(fā)酵豆粕明顯有別于其它大豆類產(chǎn)品。其它產(chǎn)品的檢測(cè)方法對(duì)于發(fā)酵豆粕來說并不是十分合適，需要對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行調(diào)整，以符合發(fā)酵豆粕的實(shí)際情況。在此結(jié)合實(shí)際情況，發(fā)酵豆粕的推薦評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白溶解度≥70%、酸溶蛋白（占蛋白比）≥20%、大豆球蛋白+β-伴大豆球蛋白≤10%、水蘇糖+棉籽糖≤1%、賴氨酸/粗蛋白≥6.0%。